Name: Rapid génotypage des animaux Suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Apprenez le génotypage rapide de souris nouveau-nées et la culture de neurones primaires sur couche de cellules gliales. Cette méthode fiable facilite l'étude des modèles murins létaux néonatalement.

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Les auteurs remercient les chercheurs de l’Université de l’Iowa, les Drs Luis Tecedor, Ines Martins et Beverly Davidson pour leurs instructions et leurs commentaires utiles concernant les cultures striatales, ainsi que les Drs Kara Gordon, Nicole Bode et Pedro Gonzalez-Alegre pour l’aide et les discussions sur le génotypage. Nous remercions également le Dr Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) pour ses commentaires utiles concernant le tatouage, et le Dr Shutaro Katsurabayashi (Université de Fukuoka) pour ses commentaires utiles concernant la culture de la souris. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Heart Association, du ministère de la Défense (prix du programme de recherche médicale évalué par les pairs W81XWH-14-1-0301), de la Fondation de recherche médicale sur la dystonie, de la Fondation Edward Mallinckrodt, Jr., de la National Science Foundation et de la Fondation Whitehall (N.C.H.).

L’auteur (Zhengmin Huang) est le président d’EZ BioResearch LLC qui produit les réactifs décrits dans cet article.

Le protocole présenté ici inclut des procédures pour le tatouage d&#39;étiqueter / identifier les souris, pour le génotypage des souris de conseils de la queue, et pour la culture de neurones du cerveau de la souris à faible densité. Dans une série d&#39;expériences utilisant 6-8 chiots, ces procédures exigent généralement ~ 0,5 h, ~ 4 h et ~ 2 heures, respectivement, à un total de 6-7 heures. Cela rend pratique pour une seule expérimentateur pour terminer toutes les procédures nécessaires à partir du moment de la naiss...

