Name: Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel du transport axonal rétrograde du BDNF dans les neurones hippocampiques de rat. Cette méthode microfluidique permet de suivre les dynamiques des facteurs neurotrophiques avec une précision inégalée.

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Nous tenons à remercier Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit pour leur assistance technique. L&#39;étude est soutenue par de subvention du NIH (PN2 EY016525) et par le financement de la recherche et du syndrome de Down Treatment Foundation et la Fondation Larry L. Hillblom.

Les interventions chirurgicales et animales sont réalisées dans le strict respect de la NIH Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les expériences impliquant l&#39;utilisation d&#39;animaux sont approuvés par l&#39;UCSD institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. 1. plasmide de clonage, expression et purification de Mono-biotinylé BDNF (mBtBDNF) REMARQUE: construire pré-proBDNFavi et BirA ADNc dans le vecteur pcDNA3.1 et coexprimer dans les cellules HEK293FT 10. Purifiez mBtBDNF utilisant des billes de Ni-NTA selon la méthode précédemment publiée de la production du facteur de croissance nerveuse monobiotinylé mature et biologiquement active (mBtNGF) 10. 2 Préparation de microfluidiques Chambers Dispositif microfluidique neurone de culture permet d&#39;isoler fluidiquement axones des corps cellulaires des neurones. Assemblez chambres avec lamelles fraîchement enduites juste avant chaque dissection. Chambres microfluidiques utilisésdans ce protocole sont achetés dans le commerce (voir matériaux et la table de l&#39;équipement). Lavage à la main et réutilisés chambres achetés dans le commerce jusqu&#39;à 5-6x. <ol><li> Lavage à la main des chambres microfluidiques en 1% Alconox. Rincer trois fois avec de l&#39;eau Milli-Q pendant 30 min chacun. chambres à nouveau dans 70% d&#39;éthanol de lavage des mains. </li><li> Disposez chambres à sécher sur du parafilm dans la hotte à flux laminaire. Irradier et stériliser les deux côtés des chambres de 20 minutes sous UV. Magasin chambres stérilisée en 15 cm plat stérile scellée avec du parafilm à la température ambiante. </li><li> Placer 24 x 40 mm n ° 1 des lamelles de verre dans un récipient en verre. Tremper les lamelles de 35% de l&#39;acide chlorhydrique nuit sur un agitateur. Le jour suivant, les lamelles rincer trois fois pendant 30 minutes chacune avec de l&#39;eau. </li><li> Stériliser les lamelles couvre-objet, un par un en trempant chaque lamelle couvre-objet dans de l&#39;éthanol à 100% et plus de flammes d&#39;un brûleur Bunsen. Rangez les lamelles sèches dans une boîte de Pétri stérile et le laisser à température ambiante jusqu&#39;à ce que le revêtement. </li><li> Poser oust les lamelles dans une boîte de culture de 15 cm. Manteau de chaque lamelle avec 0,7 ml de 0,01% de poly-L-lysine (PLL) et incuber à la hotte à température ambiante. </li><li> Après 1 heure, rincez les lamelles à trois reprises avec de l&#39;eau stérile. Lamelles sèches avec vide et le lieu de chaque lamelle dans une boîte de culture de 6 cm. </li><li> Pour assembler la chambre microfluidique, placez la chambre à côté microsillon en bas sur la lamelle enduit PLL avec prudence pour ne pas toucher les microsillons. Doucement pressé vers le bas dans la chambre avec une pointe de pipette afin d&#39;assurer la chambre est hermétiquement scellée. </li></ol> 3. Dissection neuronale Culture et plaque sur les chambres <ol><li> Placez deux hippocampes E17-E18 rat (un cerveau) disséqués dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de tampon de dissection (HBSS, sans calcium, pas de magnésium, avec 1% stylo / angine et HEPES 10 mM. Rincer les tissus 3x avec 5 ml dissection tampon à chaque fois. Retirez le tampon de dissection autant que possible et ajouter 900 ul de di fraisssection tampon. </li><li> Pour digérer le tissu, ajouter 100 pl de 10x la trypsine (2,5%) dans le tampon de dissection à faire 1x concentration de travail. Placer le tube conique dans un bain d&#39;eau à 37 C °. Après 10 minutes de digestion, ajouter 100 ul de 10 mg / ml de DNase I à une concentration finale d&#39;environ 1 mg / ml. </li><li> En utilisant une pipette en verre de Pasteur polie au feu, triturer doucement les tissus par aspiration et refoulement 5-10x. Juste après trituration, étancher la trypsine avec 2 ml de placage milieu Neurobasal (avec 10% de FBS, 2 mM de Glutamax, 2% de B27). </li><li> Laisser l&#39;échantillon dans la hotte pendant 5 minutes pour permettre à tous les débris des tissus de s&#39;installer au fond. Retirez délicatement 2 ml de surnageant dans un tube de 15 ml conique stérile et centrifuger à 200 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules. Reprendre le culot dans 50 ul placage médias </li><li> Compter les cellules avec un hémocytomètre. Charge de 15 à 20 ul de suspension cellulaire (~ 40 000 cellules) dans un compartiment de la chambre microfluidique. Placer la chambredans l&#39;incubateur pendant 10 min pour permettre aux cellules de se