Name: Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Découvrez une méthode de criblage à haut débit utilisant des microcavités PDMS pour étudier la morphologie cellulaire en 3D. Cette technique améliore l'orientation des organelles et réduit la variabilité par rapport aux tests 2D standards.

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Nous reconnaissons L. Brino (IGBMC haute installation de filtrage du contenu, Illkirch, France) pour nous fournir avec l&#39;anticorps anti-Giantin, M. Labouesse Lab. pour C. elegans (IGBMC) et B. Séraphin Lab. pour la levure bourgeonnante (IGBMC), E. Paluch et A. Hyman pour les cellules HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresde), J. Moseley (Dartmouth Medical School) et Wu (Université Ohio State) JQ pour les cellules de levure de fission; A. Hoël et F. Evenou aide expérimentale, C. Rick (IBMC, Strasbourg, France) pour l&#39;aide technique et JC Jeannot (Femto-st, France) pour les aider à microfabrication. Ce travail a été soutenu par des fonds du CNRS, de l&#39;Université de Strasbourg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale et ci-FRC de Strasbourg.

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</ol>

Nous avons rien à révéler.

Replica moulage a été utilisé pour fabriquer les «coquetiers». Le procédé de fabrication n&#39;a pas besoin d&#39;une chambre propre; il est facile et simple, même si une certaine pratique peut être nécessaire. En particulier, la libération du timbre de PDMS est l&#39;étape la plus critique afin de produire une grande surface de «coquetiers» de haute qualité. Pour cette raison, une attention particulière doit être prise lors de cette étape. Si cette étape échoue à plusieurs reprises, envisager pour optimiser les paramèt...

Courant dans des essais à base de cellules in vitro sont deux dimensions (2D). Cette configuration est pas naturelle pour les cellules de mammifère et donc pas physiologiquement pertinente 1; cellules présentent une grande diversité de formes, de tailles et de phénotypes hétérogènes. Ils présentent de sérieuses limitations supplémentaires lorsqu&#39;il est appliqué à des applications de dépistage, comme une distribution désordonnée dans le plan et les phénotypes extrêmes de organites cellulaires (fibres de stress, en particulier). Ceci est particulièrement important dans les essais cliniques pour le dépistage des drogues, où les hautes budgets sont dépensés chaque année. La plupart de ces médicaments ne parviennent que lorsqu&#39;ils sont appliqués à des modèles animaux en raison de la condition de culture 2D artificiel dans les stades précoces du criblage des médicaments. En outre, en utilisant cette approche, des organites cellulaires spécifiques ne peut pas être visualisée correctement, comme la bague de actomyosine cytokinétique pendant la mitose cellulaire et, en général des structures qui évoluent dans le plan perpendiculaire au plan d&#39;observation. Certainsnouveaux tests 2D ont été proposées afin de remédier aux inconvénients mentionnés ci-dessus et des informations importantes sur l&#39; organisation du cytosquelette ont été observées 2,3. Cependant, ces tests présentent encore une limitation sérieuse: les cellules présentent un phénotype très propagation contrairement à ce qui est observé in vivo, où les cellules présentent une architecture 3D. Ces artefacts associés à la méthode de culture peut déclencher des caractéristiques non physiologiques , telles que le renforcement de fibres de stress 1,4,5. Tridimensionnelles des analyses de culture cellulaire fournissent de nombreux avantages par rapport aux environnements 2D 6,7. Ils sont physiologiquement plus pertinent, et les résultats sont donc significatifs. A titre d&#39;exemple, les cellules incorporées dans les hydrogels présentent des structures 3D-like mais leurs morphologies diffèrent d&#39;une cellule à l&#39; autre 8,9. Cependant, leurs morphologies diffèrent d&#39;une cellule à une autre, ce qui complique les applications de criblage. Une autre stratégie consiste à intégrer uniqueles cellules dans des cavités microfabriqués 10,11. position de cellules, la forme, la polarité et l&#39;organisation interne de la cellule peuvent alors devenir normalisée. En plus de fournir une architecture 3D ressemblant à des cellules, microcavités permet également de haute contenu des études de dépistage 10,12-14; des cellules individuelles peuvent être commandées en microréseaux et des organites cellulaires et leurs évolutions peuvent être observées en parallèle. Cette régularité fournit de bonnes statistiques à faible nombre de cellules et de meilleures résolutions temporelles / spatiales. Des composés utiles sont plus faciles à identifier de manière fiable. Dans cette étude, nous montrons la fabrication et l&#39; application d&#39;un nouveau système de culture de cellules unique 3D-like pour les applications à haut contenu de dépistage 10,12,13. Le dispositif est constitué d&#39;un réseau de microcuves élastomères (10 5 cavités / cm 2), inventé &#39;&#39; coquetiers (CE). Dimensions et volume total des CE dans ce travail sont optimisés pour le volume typique des cellules NIH3T3 et HeLa individuelsau cours de la division cellulaire. Morphologie des cavités cylindriques - - est sélectionné pour la forme des cellules correctement orient pour la visualisation des processus actifs. Replica moulage est utilisé pour modèle un tableau de la CE sur un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche collée sur un verre lamelle 15,16. Les cellules sont introduites dans les CE par centrifugation. Nous rapportons ici l&#39;observation et la normalisation des organites cellulaires (fibres de stress d&#39;actine, appareil de Golgi et noyau) en 3D (CE) en comparaison avec les mêmes cellules sur 2D (plat) surfaces. Nous présentons également l&#39;observation des processus dynamiques actifs tels que la fermeture de l&#39;anneau de actomyosine cytokinétique lors de la mitose des cellules 17. Enfin, nous montrons les résultats de cette méthodologie sur d&#39; autres systèmes avec des parois rigides, tels que la levure bourgeonnante, levure de fission et C. embryons elegans qui confirme l&#39;applicabilité de notre méthodologie à une large gamme de systèmes modèles. Nous présentons ensuite une p détaillée et exhaustiverotocol afin de fabriquer et d&#39;appliquer les «coquetiers» pour microfabrication 3D. Notre approche est simple et n&#39;a pas besoin d&#39;une chambre propre. Nous prévoyons que cette nouvelle méthodologie sera particulièrement intéressante pour les essais de criblage de médicaments et de la médecine personnalisée, en remplacement de boîtes de Pétri. Enfin, notre dispositif sera utile pour étudier les distributions des réponses des cellules à des stimuli externes, par exemple dans le cancer 18 ou dans la recherche fondamentale 19.