des modèles de rongeurs de maladies génétiques se sont révélés utiles dans l&#39;établissement des fonctions physiologiques normales de protéines et d&#39;acides nucléiques, ainsi que les conséquences pathophysiologiques de défauts de ceux-ci. Des exemples comprennent les souris déficientes pour des protéines impliquées dans des fonctions cellulaires clés, ainsi que des modèles murins de maladies telles que la maladie d&#39;Alzheimer. Cependant, certaines manipulations génétiques peuvent conduire à létalité néonatale peu ou quelques jours après la naissance. Dans ces cas, des cultures de cellules primaires sont un outil important parce que les cellules vivantes peuvent être obtenus auprès des chiots embryonnaires ou néonatales avant la mort, ils peuvent être conservés pendant au moins quelques semaines in vitro, et pendant ce temps le développement neuronal début peuvent être suivies par expériences biochimiques, morphologiques et fonctionnelles. Pour les cultures primaires, il peut être bénéfique à l&#39;assiette les neurones à faible densité; ce qui permet de visualiser le soma individuel, dendrites, arbres axonales et le nerf termisignaux à haute résolution spatiale. Toutefois, la survie et la différenciation des neurones à faible densité nécessite généralement qu&#39;ils sont étalées sur une couche nourricière gliale, co-cultivées avec des cellules gliales en l&#39;absence de contact physique avec eux, ou cultivées dans du milieu conditionné par des cellules gliales 1. L&#39;établissement de faible densité des cultures de neurones sur des couches nourricières gliales peut dépendre rapide et fiable génotypage préalable - dans un peu d&#39;heures à la différence de quelques jours. La vitesse est particulièrement importante lorsque le génotype neuronal doit être adaptée à celle d&#39;une couche d&#39;alimentation gliale préparé à l&#39;avance. A titre d&#39;exemple plus pratique, il peut être nécessaire de décider lequel des chiots qui génotype à utiliser dans des cultures de production, afin d&#39;optimiser l&#39;efficacité d&#39;une expérience. Ici, nous démontrons le protocole de travail qui a été utilisé pour le génotypage de la souris rapide, simplifiée et fiable dans les publications précédentes 2-6. Queues de souris etun kit disponible dans le commerce sont utilisés. Ce protocole comprend une seule étape d&#39;extraction d&#39;acides nucléiques à partir du tissu, et ne nécessite ni une étape de purification des acides nucléiques, ni l&#39;utilisation d&#39;un tampon de terminaison («stop solution&quot;). La fiabilité de cette méthode de génotypage est illustré en présentant les résultats d&#39;une série d&#39;essais lorsque des différences sont introduites par rapport à la quantité de départ des échantillons, l&#39;âge de l&#39;animal et la longueur des amplicons PCR. Ce kit offre les avantages de l&#39;extraction et la fiabilité automatisé. Par souci d&#39;être complet, l&#39;utilisation du tatouage d&#39;identification à long terme des souris génotypés est également démontrée. Le tatouage est réalisé par application d&#39;une encre de tatouage dans le derme de la peau (sous l&#39;épiderme) 7. Un procédé est décrit pour le tatouage les coussinets des pattes de souris nouveau-nés ou de vieux un jour, bien que les tatouages ​​peuvent être appliqués à d&#39;autres parties du corps, telles que les queues et les orteils, et animals de tous âges. En outre, les procédures seront montrées pour le placage et la culture de neurones de souris à une faible densité, sur la base de la préparation optimisée des différents types de couches nourricières gliales 2,8. On utilise un modèle de souris génétique du trouble neurologique héréditaire DYT1 dystonie - un trouble du mouvement autosomique dominante causée par une mutation dans le gène de TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La protéine codée, torsinA, fait partie des &quot;ATPases associées à diverses activités cellulaires&quot; (AAA +) de la famille des protéines, dont les membres accomplissent généralement des fonctions de chaperon, en aidant à: dépliement des protéines, la protéine complexe de démontage, le trafic membranaire, et la fusion des vésicules 10-13. Les résultats de mutation dans une délétion en cadre d&#39;un codon pour l&#39;acide glutamique, et peuvent conduire à la manifestation de «l&#39;apparition précoce de la dystonie généralisée isolé» 14,15. Cependant, la voieophysiological mécanismes responsables de cette maladie sont encore mal compris. Dans un modèle de souris knock-in, l&#39;allèle mutant est Tor1a tm2Wtd, mentionné ci-après comme Tor1a AE. Hétérozygote AE-torsinA souris knock-in sont des patients humains viables et génétiquement imitent avec DYT1 dystonie, alors homozygote souris knock-in meurent après la naissance 16,17, avec la latence à mort postnatale touchés par bagage génétique 18. La mort précoce de souris knock-in homozygote nécessite que tant l&#39;analyse génotypique des animaux et l&#39;établissement de cultures de neurones sont achevées rapidement. Comme autre exemple de génotypage, TFAP2A (facteur de transcription AP-2α, la protéine de liaison d&#39;activation activateur 2α) sera utilisée. La protéine codée par ce gène est important dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la survie et l&#39;apoptose 19.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS - Machine de</td><td></td><td></td><td></td>tatouage</tr><tr><td>Nettoyant</td> pour <td>animaux Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>Il est utilisé pour nettoyer les aiguilles et le support après le tatouage.</td></tr><tr><td>Machine à sécher</td><td>l’agent d’identification et de marquage des animaux, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>Il est utilisé pour sécher les aiguilles et le support après le nettoyage.