fixer à la lamelle. Après 10 min, ajouter des médias plus placage de remplir les deux compartiments de la chambre. </li><li> Le deuxième jour de la dissection, remplacer complètement les milieux d&#39;étalement avec support de maintien (Neurobasal avec Glutamax 2 mM, 2% de B27) à la fois dans le corps de la cellule et le compartiment de l&#39;axone. Les axones des neurones de l&#39;hippocampe commencent à traverser les microsillons dans les jours 3 et atteindre le compartiment axone entre le jour 5-7. Au cours de cette période de temps, remplacer la moitié du milieu de culture avec des milieux d&#39;entretien frais tous les 24 ~ 48 h. </li></ol> 4. axonale Transport de QD-BDNF <ol><li> Avant de vivre l&#39;imagerie de QD-BDNF transport axonal, épuiser BDNF à la fois du corps cellulaire et l&#39;axone compartiments de la chambre microfluidique par rincer soigneusement les deux compartiments avec BDNF-libres, du milieu sans sérum Neurobasal toutes les 30 min pendant 2 h. </li><li> Au cours de BDNF épuisement, préparer les conjugués QD-BDNF. Mélanger 50 nM de mono-biotinylé BDNF dimère avec 50 nM conjugués QD655-streptavidine dans les médias Neurobasal et incuber sur de la glace pendant 60 min. </li><li> Retirez le support dans le compartiment axone et ajouter 300 ul QD-BDNF avec une concentration finale de 0,25 nM pendant 4 heures à 37 ° C. Pour réduire au minimum le diffuseur de QD-BDNF dans le compartiment du corps de la cellule, il est très important de maintenir toujours un niveau supérieur de support dans le compartiment du corps de la cellule que dans le compartiment de l&#39;axone. Laver non lié QD-BDNF après incubation avant l&#39;imagerie en direct. </li><li> Faire de l&#39;imagerie en temps réel des transports QD-BDNF l&#39;aide d&#39;un microscope inversé équipé d&#39;une huile 100X objectif. Chauffer le cadre et la chambre de l&#39;environnement qui s&#39;y rattachent à une température constante (37 ° C) et CO 2 (5%). Utilisez un ensemble de Texas cubes rouge d&#39;excitation / émission de visualiser le signal de QD655. </li><li> Acquérir et capturer des images en accéléré dans les axones moyen à la vitesse de 1 image / s pour un total de 2 min à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD. Utilisez microsillons sans axones that n&#39;ont pas QD et donc aucun signal de contrôle pour l&#39;infiltration. </li><li> Analyser le transport du BDNF utilisant n&#39;importe quel logiciel d&#39;analyse d&#39;image ou NIH ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1%2FMAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li>
<li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERK+Cascade%3A+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+cancer%22%5BJournal%5D)">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptors%3A+roles+in+neuronal+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trk receptors: roles in neuronal signal transduction.</a> Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).</li>
<li>Nonomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+and+survival+effects+of+BDNF+and+NT-3+on+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Developmental+brain+research%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells.</a> Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).</li>
<li>Weissmiller, A. M., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+using+neurotrophic+factors+to+treat+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders.</a> Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport+of+Rab7+GTPase+results+in+dysregulated+trophic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>Xie, W., Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+axonal+transport+of+quantum+dot+labeled+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).</li>
<li>Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated%2C+biologically+active+neurotrophic+factors%3A+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li>
<li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon%3A+a+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li>
<li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor%3A+a+slow+route+to+the+signaling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li>
<li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li>
<li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li>
<li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington%27s+disease+phenotypes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li>
<li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li>
<li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li>
<li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cette étude, nous rapportons le développement d&#39;une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. En conjuguant la protéine de quantum dot de la streptavidine, et en utilisant une chambre microfluidique, le procédé permet de détecter le transport axonal de BDNF dans les neurones primaires avec sensibilité molécule unique, en temps réel et avec une résolution spatiale et temporelle. Les outils utilisés dans ce d...