<table><tbody><tr><td>ddH20 (ultrapur)</td><td>Millipore-Utiliser</td><td></td> <td>toujours de l’eau douce.</td></tr><tr><td>Parafilm (film plastique)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Collez Parafilm sur la paillasse de laboratoire à l’aide de quelques gouttelettes d’eau et assurez une planéité parfaite de la surface.</td></tr><tr><td>Masque photo</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/ » name="PORTÉE ! D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>Plaquette de silicium</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>2000 series</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp ; </a></td></tr> <tr><td>travail dans une hotte est nécessaire ; consultez la fiche technique du fabricant pour plus d’informations.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 développeur</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp ; </a></td></tr> <tr><td>travail dans une hotte est nécessaire ; consultez la fiche technique du fabricant pour plus d’informations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp ; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp ; region=CA</a></td></tr><tr><td>Disponible auprès de plusieurs entreprises.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote (réactif de siliconation )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp ; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp ; region=FR&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>nocif, le travail dans une hotte est nécessaire ; consultez la fiche technique du fabricant pour plus d’informations.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotriméthylsilane (TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR&nbsp;&nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS produit une toxicité aiguë par inhalation et par voie cutanée, et est hautement inflammable (avec un retour de flamme d’allumage pouvant se produire sur des distances considérables), par conséquent il doit être utilisé dans une sorbonne loin des sources d’inflammation</td></tr><tr><td>Gants en nitrile</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional. com/products/EPI/Hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-G10-blue-nitrile-gants-m</a></td></tr><tr><td>Disponible auprès de plusieurs entreprises.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre #0</td><td>Verre Knittel</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a></td></tr><tr><td>Très fragile. Manipulez doucement.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler droite pointue</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>tube de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>Disponible auprès de plusieurs entreprises.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 kit</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx ? R=131FR">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx ? R=131FR&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>Le paquet contient à la fois la base PDMS et l’agent de durcissement. Des élastomères similaires sont disponibles auprès de plusieurs entreprises.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>Disponible auprès de plusieurs sociétés.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM moyen à haute teneur en glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search ? LBCID=12301479& mot-clé=41965-039& store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search ? LBCID=12301479& mot-clé=41965-039& store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Sérum de veau bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp ; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp ; region=CA</a></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp ; store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp ; store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp ; store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp ; store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS est à 10x et doit être dilué à 1x en utilisant ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21083-027</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp ; store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp ; store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Medium pour atmosphères sans contrôle</td><td></td><td></td><td></td>CO2</tr><tr><td>Fibronectine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp ; terme=F1141-5MG& lang=fr& region=CA& focus=produit& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match %20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp ; terme=F1141-5MG& lang=fr& region=CA& focus=produit& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match %20partialmax</a></td></tr><tr><td>Pénicilline & Streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp ; store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp ; store=Scientifique& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM</a></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri P35</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/</a></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri P60</td><td>Greiner</td><td>628163</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/</a></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri P94</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/</a></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 3 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp ; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp ; region=FR&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>Nocif en particulier pour les yeux, le travail sous hotte est nécessaire ; consultez la fiche technique du fabricant pour plus d’informations.