</td></tr><tr><td>Tatouage néonatal pigment noir</td> Animal <td>Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur de préparation cutanée</td><td>Systèmes d’identification et de marquage des animaux, Inc.</td><td>Coton-tige</td> <td>NSPA1</td>.</tr><tr><td>Solution de préparation de la peau</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSP01</td><td>Ce réactif délivre une fine couche d’huile qui améliore l’efficacité du tatouage et empêche la décoloration du tatouage, en (information du fournisseur) : 1) en empêchant la peau non tatouée d’être colorée temporairement, permettant ainsi d’évaluer facilement la qualité d’un tatouage de coussinet de patte avant que le chiot ne soit renvoyé dans sa cage d’origine &ndash ; La surface de la peau tachée peut être confondue avec la peau tatouée, 2) réduire les dommages cutanés pendant le tatouage &ndash ; L’adoucissement de la peau et la lubrification de l’aiguille aideront l’aiguille à pénétrer dans la peau sans causer de dommages à la peau, et 3) empêcher l’oxygène moléculaire de pénétrer dans la peau, réduisant ainsi les réponses inflammatoires aux espèces réactives de l’oxygène qui peuvent être générées.</td></tr><tr><td>RÉACTIFS - génotypage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Kit (format tube bandelette)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Un colorant rouge de chargement pour l’électrophorèse est inclus dans la solution 2X PCR Ready Mix.</td></tr><tr><td>Solution de lyse tissulaire A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Préparez la solution d’extraction d’ADN en mélangeant 20 & micro ; l de la solution de lyse tissulaire A et 180 &micro ; l de la solution de lyse tissulaire B par échantillon.</td></tr><tr><td>Solution de lyse tissulaire B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Préparez la solution d’extraction d’ADN en mélangeant 20 & micro ; l de la solution de lyse tissulaire A et 180 &micro ; l de la solution de lyse tissulaire B par échantillon.</td></tr><tr><td>Acide acétique, glacial</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Agarose teneur optimisée, biologie moléculaire rpi</td><td></td><td>A20090-500&nbsp ;</td><td>Nous utilisons des gels d’agarose à 2 % dans un tampon TAE contenant le colorant de gel d’ADN SYBR Safe (dilué 10 000 fois) ou le bromure d’éthidium (0,5 & micro ; g/ml de volume de gel).</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique, sel disodique dihydraté (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette filtrées, sans aérosol, 0,1-10 & micro ; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG104-96RS&nbsp ;</td><td>Utilisez des pointes de pipette stériles et exemptes d’ADN, de RNase et de DNase. Pour toutes les étapes impliquant de l’ADN, utilisez des pointes de pipette filtrées pour éviter la contamination croisée.</td></tr><tr><td>pointes de pipette filtrées, pointes filtrantes de qualité supérieure, 0,5-20 et micro ; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Utilisez des pointes de pipette stériles et exemptes d’ADN, de RNase et de DNase. Pour toutes les étapes impliquant de l’ADN, utilisez des pointes de pipette filtrées pour éviter la contamination croisée.</td></tr><tr><td>pointes de pipette filtrées, pointes filtrantes haut de gamme, 1-200 & micro ; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Utilisez des pointes de pipette stériles et exemptes d’ADN, de RNase et de DNase. Pour toutes les étapes impliquant de l’ADN, utilisez des pointes de pipette filtrées pour éviter la contamination croisée.</td></tr><tr><td>Marqueur de poids moléculaire, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>Nous utilisons l’un de ces trois marqueurs de poids moléculaire.</td></tr><tr><td>Marqueur de poids moléculaire, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur de poids moléculaire, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR, bandes de 8 tubes avec capuchons supérieurs en forme de dôme fixés individuellement, naturel, 0,2 ml&nbsp ;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Utilisez des tubes stériles et exempts d’ADN, de RNase et de DNase. Une bande de 8 tubes est plus facile à manipuler et à regrouper les échantillons que les tubes individuels.</td></tr><tr><td>Tubes PCR, Ultraflux Individual&nbsp ;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Utiliser des tubes stériles et exempts d’ADN, de RNase et de DNase.</td></tr><tr><td>Tube microcentrifuge Seal-Rite 0,5 ml, naturel</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Utilisez des tubes stériles et exempts d’ADN, de RNase et de DNase.</td></tr><tr><td>SYBR Coloration sûre du gel d’ADN * Concentration 10 000x dans DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Amorces pour amplifier le gène Tor1a dans &Delta ; E-torsinA knock-in mices</td><td></td><td></td><td>5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (avant) et 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (marche arrière) (référence 18). Ces amorces ont été utilisées à une concentration finale de 1,0 ng/&micro ; l (~0,16 et micro ; M) (référence 2).</td></tr><tr><td>Amorces pour l’amplification du gène Tfap2a chez les souris</td><td></td><td></td> de type sauvage <td>5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (avant), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (inverse) pour l’amplicon de 498 pb, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (avant), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (inverse) pour l’amplicon de 983 pb, et 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (avant), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) pour l’amplicon de 1990-bp. Ces apprêts sont utilisés à 0,5 &micro ;M.</td></tr><tr><td>RÉACTIFS - culture</td><td></td><td></td><td></td>cellulaire</tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime ;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Voir la section des commentaires de l’uridine pour plus d’informations.