Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer la morphologie et la dynamique des organites cellulaires sur un ensemble de microcavités imitant l’environnement 3D rencontré dans des conditions physiologiques. Pour les cellules à parois rigides, comme les levures à fission, les cavités peuvent organiser et orienter les structures cellulaires. Ceci est réalisé en fabriquant d’abord un ensemble de piliers PDMS à partir d’un maître pour obtenir un ensemble de microcavités PDMS, appelées coquetiers, par moulage de réplique.

Dans un deuxième temps, les coquetiers sont fonctionnalisés avec des protéines de la matrice extracellulaire et introduits dans un tube avec une pièce cylindrique en plastique sur mesure, qui soutient l’échantillon de microcavités et permet l’introduction de cellules de mammifères individuelles sur chacune des microcavités. Ensuite, les coquetiers remplis de cellules sont retirés et incubés avec le médicament ou le composé d’intérêt afin d’étudier le phénotype et les processus dynamiques des cellules dans un confinement 3D. Les résultats obtenus montrent des différences dans le phénotype cellulaire et les nouvelles structures dynamiques observées par rapport aux tests 2D in vitro standard basés sur l’orientation des cellules.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les tests de culture cellulaire 2D standard, est que les cellules de mammifères dans les coquetiers sont soumises à un environnement 3D similaire aux microenvironnements logiques, mais sont disposées dans une catégorie ordonnée et standardisée. L’ordre et l’orientation sont également des améliorations significatives dans le cas de la levure à fission. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du squelette cellulaire et de la découverte de médicaments, telles que l’identification de nouveaux médicaments anticancéreux avec un criblage à haut contenu.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de maladies multifactorielles telles que le cancer, car les tests de dépistage de médicaments peuvent facilement être réalisés et analysés au moyen de coquetiers, ce qui rend cette méthode particulièrement intéressante pour la médecine personnalisée. Cette méthode peut fournir une clé interne pour les structures et la dynamique organisées dans les cellules individuelles de mammifères et les cellules de levure de fission, et elle peut également être appliquée à l’étude d’organisation, au développement d’embryons tels que C. elegans et ri-so-flu-a. Dans ce protocole, un ensemble de microcavités ou de coquetiers est modelé sur une couche de polydiméthylsiloxane ou de PDMS collée sur une lamelle de recouvrement par moulage de réplique.

La première étape est la fabrication du maître, qui ne sera pas montré, mais qui est décrit dans le protocole texte. Une fois le maître fabriqué, l’étape suivante consiste à fabriquer la réplique PDMS. Dans un tube de 50 millilitres, mélangez soigneusement le réticulant et le prépolymère dans un rapport poids/poids de 1 à 10 ou volume/volume pour un total de 30 grammes.

Centrifugez le tube à 1 800 fois g pendant cinq minutes pour éliminer les bulles d’air. Déposez doucement le PDMS sur le maître. Si des bulles apparaissent, dégazez le mélange.

Placez l’échantillon dans un four à 65 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois le PDMS durci, utilisez un scalpel pour couper doucement la zone d’intérêt d’environ un centimètre carré, qui comprend environ 10 à cinq microcavités, ou coquetiers. Décollez doucement le tampon PDMS.

Pour commencer la procédure de moulage de répliques, activez le tampon PDMS par traitement au plasma d’oxygène pendant 30 secondes. Conservez temporairement le tampon activé dans une boîte de Pétri fermée pour éviter le dépôt de poussière. En travaillant dans une hotte, placez le tampon PDMS activé avec le côté avec les structures vers le haut ou à l’envers dans une boîte de Pétri à côté d’un bouchon de 15 millilitres.

Remplissez le bouchon avec 200 microlitres de triméthylchlorosilane. Fermez la boîte de Pétri et laissez le timbre saliniser pendant sept minutes. Placez le tampon PDMS sur la machine à doser avec les structures à l’envers.