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton 0.5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp ; terme=93443-100ML& lang=fr& region=CA& focus=produit& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match %20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp ; terme=93443-100ML& lang=fr& region=CA& focus=produit& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match %20partialmax</a></td></tr><tr><td>Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379 ? CID=search-a12379">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379 ? CID=recherche-a12379&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>dissoudre la poudre dans 1,5 ml de méthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td><td>dilution 1:200 dans PBS 1x</td></tr><tr><td>anti-Giantin polyclonal de lapin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>dilution 1:500 dans PBS</td></tr> <tr><td>1x<a href="http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html">http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&nbsp ; </a></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-anillin</td><td>Avec l’aimable autorisation de M. Glotzer, publié dans Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin est une protéine d’échafaudage qui relie RhoA, l’actine et la myosine pendant la cytokinèse. Biologie actuelle 18, 30&ndash ; 6 (2008).</td><td></td><td>Dilution 1:500 dans PBS 1x</td></tr><tr><td>Anti-phosphotyrosine</td><td>Transduction Lab</td><td>610000</td><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000</td></tr><tr><td>Cy3 chèvre anti-lapin&nbsp ;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-166-047</td><td><a href="http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp">http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>dilution 1:1 000 dans PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&nbsp ;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp ; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp ; region=FR&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>1 mg/ml pendant 1 min</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp ; term=G2025& lang=fr& region=CA& focus=produit& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match %20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp ; term=G2025& lang=fr& region=CA& focus=produit& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match %20partialmax</a></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp ; terme=M8410-500ML& lang=fr& region=CA& focus=produit& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match %20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp ; terme=M8410-500ML& lang=fr& region=CA& focus=produit& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match %20partialmax</a></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>-</td><td>-</td>Les <td>cellules de mammifères sont disponibles auprès de nombreuses entreprises. Voir aussi Tableau 1</td></tr><tr><td>NIH3T3</td> cellules <td>ATCC-Cellules de</td><td></td> <td>mammifères sont disponibles auprès de nombreuses entreprises. Voir aussi <forte>Tableau 1</forte></td></tr><tr><td>levure à fissionnbsp ;</td><td>-</td><td>-</td><td>Pour plus de détails sur les souches, contactez l’auteur correspondant. Voir aussi Table 1</td></tr><tr><td>C. elegans worms</td><td>-</td><td>-</td><td>Pour plus de détails, contactez l’auteur correspondant.&nbsp ; Voir aussi Tableau 1</td></tr><tr><td>YES (Agar) + 5 Suppléments inclus</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-732</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp ; s=Recherche">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp ; s=Recherche&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>Pour la préparation : suivre les instructions telles qu’elles figurent sur la boîte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OUI (Médias) + 5 Suppléments inclus</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp ; s=Recherche">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp ; s=Recherche&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>Pour la préparation : suivre les instructions indiquées sur l’encadré</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMM (Media)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp ; s=Recherche">http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp ; s=Recherche&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>Pour la préparation : suivez les instructions telles qu’elles figurent sur la boîte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre EMM stérilisé (média) - Uniquement pour l’imagerie</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td>Pour la préparation : suivez les instructions telles qu’elles figurent sur la boîte. Filtre : stérilisez le média à l’aide d’un 0,22 & micro ; M au lieu de l’autoclavage. Cela donne de la transparence au média et réduit l’autofluorescence.</td></tr><tr><td>Suppléments (pour EMM)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp ; s=Recherche">http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp ; s=Rechercher</a></td></tr><tr><td>&nbsp ;( Ajouter 225 mg/L dans le média EMM avant l’autoclave ou le filtrage)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtres stériles Stericup et Steritop Aspirateur</td><td>Millipore</td><td>-</td><td><a href="http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp ; tab1=2& tab2=1#tab2=1 :tab1=2">http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp ; tab1=2& tab2=1#tab2=1 :tab1=2</a></td></tr></tbody></table>