</td></tr><tr><td>Supplément B-27</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire 35 boîtes de 10 mm,</td> BD <td>falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>de culture tissulaire traitées, T25, Traité pour culture tissulaire, à col incliné, bouchon à bouchon, 25 cm2 Surface de croissance, 70 ml</td><td>BD falcon</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire, T75, traitées pour culture tissulaire, col incliné, capuchon ventilé, 75 cm2 surface de croissance, 250 ml</td><td>BD falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>tube conique, polypropylène, 15 ml</td><td>BD falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Countess lames de chambre</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de cytosine &bêta ;-D-Arabinofuranoside (chlorhydrate d’Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydre, SigmaUltra, 99.5 % (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Plat, verre de Petri 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>La solution mère est préparée à 1 500 unités/20 & l = 75 000 unités/ml dans l’eau distillée.</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), teneur élevée en glucose, GlutaMAX, pyruvate</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010, unité de filtration rapide PES de 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>, 250 ml, membrane de 50 mm de diamètre, 0,2 & micro ; m Pore Size</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration PES rapide, 500 ml, membrane de 90 mm de diamètre, 0,2 & micro ; m Pore Size</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle en verre, 12 mm Ronde, épaisseur 0,09&ndash ; 0,12 mm, n° 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sels équilibrés de Hanks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, &ge ; 99.5 % (titrage)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique, 37 %, réactif A.C.S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO4&bull ;( 7H2O), BioUltra, &ge ; 99,5 % (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>Il s’agit du matériau de revêtement pour les lamelles et les flacons. 1) Pour le préparer, décongelez la solution Matrigel Basement Membrane Matrix sur de la glace, ce qui prend généralement ~1 jour. À l’aide d’une pipette pré-refroidie, aliquote la solution décongelée dans des flacons T25 pré-refroidis sur de la glace et conservez les flacons à -20 °C. Pour préparer la solution de travail du Matrigel, décongelez le Matrigel aliquotté dans un ballon sur de la glace, diluez-le 50 fois en ajoutant une solution MEM pré-refroidie et maintenez la solution diluée à 4 °C. Il est important de pré-refroidir tous les articles de culture et les milieux qui entrent en contact avec Matrigel, sauf pendant et après l’enrobage des lamelles, afin d’éviter qu’il ne forme prématurément un gel. 2) Pour enduire les lamelles en verre ou les flacons de culture avec du Matrigel, appliquez la solution de Matrigel sur la surface. Avant de plaquer les cellules, il est important de sécher complètement la surface. À cette fin, il peut être utile d’aspirer Matrigel pendant la centrifugation cellulaire immédiatement avant de plaquer les cellules et de laisser suffisamment de temps pour le séchage.</td></tr><tr><td>Milieu essentiel minimum (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Prolongateur de sérum MITO+, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Plaques multipuits, Plaque 24 puits traitée par culture tissulaire</td><td>BD falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Plaques multipuits, Plaque 6 puits traitée par culture tissulaire</td><td>BD falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal-A (1X), liquide</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Acide nitrique</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (Supplément neuronal) 21&nbsp ;</td><td>préparée en laboratoire</td><td></td><td>Source : référence 69</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur, 5 &frac34 ; &rdquo; &nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Utilisez ce 5 &frac34 ; &rdquo; Pipette Pasteur pour la trituration cellulaire. Polissez au feu la pointe au préalable pour lisser la surface de coupe et réduire le diamètre intérieur à 50-80 % de l’original. Une pointe trop petite perturbera les cellules et réduira la viabilité cellulaire, mais une pointe trop grande diminuera l’efficacité de la trituration.</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur, 9" &nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl), SigmaUltra, &ge ; 99.0 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 2 ml</td><td>BD falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 5 ml&nbsp ;</td><td>BD falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 10 ml</td><td>BD falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 25 ml</td><td>BD falcon</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 50 ml&nbsp ;</td><td>BD falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3, Hydrogénocarbonate de sodium), SigmaUltra, &ge ; 99,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl), SigmaUltra, &ge ; 99,5 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH), granulés, 99,998 % à base d’oligo-métaux</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté (Na2HPO4&bull ;( 7H2O)), &ge ; 99,99 %, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose, SigmaUltra, &ge ; 99.5 % (GC)</td>Filtre à seringue <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>, stérile, 0.2 & micro ; m</td><td>Seringue</td><td>Corning 431219</td><td></td></tr><tr><td>, 3 ml</td><td>BD falcon</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin, Holo, plasma bovin</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Coloration au bleu trypan, 0,4 %</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Ceci est utilisé pour compter les cellules vivantes/mortes. Renouvelez une ancienne solution de bleu de trypan si elle est réutilisée plusieurs fois ( par exemple plusieurs fois par semaine pendant plusieurs semaines), car elle formera des précipités et entraînera des lectures erronées de la densité cellulaire.