Préparation de Synaptic membrane plasmique et de protéines de densité post-synaptique en utilisant un gradient discontinu de saccharose

L’objectif global de cette procédure est de démontrer le fractionnement subcellulaire du tissu cérébral à l’aide d’un gradient discontinu de saccharose pour enrichir les protéines des membranes synaptiques et des densités post-synaptiques. Ceci est accompli en homogénéisant d’abord le tissu cérébral avec un homogénéisateur motorisé. Viennent ensuite une série d’étapes de centrifugation pour préparer des extraits bruts de protéines membranaires.

Les extraits membranaires sont ensuite superposés sur un gradient discontinu de saccharose pour l’ultracentrifugation. La dernière étape consiste à collecter les protéines du gradient. En fin de compte, les résultats peuvent montrer des changements dans les niveaux de protéines synaptiques grâce à l’analyse par transfert Western.

Il s’agit d’une technique bien établie qui est utilisée par les neuroscientifiques depuis plus de 40 ans. Nous l’utilisons dans notre laboratoire pour comprendre comment la composition protéique de la synapse change lorsque nous perturbons différents systèmes de neurotransmetteurs. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes, comme les gradients par appel ou les gradients continus de saccharose, est que les gradients discontinus de saccharose sont plus faciles à construire à la main.

Ce protocole utilise un homogénéisateur en téflon en verre motorisé, remplacez toujours le pilon entre les échantillons, rincez et séchez. L’homogénéisateur charge d’abord le tissu disséqué dans un tube de 13 millilitres avec quatre millilitres de solution de saccharose tamponnée HEPA de 0,32 molaire. Transférez ensuite le tissu dans un homogénéisateur en verre propre.

Réglez le moteur à 900 tr/min et homogénéisez l’échantillon en 12 coups sur 30 secondes en utilisant moins de quatre grammes de tissu pour assurer un bon fractionnement, transférez l’échantillon dans le tube et stockez une aliquote de 100 microlitres à moins 80 degrés Celsius pour l’analyse des protéines. Ensuite, séparez la matière nucléaire en faisant tourner l’homogénat à 900 G pendant 10 minutes. À quatre degrés Celsius, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Le surnageant contient la fraction membranaire brute. Maintenant, pour enrichir pour la centrifugeuse synaptosomique brute, le surnageant à 10 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, retirez le surnageant. La pastille contient la fraction synaptosomique brute Resus.

Suspendez-le dans un millilitre de solution de saccharose à 0,32 molaire. Puis, à trois millilitres de solution dans la centrifugeuse en suspension, la fraction brute pendant 15 minutes À 10 000 g à quatre degrés Celsius, retirez le surnageant. Maintenant, poux rapidement le granulé, remettez le granulé en suspension dans un millilitre d’eau pure.

Ajoutez ensuite trois millilitres d’eau supplémentaires, rapidement. Transférez-le dans l’homogénéisateur. Appliquez trois coups à la main et transférez-le dans le tube de 13 millilitres.

Ajustez rapidement l’échantillon à quatre HEA millimolaires avec un ajout de 16 microlitres d’HEA molaires et mélangez-le par inversion. Maintenant, placez l’échantillon sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant une demi-heure. Pour assurer la lyse de l’échantillon, terminez le fractionnement en granulant la fraction première Lysed P deux.

Faites-le tourner à 25 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, retirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de solution de saccharose. Celui-ci contient les membranes synap épisomales enrichies. Tout d’abord, pré-mesurez les tampons pour former un gradient discontinu de saccharose.

Chargez trois tubes comme suit, l’un avec exactement 3,5 millilitres de solution de saccharose tamponnée de 1,2 tas molaires. Un autre avec exactement trois millilitres de solution de 1,0 molaire, et le troisième avec trois millilitres de solution de 0,8 molaire. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre, transférez la solution de saccharose de 1,2 molaire dans un tube d’ultracentrifugation en polymère de 12 millilitres.

À l’aide d’une pipette neuve, superposez soigneusement la solution molaire 1,0 sur la solution molaire 1,2. Ne dérangez pas la solution à 1,2 molaire et n’introduisez pas de bulles avec la pipette. Utilisez la même technique pour superposer la solution à 0,8 molaire sur le dessus.

Soyez prudent. De petites vibrations provenant d’un vortex de banc ou d’une micro-centrifugeuse suffisent à perturber l’intégrité du gradient. Il est important de construire les dégradés avec soin et efficacité.

Si cela prend trop de temps ou si le gradient est exposé aux vibrations, vous ne pourrez pas récupérer les membranes synaptiques dans les étapes ultérieures. Maintenant, avec une autre pipette de pasteur, superposez la fraction de membrane épisomale synap enrichie au-dessus du gradient préparé. Équilibrez avec précision le gradient d’une ultracentrifugeuse dans un rotor à godets oscillants.

Ensuite, faites-le tourner à 150 000 G pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Soyez très prudent lorsque vous retirez le gradient du godet après la centrifugation, il doit y avoir des bandes claires de solution de saccharose. Avec des fractions protéiques à chaque interface et une pastille, les fractions ne doivent pas être diffuses.

À l’aide d’une aiguille de calibre 18 et d’une seringue d’un millilitre, percez la partie la plus basse de l’interface molaire à 1,2 et retirez la bande blanche de protéine, qui contient les membranes plasmiques synaptiques. Enregistrez le volume de cette couche. Transférez la couche dans un tube ultracentrifuge à paroi de 3,5 millilitres d’épaisseur.

Ajoutez exactement 2,5 volumes de quatre HEA millimolaires. Ensuite, préparez un tube d’équilibrage avec une solution de saccharose tamponnée HEA 0,32 molaire dans un rotor à angle fixe, ultracentrifugez l’échantillon à 200 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le séné et remettez en suspension la pastille de membrane plasmique synaptique.

Dans 300 microlitres de 50 millimolaires HEA deux millimolaires solution EDTA. La fraction de densité post-synaptique ou fraction PSD peut maintenant être collectée en utilisant davantage les mêmes techniques. Les étapes sont clairement décrites dans le protocole textuel.

Un western blot a été effectué avec une protéine totale, la membrane plasmique synaptique et les premières fractions de protéines de densité post-synaptique. La fraction PSD n’a subi qu’un seul traitement détergent et le tissu provenait de striatum de souris. Les protéines présynaptiques comme le transporteur de dopamine sont enrichies dans la fraction SPM, mais sont éliminées lors de l’étape détergente suivante pour l’enrichissement en PSD.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de conserver tous les échantillons sur de la glace et d’inclure des inhibiteurs de protéase et de phosphatase après cette procédure. D’autres méthodes comme l’analyse de sang occidentale ou l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle peuvent être effectuées. Ensuite, vous pouvez répondre à des questions telles que comment le traitement médicamenteux affecte les niveaux de récepteurs au niveau de la synapse.