commande de cellules simples et simple embryons en 3d confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

cellules biologiques sont habituellement observées sur (2D) des surfaces planes. Cette condition est non physiologique et les phénotypes et les formes sont très variables. Le dépistage à base de cellules dans de tels environnements ont des limitations donc graves: organites cellulaires présentent des phénotypes extrêmes, morphologies cellulaires et tailles sont des organites cellulaires hétérogènes et / ou spécifiques ne peuvent pas être correctement visualisés. En outre, des cellules in vivo sont situées dans un environnement 3D; Dans cette situation, les cellules présentent des phénotypes différents principalement en raison de leur interaction avec la matrice extracellulaire autour du tissu. Afin de normaliser et de générer l&#39; ordre de cellules individuelles dans un environnement 3D physiologiquement pertinents pour des essais à base de cellules, nous rapportons ici la microfabrication et les applications d&#39;un dispositif de culture in vitro de cellules 3D. Ce dispositif se compose d&#39;un tableau 2D de microcavités (typiquement 5 à 10 alvéoles / cm 2), chacun rempli avec les cellules ou les embryons isolés. cellule position, la forme, la polarité et l&#39;organisation interne de la cellule deviennent alors normalisée montrant une architecture 3D. Nous avons utilisé réplique moulage pour motif un tableau de microcavités, «coquetiers», sur un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche collée sur une lamelle. Caries étaient recouverts de fibronectine pour faciliter l&#39;adhérence. Les cellules ont été insérées par centrifugation. le pourcentage de remplissage a été optimisé pour chaque système permettant jusqu&#39;à 80%. Les cellules et les embryons viabilité a été confirmée. Nous avons appliqué cette méthode pour la visualisation des organites cellulaires, comme noyau et appareil de Golgi, et d&#39;étudier les processus actifs, tels que la fermeture de l&#39;anneau cytokinétique lors de la mitose cellulaire. Ce dispositif a permis l&#39;identification de nouvelles fonctionnalités, telles que des accumulations et des inhomogénéités de la myosine et l&#39;actine périodiques lors de la fermeture du cycle cytokinétique et phénotypes compactés pour Golgi et l&#39;alignement noyau. Nous avons caractérisé la méthode pour les cellules de mammifères, levure de fission, la levure bourgeonnante, C. elegans wième adaptation spécifique dans chaque cas. Enfin, les caractéristiques de ce dispositif, il est particulièrement intéressant pour les tests de dépistage des drogues et de la médecine personnalisée.

Les «coquetiers» (CE) sont une méthodologie de haute teneur dépistage roman qui permet la visualisation des cellules et d'embryons orientés dans un environnement 3D. De plus, certains processus cellulaires, qui sont difficiles à observer en 2D cultures (plat) standard, peuvent être observés par cette nouvelle méthode. La figure 1a montre un résumé de la procédure pour la microfabrication CE (voir également la section 1 dans le protocole décrit ci-dessus ). La méthode est simple, rapide, efficace et sans...