</td></tr><tr><td>Trypsine de type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Solution de trypsine-EDTA, 0,25 %</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>La solution mère est préparée à raison de 50 mg de 5-fluoro-2'-désoxyuridine et de 125 mg d’uridine dans 25 ml de DMEM (8,12 et 20,48 mM, respectivement).</td></tr><tr><td>RÉACTIFS - immunocytochimie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonaux de lapin anti-MAP2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonaux de souris cocktail anti-GFAP</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>ÉQUIPEMENT - tatouage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NÉO&#8211 ; 9</td><td>Ce système de tatouage de rongeurs nouveau-nés est un système électrique qui fonctionne en déplaçant rapidement des aiguilles de tatouage à 1 ou 3 points verticalement dans la peau. Activez la machine à tatouer une fois pendant environ 0,5 seconde, tandis que les pointes des aiguilles de tatouage sont maintenues perpendiculaires à la surface de la peau. Nous préférons le tatouage à trois aiguilles pour maximiser la zone tatouée, mais le tatouage à une aiguille est efficace sur les zones plus étroites, par exemple les orteils, ou si un contrôle mécanique fin est nécessaire, par exemple lorsque des numéros sont tatoués. Deux cycles de tatouage à la vitesse la plus lente (en réglant « 1 » sur 3 étapes) sont généralement suffisants pour produire un tatouage visible et durable des coussinets des pattes.</td></tr><tr><td>EQUIPEMENT - génotypage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse, horizontal, Wide Mini&#8211 ; Sous-cellule GT</td><td>BIO&#8211 ; RAD</td><td>170&#8211 ; 4405</td><td>Les paramètres typiques de l’électrophorèse sont l’intensité du champ électrique à 6 V/cm et la durée de 25 min pour un gel de 10 cm.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>Nos réactions PCR pour le gène Tor1a dans &#916 ; Les souris knock-in E-torsinA sont les suivantes : 1 cycle de dénaturation à 94 &#176 ; C pendant 3 min, 35 cycles de dénaturation à 94 &#176 ; C pendant 30 sec, recuit à 58 &#176 ; C pendant 30 sec, extension à 72 &#176 ; C pendant 2 min. S’ensuit l’extension finale à 72 &#176 ; C pendant 10 min, et maintien à 4 &#176 ;C.</td></tr><tr><td>Alimentation, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>ÉQUIPEMENT - culture</td><td></td><td></td><td></td>cellulaire</tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé, Comtesse</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>Ce compteur de cellules automatisé mesure séparément les densités de cellules vivantes et mortes (non colorées et colorées au bleu de trypan, respectivement). Il est important de connaître la plage optimale de mesures de densité : le compteur que nous utilisons a la plus grande précision dans la plage de 1 x 105 à 4 x 106 cellules/ml. Si les valeurs de densité cellulaire mesurées se situent en dehors de la plage recommandée, ajustez le volume de remise en suspension en conséquence.</td></tr><tr><td>Armoire de sécurité biologique, Classe II, Type A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>Cette hotte est utilisée pour toutes les procédures de culture cellulaire, à l’exception de la dissection cérébrale.</td></tr><tr><td>Incubateur CO2, AutoFlow, Humidité Contrôlée Chemise d’eau</td><td>NUAIRE NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Banc Propre Horizontal</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>Ce banc propre est utilisé pour la dissection cérébrale (étapes 3.1.1 et 3.1.2 de « Dissection cérébrale et dissociation cellulaire) ».</td></tr><tr><td>Orbit LS Low Speed Shaker</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifugeuse</td><td>Fisher</td><td>46910 (centrifugeuse)/46922 (rotor)</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid génotypage des animaux suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Analyse à haute résolution de la morphologie et la fonction des neurones de mammifères nécessite souvent le génotypage des animaux individuels, suivie par l&#39;analyse des cultures primaires de neurones. Nous décrivons un ensemble de procédures pour: l&#39;étiquetage souriceaux nouveau-nés pour être génotypés, le génotypage rapide, et l&#39;établissement de cultures à faible densité de neurones du cerveau de ces souris. Souris individuels sont repérés par le tatouage, ce qui permet une identification à long terme durable à l&#39;âge adulte. Génotypage par le protocole décrit est rapide et efficace, et permet l&#39;extraction automatisée des acides nucléiques avec une bonne fiabilité. Ce est utile dans des circonstances où le temps suffisant pour le génotypage conventionnelle ne est pas disponible, par exemple, chez les souris qui souffrent de létalité néonatale. Cultures de neurones primaires sont générés à faible densité, qui permet des expériences d&#39;imagerie à haute résolution spatiale. Cette méthode de culture nécessite la préparation de couches nourricières gliales avant le placage neuronale. Le pPROTOCOLE est appliquée dans sa totalité à un modèle de souris de la dystonie trouble du mouvement DYT1 (souris knock-in-torsinA AE), et les cultures neuronales sont préparées à partir de l&#39;hippocampe, le cortex cérébral et le striatum de ces souris. Ce protocole peut être appliqué à des souris avec d&#39;autres mutations génétiques, ainsi que pour d&#39;autres espèces d&#39;animaux. En outre, les composants individuels du protocole peut être utilisé pour les sous-projets isolés. Ainsi ce protocole aura de larges applications, non seulement en neurosciences, mais aussi dans d&#39;autres domaines des sciences biologiques et médicales.