Les neurones sont des cellules dont la très processus long et souvent très élaborés sont fondamentales pour établir et maintenir la structure et la fonction des circuits neuronaux polarisés. L&#39;axone joue un rôle essentiel dans le transport de cargaisons à destination et à partir de synapses. Les protéines et organites synthétisés dans le corps cellulaire doivent être transportés à travers les axones pour atteindre la terminaison présynaptique pour soutenir la fonction neuronale. De même, les signaux reçus à axones distaux doivent être transduites et transmis au soma. Ces processus sont essentiels pour la survie neuronale, la différenciation et la maintenance. Dans ce transport axonal dans certains neurones doit être effectuée sur des distances de plus de 1 000 fois le diamètre du corps de la cellule, la possibilité est envisagée facilement que même de petites déficits pourraient avoir une incidence nettement la fonction neuronale et circuit. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membre de la famille des neurotrophines de facteurs de croissance, est présent en marégions du cerveau ny, y compris l&#39;hippocampe, le cortex cérébral, et cerveau antérieur basal. BDNF joue un rôle crucial dans la cognition et la mémoire formation en soutenant la survie, la différenciation et la fonction des neurones qui participent à des circuits cognitifs. BDNF se lie à son récepteur, le TrkB tyrosine kinase, à la terminaison axonale où il active les voies de signalisation TrkB médiée dont le mitogène protéine kinase activée / extracellulaire de la protéine kinase régulée par un signal (MAPK / ERK), le phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) et la phospholipase C-gamma (PLCy). Les protéines qui participent à ces voies de signalisation sont conditionnés sur des structures vésiculaires endocytose pour former l&#39;endosome 1-6, qui sont ensuite transportées de façon rétrograde vers le soma neuronal signalisation BDNF / TrkB. La chambre de culture microfluidique est une plate-forme très utile pour étudier la biologie des axones dans les conditions normales, ainsi que dans le cadre des lésions et des maladies 7,8. Par isoler les axonesde corps cellulaires, le dispositif a permis d&#39;étudier un transport spécifiquement dans les axones 8-10. Les plates-formes microfluidiques PDMS base avec 450 um barrières microsillons utilisées dans cette étude ont été achetés dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Pour d&#39;étudier le transport du BDNF, nous avons développé une nouvelle technologie pour produire monobiotinylé BDNF (mBtBDNF). Nous avons profité du peptide biotine accepteur, AP (également connu sous le nom AviTag). Il s&#39;agit d&#39;une séquence d&#39;acides 15 aminés qui contient un résidu de lysine qui peut être spécifiquement lié à un par la biotine ligase coli Escherichia enzyme biotine, BirA. Nous avons fusionné la AviTag à l&#39;extrémité C-terminale de la souris pré-proBDNF ADNc par PCR (figure 1A). La construction a été clonée dans le vecteur d&#39;expression de mammifère, pcDNA3.1-myc son vecteur. Nous avons également cloné l&#39;ADN BirA bactérienne dans le pCDNA3.1 myc son vecteur. Les deux plasmides ont été transitoirement co-transfectées dans des cellules HEK293FT d&#39;exprimer les deux protéines. BirA catalysé la ligature de Bioten particulier de la lysine résident dans le AviTag à l&#39;extrémité C-terminale de BDNF dans un rapport de 1: 1 pour produire monobiotinylé monomère BDNF. Biotinylé, BDNF matures avec une masse moléculaire de ~ 18 kDa a été récupéré et purifié à partir du support à l&#39;aide de résine Ni-(Figure 1C). La biotinylation du BDNF a été terminée, comme jugé par l&#39;incapacité à détecter BDNF non modifié par immunoblot (Figure 1D). Streptavidine points quantiques conjugués, QD 655, ont été utilisés pour étiqueter mBtBDNF faire QD-BDNF. La présence de la AviTag n&#39;interfère pas avec l&#39;activité de BDNF comme le mBtBDNF était capable d&#39;activer TrkB phosphorylée (figure 1E) et de stimuler la croissance des neurites (figure 1F), dans la mesure du BDNF humain recombinant (rhBDNF). Immunocoloration montré que QD-BDNF colocalisé avec TrkB dans les axones de l&#39;hippocampe, ce qui indique que QD-BDNF est bioactif (figure 1G). Pour étudier le transport du BDNF, QD-BDNF a été ajouté à distale compartiment axone d&#39;cultures microfluidiques contenant rat E18 neurones de l&#39;hippocampe (figure 2A). QD-BDNF transport rétrograde dans les axones a été capturé par imagerie en temps réel en direct de l&#39;étiquette fluorescente rouge (Soutien vidéos de S1, S2). En analysant le produit kymographe, QD-BDNF a été observée pour être transportée de manière rétrograde, à une vitesse de l&#39;ordre de 1,06 um / sec (figure 3A) en mouvement. GFP ou mCherry étiqueté BDNF ont été utilisés pour suivre le mouvement des axones de BDNF. Les principaux inconvénients sont qu&#39;ils ne sont pas assez brillant pour les études de molécules uniques. En outre, la présence à la fois antérograde et rétrograde BDNF mouvements, il est difficile d&#39;évaluer si oui ou non le BDNF a été transportée de manière rétrograde dans un complexe neurotrophine / récepteur. Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires. Le ultrabrightness et une excellente photostabilité de points quantiques makes permettant d&#39;effectuer un suivi à long terme du transport du BDNF. Ces techniques peuvent être exploitées pour améliorer les études de la fonction axonale dans AD, HD, et d&#39;autres maladies neurodégénératives.

