Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

L’objectif global de cette procédure est de suivre le transport axonal rétrograde du facteur neurotrophique dérivé du cerveau ou BDNF par imagerie en direct. Ceci est accompli en assemblant d’abord des chambres microfluidiques sur des lamelles recouvertes de polylysine. Dans la deuxième étape, les neurones de l’hippocampe du rat E 18 dissocié sont disséqués et plaqués dans le compartiment du corps cellulaire de la chambre microfluidique.

Ensuite, les neurones sont cultivés pour permettre l’extension des axones à travers les micro-sillons dans le compartiment axonal de la chambre. Dans la dernière étape, un point quantique étiqueté BDNF est ajouté au compartiment axonal. En fin de compte, la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour évaluer le mouvement du BDNF dans les axones du neurone de l’hippocampe.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que B-D-F-E-G-I-P ou le marquage BDFM est que le marquage BDF avec une boîte quantique permet l’imagerie lumineuse d’un seul dimère BDF dans les axones, démontrant que la procédure sera, sera. Tracez un point de poteau à partir de mes trois gauches, commencez par laver à la main les chambres microfluidiques à 1 %aox, suivi de trois rinçages de 30 minutes à l’eau milli Q. Ensuite, après avoir lavé à la main les chambres à l’éthanol à 70 %, étendez-les pour les faire sécher sur des param dans une hotte à flux laminaire, stérilisez les deux côtés des chambres sous lumière UV pendant 20 minutes, puis stockez les chambres rayonnées dans un plat stérile de 15 centimètres scellé avec des param à température ambiante.

Ensuite, trempez 24 x 40 millimètres. Le couvercle en verre numéro un se glisse dans de l’acide chlorhydrique à 10 % pendant la nuit sur un rotateur, suivi de trois lavages de 30 minutes avec de l’eau après le dernier lavage. Stérilisez chaque lamelle avec un trempage dans de l’éthanol à 100 %, puis flambez-les sur un bec Bunsen et conservez-les au sec dans une boîte de Pétri stérile à température ambiante.

Pour enrober les lamelles, déposez-les dans un plat de culture de 15 centimètres, puis superposez-les avec 0,7 millilitre de lysine à 0,01 % de poly L. Après une incubation d’une heure dans la hotte de culture tissulaire, rincez à nouveau les lamelles trois fois à l’eau stérile, puis séchez-les sous vide et placez-les dans une boîte de culture de six centimètres. Placez ensuite l’une des chambres stérilisées avec le côté de la micro-rainure vers le bas sur une lamelle recouverte de lysine poly L.

En prenant soin de ne pas toucher les micro-rainures et en utilisant une pointe de micro-pipette pour appuyer doucement sur la chambre et fermer hermétiquement la chambre microfluidique assemblée. Placez maintenant deux Hippo Campi de rat E 17 à E 18 dans un tube conique de 15 millilitres contenant deux millilitres de tampon de dissection et rincez les tissus trois fois avec cinq millilitres de tampon de dissection à chaque fois. Ensuite, retirez autant de nettoyant que possible et ajoutez 900 microlitres de tampon de dissection frais pour digérer le tissu.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de trypsine à 2,5 % dans les mouchoirs et placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes de digestion, ajoutez 100 microlitres d’ADN et utilisez une pipette en verre PE poli au feu pour trier doucement les tissus de haut en bas cinq à 10 fois immédiatement après le mélange. Trempez l’essai avec deux millilitres de milieu de placage et laissez les débris se déposer au fond du tube pendant cinq minutes dans le capot de culture tissulaire.

Ensuite, transférez soigneusement deux millilitres de surnageant dans un tube conique propre et stérile de 15 millilitres et faites tourner les cellules réusées. Mettez la pastille en suspension dans 50 microlitres de milieu de placage, puis après comptage, chargez 15 à 20 microlitres de suspension cellulaire dans un compartiment de la chambre microfluidique. Incuber la chambre pendant 10 minutes pour permettre aux cellules de se fixer à la lamelle, puis ajoutez plus de milieu de placage pour remplir les deux compartiments de la chambre.