Comme exemple de l'application de ce protocole, des résultats représentatifs sont présentés pour l'étiquetage des souris par le tatouage, le génotypage fiable dans diverses conditions expérimentales, et l'établissement de cultures de neurones primaires sur des couches nourricières gliales. Tatouage Les nouveau-nés ont été marqués sur les coussinets en utilisant un système de tatouage ('nouveau-né' de la figure 1). Les étiquettes ...

Nous décrivons les procédures pour l&#39;étiquetage et le génotypage des souris nouveau-nés et de générer des cultures de neurones primaires d&#39;eux. Le génotypage est rapide, efficace et fiable, et permet pour l&#39;extraction de l&#39;acide nucléique automatisé. Ceci est particulièrement utile pour les souris néonatale létales et leurs cultures qui nécessitent l&#39;achèvement préalable de génotypage.

Rapid génotypage des animaux Suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

L’objectif global de cette procédure est de génotyper des souris nouveau-nées et de générer des cultures neuronales de faible densité sur une couche nourricière gliale. Ceci est accompli en génotypage d’abord rapidement les souris nouveau-nées à l’aide du bout de leur queue dans la deuxième étape. Le même jour, les cerveaux sont disséqués et cultivés en tant que couches nourricières gliales.Puis, après quelques semaines, un autre groupe de souris nouveau-nées est rapidement génotypé et des cellules neuronales sont générées à partir du cerveau de l’animal pour être cultivées sur les couches gliales nourricières précédentes. En fin de compte, cette méthode peut être utilisée pour le génotypage rapide et fiable ainsi que pour la génération de neurones sains et de cellules gliales. Ce protocole présente deux avantages principaux.L’une d’entre elles est que nous pouvons cultiver des neurones sains à une très faible densité pour des expériences d’imagerie en les plaquant sur une couche gliale fœtale. Le deuxième avantage est que les souris nouveau-nées peuvent être génotypées en quelques heures, ce qui permet de faire correspondre les génotypes des neurones et de la couche gliale fœtale. Je suis ko assistant de recherche dans le laboratoire Harta.Je vais vous montrer les procédures de génotypage et de culture. Commencez par ajouter 200 microlitres de solution d’extraction d’ADN dans chaque tube PCR contenant un échantillon. Placez la bande tubulaire dans un thermocycleur PCR, puis commencez l’extraction de l’ADN lorsque l’extraction est terminée.Retirez la bande de tubes du thermocycleur et retournez les tubes cinq fois. Transférez ensuite quatre microlitres d’extrait d’ADN de chaque échantillon dans un tube inutilisé sur une bande de huit tubes et mélangez l’échantillon avec 10 microlitres de deux XPCR prêts. Mélangez deux, deux microlitres d’amorces avant et arrière mélangées, et quatre microlitres d’eau sans nucléases.Pour chaque échantillon, placez les échantillons dans un thermocycleur et démarrez le programme de cyclage thermique. Lorsque le programme est terminé, chargez 20 microlitres de chaque échantillon amplifié ou marqueur de poids moléculaire directement dans le puits approprié d’un gel aros. Ensuite, faites fonctionner le gel et acquérez des images fluorescentes des bandes sous la lumière ultraviolette.Pour détecter les produits d’ADN amplifiés, commencez par retirer les régions d’intérêt de chaque hémisphère du cerveau, puis transférez les tissus cérébraux dans un tube de 15 millilitres. Laissez le tissu se déposer au fond du tube, puis remplacez la solution du haut des tranches par cinq à 10 millilitres de glace froide. Solution de Hank avec ou sans sérum de veau fœtal comme indiqué précédemment, en aspirant complètement toute la solution.Après le quatrième lavage, utilisez une seringue de trois millilitres pour filtrer deux millilitres d’essayin fraîchement préparé contenant une solution de digestion à travers une seringue de 0,2 micromètre. Filtrer directement dans le tube contenant les tissus cérébraux et laisser la trypsinisation se dérouler à température ambiante. Après 13 minutes, neutralisez la réaction en aspirant d’abord la majeure partie de la solution de trypsine, puis en ajoutant sept à 10 millilitres de solution d’écheveau glacé avec du sérum de veau fœtal.Rincez ensuite les tissus dans une solution de Hank avec ou sans sérum de veau fœtal comme cela vient d’être démontré. Ensuite, filtrez deux millilitres de solution de dissociation sur les tissus cérébraux. Ensuite, dissociez mécaniquement les cellules à l’aide d’une sonde douce 10 à 20 fois à l’aide d’un PE poli au feu bouché