<table><tbody><tr><td>Platine pfx ADN polymérase&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp ;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&nbsp ;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT cellules</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-média à haute teneur en glucose</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect ;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Résines Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase</td><td>cocktail Sigma</td><td>&nbsp ; S8820</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration à l’argent&nbsp ;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr> Chambres microfluidiques <tr><td>humaines recombinantes</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm n° 1 lamelles en verre&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&nbsp ;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-streptavidine conjugue</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp ; </td><td></td>Q10121MP</tr> anticorps <tr><td>anti-Avi tag</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>perles de streptavidine-agarose&nbsp ;</td><td>Technologie de la vie</td><td>&nbsp ; SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-streptavidine&nbsp ;</td><td>L’anticorps</td> anti-pTrkB <td>Thermo Scientific N100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>est un don généreux du Dr M. Chao de l’anticorps anti-TrkB de l’Université de New York,</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie en temps réel des axonale transport de quantum dot marqué bdnf dans les neurones primaires

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF joue un rôle important dans plusieurs aspects de la survie neuronale, la différenciation et la fonction. Les déficits structurels et fonctionnels dans les axones sont de plus en plus considérés comme une caractéristique précoce des maladies neurodégénératives, dont la maladie d&#39;Alzheimer (MA) et la maladie de Huntington (HD). Ne sait pas encore, c&#39;est le mécanisme (s) par lequel des lésions axonales est induite. Nous avons signalé le développement d&#39;une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. Quantum dot marqué BDNF (QD-BDNF) a été produit par la conjugaison de points quantiques 655 à mBtBDNF. Un dispositif microfluidique a été utilisé pour isoler les axones des corps cellulaires des neurones. Ajout de QD-BDNF dans le compartiment axonal permis imagerie en temps réel du transport du BDNF dans les axones. Nous avons démontré que QD-BDNF déplacé essentiellement exclusivement rétrograde, avec très peu de pauses, à une vitesse de l&#39;ordre de 1,06 um / s en mouvement. Ce système peut être utilisé pour enquêter sur moicanismes de la fonction axonale perturbé dans AD ou HD, ainsi que d&#39;autres maladies dégénératives.

Production et purification de biologiquement active BDNF Mono-biotinylé Le vecteur d'expression de BDNF fusionnée avec une séquence AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) a été réalisé selon un protocole précédemment publié 10. La masse moléculaire de la protéine de fusion pleine longueur a été prévue pour être ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) monobiotinylé BDNF mûr avec une masse moléculaire prédite de ...