Nous rapportons un dispositif et une nouvelle méthode pour étudier les cellules et les embryons. Les cellules individuelles sont précisément commandées dans des tableaux de microcavité. Leur confinement 3D est une étape vers des environnements 3D rencontrés dans des conditions physiologiques et permet l&#39;orientation des organites. En contrôlant la forme des cellules, cette configuration réduit la variabilité signalée dans des essais standard.

Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer la morphologie et la dynamique des organites cellulaires sur un ensemble de microcavités imitant l’environnement 3D rencontré dans des conditions physiologiques. Pour les cellules à parois rigides, comme les levures à fission, les cavités peuvent organiser et orienter les structures cellulaires. Ceci est réalisé en fabriquant d’abord un ensemble de piliers PDMS à partir d’un maître pour obtenir un ensemble de microcavités PDMS, appelées coquetiers, par moulage de réplique.Dans un deuxième temps, les coquetiers sont fonctionnalisés avec des protéines de la matrice extracellulaire et introduits dans un tube avec une pièce cylindrique en plastique sur mesure, qui soutient l’échantillon de microcavités et permet l’introduction de cellules de mammifères individuelles sur chacune des microcavités. Ensuite, les coquetiers remplis de cellules sont retirés et incubés avec le médicament ou le composé d’intérêt afin d’étudier le phénotype et les processus dynamiques des cellules dans un confinement 3D. Les résultats obtenus montrent des différences dans le phénotype cellulaire et les nouvelles structures dynamiques observées par rappo

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Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et la culture de cellules uniques avec une plateforme microfluidique, qui utilise un nouveau concept de conception de micropuits pour permettre l’isolement de cellules uniques à haute efficacité et la culture clonale à long terme.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Microinjection des embryons de poisson-zèbre et des larves est une technique cruciale mais difficile utilisée dans de nombreux modèles de poisson-zèbre. Nous présentons ici une gamme d’outils de micro-échelle pour aider à la stabilisation et l’orientation du poisson-zèbre pour microinjection et l’imagerie.

Microstructurées dispositifs pour Microinjection optimisée et l’imagerie des larves de poisson zèbre

Nous présentons une procédure pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir une formation de modèles reproductibles. Un dispositif cube contenant deux hydrogels différentes est utilisé pour atteindre multidirectionnel d’imagerie pour la formation de tissu motif.

Contrôle de Cluster cellule 3D initial dans un dispositif hybride Gel Cube modèle répétable Formations

Nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires. Ce dispositif permet l’analyse des réponses cellulaires aux signaux solubles dans les microenvironnements 3D avec des gradients chimioattractant définis. Les organoïdes sont meilleurs que les cellules simples à la détection des faibles entrées bruyantes.

Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant

Ce protocole explique comment préparer et monter des échantillons bactériens pour l'imagerie tridimensionnelle vivante et comment reconstruire la forme tridimensionnelle d'E. coli à partir de ces images.

Imagerie tridimensionnelle des cellules bactériennes pour des représentations cellulaires précises et une localisation précise des protéines

Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l'imagerie simultanée en time-lapse 3D de l'embryogenèse dans 80-100 embryons d'élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d'image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l'analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l'embryogenèse.

Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Présenté ici est un protocole de microinject et simultanément l’image de plusieurs embryons de Drosophila au cours du développement embryonnaire à l’aide d’une plaque à base, imageur à haute teneur.

Préparation et microinjection d’embryons de drosophile pour la microscopie cellulaire vivante effectuée à l’aide d’un analyseur automatisé à contenu élevé

Ce protocole détaille une méthode pour la production de trois types différents de sphéroïdes d’une manière qui les rend adaptés au criblage et à l’analyse à grande échelle à haute teneur. En outre, des exemples sont présentés montrant comment ils peuvent être analysés au niveau des sphéroïdes et des cellules individuelles.

Une méthode robuste pour la production à grande échelle de sphéroïdes pour les applications de criblage et d’analyse à haute teneur

Découvrez une méthode de criblage à haut débit utilisant des microcavités PDMS pour étudier la morphologie cellulaire en 3D. Cette technique améliore l'orientation des organelles et réduit la variabilité par rapport aux tests 2D standards.

Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

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