de coton de votre pipette.Continuez la sonde jusqu’à ce que les morceaux de tissu visibles disparaissent. Attendez trois minutes que les petits morceaux se déposent, puis utilisez la pipette PE pour transférer environ 1,5 millilitre de la solution dans un tube conique de 15 millilitres contenant trois millilitres de solution Hank glacée avec sérum fœtal bovin, faites tourner les tubes pendant 13 minutes à 185 G et quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant à l’aide de la même pipette pasteur.Remettez doucement la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de placage préchauffé. Ajoutez ensuite environ quatre millilitres de milieu de placage préchauffé. Transférez la suspension cellulaire dans un ballon de culture T 25 non enrobé et placez-le dans un incubateur de culture cellulaire.Au cours d’une journée in vitro, rincez les cellules deux fois avec cinq millilitres de produit de placage glacé, l’une en inclinant doucement le flacon plusieurs fois dans un mouvement tourbillonnant à six à neuf jours in vitro, placez 100 microlitres de matériau de revêtement avec des protéines de matrice extracellulaire sur des lamelles en verre dans une boîte de culture cellulaire et placez la boîte dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, rincez le ballon en aspirant toute la solution qu’il contient et en ajoutant environ 13 millilitres de solution d’écheveau glacé. Ensuite, aspirez complètement la solution.Ensuite, filtrez quatre millilitres d’une solution de trypsine EDTA et d’ADN directement sur les cellules et laissez les cellules se dissocier du flacon de culture cellulaire dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après 13 minutes, neutralisez la réaction avec deux millilitres de sérum bovin fœtal 100 % glacé et utilisez une pipette de cinq à 10 millilitres pour transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, lavez les cellules en ajoutant environ quatre millilitres de solution d’écheveau glacé avec centrifugation de sérum de veau fœtal, puis réanimez en suspendant la pastille dans un millilitre de milieu de placage préchauffé. Un.Maintenant, aspirez complètement le matériau de revêtement du couvercle, des glissements et plaquez environ 50 microlitres de cellules gliales en suspension sur les lamelles de recouvrement. Pour établir la couche nourricière gliale, incubez les cellules gliales pendant 20 à 60 minutes à 37 degrés Celsius, puis ajoutez un millilitre de milieu de placage préchauffé, un à chaque lamelle pendant que le milieu de placage est ajouté. Il est utile d’utiliser une autre pipette pour appuyer sur la périphérie de la lamelle afin que celle-ci ne flotte pas dans le milieu.Après la culture pendant la nuit. Remplacez le milieu par un millilitre de milieu de préchauffage frais, un à deux ou trois jours. In vitro, ajoutez 10 microlitres d’inhibiteur mitotique à chaque culture de couche nourricière pour inhiber la réplication de l’ADN et la prolifération des cellules gliales après sept à neuf jours.In vitro, remplacer le milieu de culture par le milieu de placage préchauffé deux. Ensuite, plaquez doucement environ 50 à 100 microlitres de cellules neuronales de souris dans un milieu de placage préchauffé deux sur chaque couche nourricière gliale. Dans cette image, le gène tour un a été amplifié à partir de l’ADN génomique, isolé à partir des clips de queue du nouveau-né, de chiots hétérozygotes de type sauvage et homozygotes du modèle knockin DYT one dystonia.Des bandes distinctes pour le type sauvage et les allèles mutés sont clairement visibles. Dans cette figure, deux champs représentatifs d’une culture neuronale hippocampique de souris sont représentés. Ils ont été générés à partir de la région hippocampique CA trois, CA un de souris de type sauvage.14 jours après le placage sur une couche nourricière gliale hippocampique préétablie de souris de type sauvage dans les images de contraste d’interférence différentielle, des signes de bonne santé, tels qu’une marge claire du corps cellulaire neuronal des processus neuronaux étendus et une couche relativement uniforme de cellules gliales peuvent être observés. Coloration immunochimique supplémentaire pour la carte des marqueurs neuronaux. Deuxièmement, l’identification des neurones et de leurs processus dans chaque domaine peut également être observée.En utilisant ce protocole, un génotypage en une seule série de culture peut être complété en 67 heures. Ce protocole est particulièrement utile pour la culture de neurones de souris génétiquement modifiées qui peuvent mourir plusieurs jours après la naissance.