Le transport axonal de BDNF, un facteur neurotrophique, est essentiel pour la survie et la fonction de plusieurs populations neuronales. Certaines maladies dégénératives sont marqués par la rupture de la structure et de la fonction axonale. Nous avons démontré les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires.

Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

L’objectif global de cette procédure est de suivre le transport axonal rétrograde du facteur neurotrophique dérivé du cerveau ou BDNF par imagerie en direct. Ceci est accompli en assemblant d’abord des chambres microfluidiques sur des lamelles recouvertes de polylysine. Dans la deuxième étape, les neurones de l’hippocampe du rat E 18 dissocié sont disséqués et plaqués dans le compartiment du corps cellulaire de la chambre microfluidique.Ensuite, les neurones sont cultivés pour permettre l’extension des axones à travers les micro-sillons dans le compartiment axonal de la chambre. Dans la dernière étape, un point quantique étiqueté BDNF est ajouté au compartiment axonal. En fin de compte, la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour évaluer le mouvement du BDNF dans les axones du neurone de l’hippocampe.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que B-D-F-E-G-I-P ou le marquage BDFM est que le marquage BDF avec une boîte quantique permet l’imagerie lumineuse d’un seul dimère BDF dans les axones, démontrant que la procédure sera, sera. Tracez un point de poteau à partir de mes trois gauches, commencez par laver à la main les chambres m

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Imagerie des cellules vivantes est d'une utilité particulière lorsque l'on étudie la dynamique du trafic des organelles. Nous décrivons ici un protocole d'imagerie en temps réel du noyau dense vésicules dans des neurones cultivés en utilisant la microscopie à fluorescence à champ large. Ce protocole est flexible et peut être adaptée aux organites autre image tels que les mitochondries, les endosomes, et les peroxysomes.

Imagerie en temps réel du noyau dense de vésicules cultures primaires neurones de l&#39;hippocampe

Ce protocole traite de la dissection en direct...

Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire

Source : Winkle, C. C., et al. Utilisation de méthodologies combinées pour définir le rôle de l’administration de la membrane plasmique lors de la ramification des axones et de la morphogenèse neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une technique d’imagerie en direct utilisant la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) pour observer en temps réel la ramification axonale dans les neurones corticaux. Des vidéos en accéléré capturent les effets du traitement par la...

Imagerie in vitro en temps réel de la ramification axonale dans les neurones corticaux de souris

Ici, nous décrivons la méthode que nous avons employée pour imager la filodose dendritique fortement motivoir dans une préparation en direct du cerveau larvaire de Drosophila, et le protocole que nous avons développé pour quantifier des ensembles de données d'imagerie 3D de time-lapse pour des évaluations quantitatives du dendrite dynamique dans le développement des neurones.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans les cellules HEK293 d’une manière rentable et est purifié par la chromatographie d’affinité. BDNFavi est alors directement mono-biotinylé avec l’enzyme BirA dans un tube. BDNFavi et BDNFavi mono-biotinylés conservent leur activité biologique par rapport au BDNF disponible dans le commerce.

Un protocole amélioré pour purifier et directement mono-biotinylate recombinant BDNF dans un tube pour les études de trafic cellulaire dans les neurones

Nous décrivons des méthodes de photoactivation de fluorescence pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones myélinis simples des nerfs périphériques des souris transgéniques qui expriment une protéine de neurofilament photoactivatable.

Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée

Nous présentons ici une méthode pour étudier la morphogenèse des neurites dans les explants rétiniens postnatals de souris par microscopie confocale time-lapse. Nous décrivons une approche pour le marquage clairsemé et l’acquisition de types de cellules rétiniennes et de leurs processus fins en utilisant des vecteurs de virus adéno-associés recombinants qui expriment des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre.

Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées

À l’aide de souris fluorescentes transgéniques, des protocoles détaillés sont décrits pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones moteurs et sensoriels du nerf sciatique intact chez les animaux vivants.

Élargir la boîte à outils pour l’imagerie in vivo du transport axonal

Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.

Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

L’article décrit l’optimisation des paramètres d’acquisition de la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de cargaisons endogènes marquées à une résolution de neurone unique chez un nématode vivant.

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

Découvrez l'imagerie en temps réel du transport axonal rétrograde du BDNF dans les neurones hippocampiques de rat. Cette méthode microfluidique permet de suivre les dynamiques des facteurs neurotrophiques avec une précision inégalée.

Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

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