Après un jour d’incubation, remplacez le milieu de placage par un milieu d’entretien dans le corps cellulaire et les compartiments axonaux. Le troisième jour, les axones des neurones de l’hippocampe commencent à traverser les micro-sillons pour atteindre le compartiment axonal entre les jours cinq et sept. Pendant ce temps, remplacez la moitié du milieu de culture par un nouveau milieu d’entretien toutes les 24 à 48 heures avant l’imagerie en direct du transport axonal BDNF marqué quantiquement.

Rincez abondamment les deux compartiments de la chambre microfluidique avec un milieu neurobasal libre de sérum libre BDNF toutes les 30 minutes pendant deux heures pendant l’épuisement du BDNF, incubez 50 dimères BDNF mono biotinylés nano molaires avec un quantum de 50 nano molaires. Faites 6, 5, 5 conjugués de strippin dans le milieu neurobasal sur de la glace pendant 60 minutes. Ensuite, remplacez le milieu dans le compartiment axonal par 300 microlitres de point quantique marqué BDNF pendant quatre heures à 37 degrés Celsius pour minimiser la diffusion de point quantique marqué BDNF dans le compartiment du corps cellulaire.

Il est très important de toujours maintenir un niveau de milieu plus élevé dans le compartiment du corps cellulaire que dans le compartiment axonal à la fin de l’incubation, de l’échauffement et du microscope inversé, équipé d’un objectif à huile 100 x et d’une chambre environnementale à une température constante de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant que l’équipement se réchauffe. Lavez le point quantique non lié étiqueté BDNF de la chambre microfluidique, puis utilisez un ensemble de cubes d’excitation et d’émission rouge Texas pour visualiser le signal de point quantique 6 5 5. Enfin, utilisez une caméra CCD pour capturer des images en accéléré dans les axones moyens à la vitesse d’une image par seconde pendant un total de deux minutes.

Utilisez des micro-sillons sans axones qui n’ont pas de QD comme contrôle de l’infiltration et analysez le transport BDNF à l’aide du logiciel d’analyse d’image approprié dans l’imagerie time-lapse du transport du signal BDNF étiqueté BDNF Les signaux de points quantiques sont observés dans la plupart des micro-sillons avec axones, tandis qu’aucun signal quantique n’est visible dans les micro-sillons sans axones, indiquant peu ou pas de diffusion du signal de point quantique du compartiment axonal au compartiment du corps cellulaire ici. Un segment de 80 micromètres de long d’un axone neuronal de l’hippocampe a été enregistré par fluorescence pendant 100 secondes. Un total de six.

Des signaux quantiques BDNF ont été clairement notés au cours de l’imagerie, dont trois se déplaçant unilatéralement vers le corps cellulaire. On a observé qu’un signal se déplaçait en douceur vers le corps cellulaire, traversant tout le champ en environ 70 secondes. Un autre a été observé se déplacer dans une direction rétrograde pendant les 20 premières secondes, passer en mouvement antrograde pendant 10 à 20 secondes, puis changer à nouveau de direction vers le corps cellulaire pendant les 20 dernières secondes.

Il a également été noté que le troisième événement se déplaçait dans une direction rétrograde, mais qu’il s’arrêtait ensuite pendant environ 20 secondes au milieu du mouvement. Dans ce premier graphique en carillon représentatif du transport BDNF marqué par un point quantique, le point quantique étiqueté BDNF s’est déplacé rapidement et en douceur vers le corps cellulaire en franchissant le champ de 80 micromètres en environ 60 secondes. Avec de très brèves pauses dans ce deuxième chronographe, le BDNF quantique a parcouru environ 50 micromètres en 120 secondes dans une direction rétrograde avec au moins trois segments de pauses plus longues.

Enfin, les nuages de points mesurent la vitesse en mouvement, la vitesse moyenne et le temps de pause de chaque point quantique étiqueté BDNF. Les vitesses de déplacement du point quantique étiqueté BDNF étaient relativement rapides, allant de 0,47 à 1,97 micromètre par seconde, avec une moyenne de 1,06 plus ou moins 0,05 micromètre par seconde. En raison de la pause du BDNF pendant le transport, la vitesse moyenne était beaucoup plus basse que la vitesse en mouvement avec une moyenne de 0,48 plus ou moins 0,03 micromètres par seconde avec une durée moyenne de pauses de 15,88 plus ou moins 1,30 seconde après le développement.

Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine des neurosciences d’explorer la neurotrophine et le trafic des récepteurs dans les neurones sains et malades.