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In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

Le protocole décrit un système de modèle efficace et reproductible pour étudier l'herpès simplex virus type 1 (HSV-1) temps de latence et la réactivation. Le dosage utilise des cultures de neurones sympathiques homogènes et permet pour la dissection moléculaire des virus de neurones interactions en utilisant une variété d'outils, y compris l'interférence ARN et d'expression de protéines recombinantes.

Un système de neurones primaires de la culture pour l&#39;étude de l&#39;herpès simplex virus de latence et de réactivation

Procédé de traçage neurones connectés synaptique est décrit. On utilise la spécificité de la TVA une cellule amont pour sonder si une population cellulaire d'intérêt synaptique reçoit une entrée à partir de types de cellules génétiquement déterminées.

Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

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Génération d’une culture primaire d’astrocytes à partir du cerveau d’un petit rat

Un protocole de génération d’un système de co-culture composé de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), de neurones corticaux primaires et d’astrocytes est décrit. Ce système de co-culture permet de détecter la formation de contacts et de circuits synaptiques entre de nouveaux neurones dérivés d’iPSC et des neurones corticaux préexistants exprimant la channelrhodopsine-2.

Une approche pour l&#39;évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

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Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

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Rapid Neuronal Différenciation des Induced cellules souches pluripotentes pour mesurer l&#39;activité réseau sur Arrays Micro-électrode

Présenté ici est un protocole pour la génération spontanée de neurosphères enrichies dans les cellules progénitrices neurales des neurones plaqués de haute densité. Au cours de la même expérience, lorsque les neurones sont plaqués à une densité plus faible, le protocole entraîne également des cultures de neurones de rat primaire prolongées.

Génération de neurosphères à partir de neurones hippocampes et corticales primaires mixtes isolées de l'embryon de rat Sprague Dawley E14-E16

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Établissement de cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée

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Génération et co-culture de microglie primaire murine et de neurones corticaux

Apprenez le génotypage rapide de souris nouveau-nées et la culture de neurones primaires sur couche de cellules gliales. Cette méthode fiable facilite l'étude des modèles murins létaux néonatalement.

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