Mettez une petite goutte de PDMS liquide sur le dessus des structures. Essorez l’enduction à 1500 tr/min pendant 30 secondes pour déposer une fine couche de PDMS sur le dessus des structures. Placez le tampon dans le four à 65 degrés Celsius pendant quatre heures pour durcir la couche PDMS déposée à revêtement par centrifugation.

Ensuite, activez la fine couche PDMS en plaçant le tampon PDMS à l’envers avec un couvercle en verre dans un nettoyeur plasma à oxygène pendant 30 secondes. Placez immédiatement le tampon en contact avec la lamelle en verre et appuyez doucement sur toute la surface du tampon avec une pince à épiler pour le collage. Après cela, maintenez une pression constante sur le dessus du tampon pendant environ 10 secondes.

30 minutes plus tard, décollez délicatement le tampon de la lamelle afin de libérer les coquetiers. Faites très attention à ne pas casser l’échantillon. Rincez abondamment les coquetiers à l’éthanol et séchez-les.

Si les coquetiers PDMS ne sont pas sur la lamelle en verre et se détachent pendant l’étape de désépinglage, envisagez d’ajuster les paramètres du nettoyeur plasma et de redémarrer la procédure de moulage de répliques. Pour faciliter la manipulation ultérieure de l’échantillon, il est recommandé de coller un petit morceau de PDMS durci sur le bord de la lamelle. Dans le cas des cellules de mammifères présentées dans cette vidéo, la surface du PDMS doit être fonctionnalisée avec des protéines d’adhésion de la matrice extracellulaire.

Hydrophilisez les coquetiers dans le nettoyeur plasma à oxygène pendant 30 secondes. Après cela, stérilisez les coquetiers avec de la lumière ultraviolette pendant cinq minutes. Déposez une petite goutte de solution de fibronectine pour couvrir toute la surface du coquetier et incubez pendant une heure à température ambiante.

Protégez l’échantillon du séchage. Rincez délicatement les coquetiers avec environ un millilitre de PBS, à l’aide d’une pipette de distribution en plastique. Répétez l’opération trois fois au total.

Ensuite, placez une pièce cylindrique en plastique sur mesure dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez 13 millilitres de milieu de culture cellulaire dans le tube. Le fluide doit atteindre au moins deux centimètres au-dessus de la pièce cylindrique pour assurer une immersion complète de l’échantillon.

À l’aide d’une pince à épiler pointue et droite pour tenir l’échantillon par la poignée PDMS, placez soigneusement les coquetiers à l’intérieur du tube, en appuyant doucement sur la lamelle jusqu’à ce qu’elle repose sur la face supérieure de la pièce en plastique et qu’elle soit complètement immergée. Les cellules à introduire dans les coquetiers doivent être cultivées à 80 à 100 % de confluence et remises en suspension dans cinq millilitres de milieu de culture. Pipetez 200 microlitres de cellules sur le dessus des coquetiers, en laissant tomber les cellules aussi centrées que possible sur les coquetiers, mais en évitant tout contact physique.

Cela évitera la casse et/ou l’endommagement de l’échantillon. Centrifugez le tube de 50 millilitres à 1 800 fois g pendant deux minutes. Pipetez encore 200 microlitres de cellules sur les coquetiers et centrifugez à nouveau à 1 800 fois g pendant deux minutes.

Répétez l’opération trois fois au total afin d’optimiser le pourcentage de remplissage. Après la dernière centrifugation, vérifiez le pourcentage de remplissage des coquetiers au microscope. À l’aide de la pince à épiler pour tenir la poignée PDMS, retirez soigneusement l’échantillon du tube sans déranger les cellules des coquetiers et placez l’échantillon dans une boîte de Pétri avec du moyen.

Pour éliminer les cellules en excès qui ne se trouvent pas dans les coquetiers, rincez en pipetant doucement de haut en bas trois fois de chaque côté de la matrice de microstructure. Enfin, remplacez le milieu par un milieu frais pour éliminer les cellules non attachées. Pour observer les organites cellulaires fixes, placez les coquetiers avec un échantillon fixe sur la platine d’un microscope inversé à épifluorescence et sélectionnez l’objectif à huile 60x.

Dans cet exemple, l’échantillon est constitué de fibroblastes NIH 3T3, où l’appareil de Golgi, le noyau et les fibres d’actine ont été colorés. Faites la mise au point avec précaution à l’aide d’une lumière à champ vif jusqu’à ce que les coquetiers et les cellules soient dans le plan d’observation. Sélectionnez et concentrez la région d’intérêt et lancez la capture d’image.

Commencez cette procédure en plaçant les coquetiers dans un support de microscope et en le remplissant d’un millilitre de milieu de culture cellulaire FCS L15 à 10 %. Installez le support sur la platine du microscope. Pour éviter l’évaporation, placez un couvercle en verre sur le dessus.

Observez les cellules à l’aide d’un microscope inversé à épifluorescence équipé d’un objectif à huile 60x. Cet exemple utilise des cellules HeLa qui expriment de la myosine et de l’actine marquées par fluorescence, deux molécules clés impliquées dans la fermeture du cycle cytocinétique pendant la mitose. Sélectionnez la région d’intérêt et recherchez un anneau cytocinétique, en utilisant le canal GFP ou Texas Red.

Faites la mise au point avec précision. Exécutez l’acquisition automatique dans les deux canaux jusqu’à ce que l’anneau soit complètement fermé. Les images au microscope électronique à balayage des coquetiers montrent que leur forme et leur taille sont très régulières.

Pour les cellules à parois rigides comme les levures à fission, les coquetiers peuvent orienter l’anneau cytocinétique. Pour les cellules de mammifères, une comparaison entre les cellules sur des coquetiers 3D et des surfaces planes 2D révèle que les premières forment un réseau ordonné avec un phénotype homogène de type sphérique, tandis que les secondes présentent une morphologie désordonnée et hétérogène. Les cellules sur les coquetiers montrent également une réduction du nombre de fibres de stress, comme l’indique le nombre d’effets modestes du traitement à la blebbistatine.

L’appareil de Golgi sur les cultures 2D présente généralement un phénotype étendu, tandis que chez les coquetiers, il présente un phénotype plus compact. Cela a été confirmé par une quantification des phénotypes de Golgi. Enfin, sur les surfaces 2D, le noyau cellulaire est orienté de manière aléatoire, tandis que sur les coquetiers, il est orienté orthogonalement sur le plan xy, à la fois dans les cellules de type sauvage et les cellules traitées à la blebbistatine.

La détermination des valeurs de sphéricité du noyau révèle que les coquetiers n’affectent pas la sphéricité normale du noyau cellulaire. Cependant, la différence entre les cellules de type sauvage et les cellules traitées à la blebbistatine sur les coquetiers suggère que les coquetiers révèlent un effet réel du médicament qui est masqué en 2D. L’étude de cellules vivantes à l’aide d’ovulets permet d’identifier de nouveaux processus actifs, qui ne sont pas visibles dans les cultures standard.

Par exemple, des accumulations périodiques de myosine qui se déplacent radialement lorsque l’anneau cytocinétique se ferme pendant la mitose ont été observées dans les cellules HeLa. Une fois maîtrisés, les coquetiers peuvent être préparés à partir d’une réplique en moins de six heures, et le remplissage des cellules peut se faire en 15 minutes environ. Lors de la tentative de ce processus, il est important d’avoir la taille des coquetiers par rapport aux cellules étudiées.

Cette procédure peut être adaptée aux plateformes de dépistage à haut contenu des entreprises pharmaceutiques pour les activités de dépistage de masse et également dans les tests de diagnostic personnalisés des patients dans l’évaluation de traitements spécifiques individuels. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication et de l’utilisation des microcavités de coquetiers. Les coquetiers standardisent et génèrent de l’ordre dans une variété de systèmes similaires, allant de la cellule individuelle sans parois, comme les cellules de mammifères, au système avec parois, comme la levure et l’embryon.