Name: Infusions de lartère carotide pour pharmacocinétiques et pharmacodynamiques Analyse des taxanes chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Apprenez à réaliser des infusions par artère carotide chez la souris pour analyser la pharmacocinétique des taxanes. Cette méthode utilise un cathéter sur mesure et une pompe automatisée pour une administration contrôlée.

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Nous tenons à remercier le Fonds FCCC des animaux de laboratoire pour leur soutien dans ce projet. Nous remercions Wolfe Laboratories, Inc. pour leur aide dans l&#39;analyse des niveaux de paclitaxel dans le plasma et les tissus. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde K01CA120091 à EHB et CA06927 à Fox Chase Cancer Center.

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Les auteurs ont rien à divulguer.

Perfusion de l&#39;artère carotide est une technique importante dans cette étude de pharmacocinétique du paclitaxel. Perfusion de l&#39;artère carotide est une méthode pour distribuer rapidement drogue dans tout le système circulatoire 14. La perfusion de 3 heures est un synoptique plus proche de l&#39;administration clinique des médicaments tels que les taxanes que les injections de bolus. La chirurgie peut être réalisée de manière fiable par une seule personne, le temps de chirurgie est relativement courte,...

perfusion de médicament à travers la carotide peut être effectuée de manière fiable et reproductible en optimisant l&#39;équipement et la technique. La procédure est complexe pas, même si elle ne nécessite un contrôle précis et une attention aux détails. Soins de qualité supérieure et la dextérité sont nécessaires pour isoler l&#39;artère carotide et insérer le cathéter, qui peuvent généralement être acquis par la pratique. Chirurgie par un technicien expérimenté ne doit pas dépasser une heure. Après une chirurgie réussie, la souris doit être normal et en bonne santé (bien que la souris peut réagir à la perfusion réelle de la drogue), et la drogue (s) peut être administré dans un dosage continu uniforme contrôlée. Les échantillons de sang doivent être prélevés sur un site autre que l&#39;artère carotide; saignements rétro-orbitaire été facile de recueillir et satisfaisante pour l&#39;analyse des concentrations de médicament. Cathéters de taille optimale et la forme sont un atout précieux dans la réalisation d&#39;une perfusion de succès 11. Nous avons trouvé la cathéters disponible commercially souvent d&#39;être trop grande et / ou trop souple pour permettre un accès facile à l&#39;artère carotide de souris. Il est avéré préférable de cathéters de mode du tube de polyéthylène utilisé pour connecter la souris à la seringue de perfusion. Ainsi, tous les tubes, raccords et les aiguilles étaient de dimensions cohérentes, qui a simplifié ensemble d&#39;infusion. En utilisant cette technique, il est nécessaire de pousser la pointe du cathéter dans l&#39;artère au-delà du point où il est encore visible, et le flux sanguin dans l&#39;artère carotide est pas restauré avant que le cathéter est initialement fixé. Cela réduit les risques de perforation de l&#39;artère ou d&#39;avoir le cathéter poussé par la haute pression du flux sanguin. La conception de cathéter document ne comporte pas de &quot;bosse&quot; pour le maintenir en place, en assurant ainsi le cathéter bien avec des sutures et ruban chirurgical est une priorité. Infusions peuvent être préférables aux injections en bolus iv communs, comme un meilleur imitateur de l&#39;administration clinique deles médicaments tels que les taxanes 3, 12, 13. La technique décrite ici a été initialement mis au point pour permettre une perfusion dans des modèles de souris, dans lequel l&#39;accès à la veine jugulaire ou fémorale a été empêchée par la croissance de la tumeur mammaire et / ou la vascularisation excessive de la zone d&#39;insertion. Cette méthode peut souvent être appropriée, même chez les souris sans tumeur: bien isoler et cathétérisme de la carotide est légèrement plus invasive, nous avons trouvé qu&#39;il est préférable de la jugulaire, car la propension de la paroi jugulaire de ripper abouti à des insertions et des échecs pour mener à bien plus défaillants l&#39;évolution dans le temps de trois heures. Bien que les résultats présentés ici sont de C57BL / 6J (dans maison de race-) souris, nous avons utilisé cette technique pour insuffler avec succès paclitaxel dans plusieurs souches de souris, y compris FVB et mixtes souches, de suivre la pharmacocinétique chez des modèles de souris transgénique manipulés à réguler à la baisse fonctions transporteurs cellulaires. Les échantillons de sang et de tissus prélevés ont montré des niveaux attendus de paclitaxel, dans la gamme des niveaux observés après une perfusion jugulaire 1. Cette technique peut être appelé à travailler aussi bien dans d&#39;autres modèles de souris et avec d&#39;autres solutions pour perfusion.

<table><tbody><tr><td>Tube en polyéthylène 0,024" Diamètre extérieur X 0,011 po ID&nbsp ;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>PE10</td><td></td></tr><tr><td>3 Aiguilles émoussées (calibre 30)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>NB-30</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur de port en acier inoxydable (calibre 28)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>PP-28</td><td>Légèrement plus grand que le diamètre intérieur des tubes en PE, pour s’adapter parfaitement et garder une étanchéité parfaite.</td></tr><tr><td>2 fiches de connexion en acier inoxydable (calibre 30)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>C-30</td><td></td></tr><tr><td>Trois seringues de 1 cc</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Solution saline stérile à 0,9 %</td><td>Hospira</td><td>0409-7984-37</td><td></td></tr><tr><td>Cath-Loc HGS Solution d’héparine/glycérol</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td>Suture <td>en soie HGS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>SUT-S&nbsp ; 113</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Vanna (micro-ciseaux)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14122</td><td>Ce modèle a une pointe incurvée, mais les ciseaux à pointe droite fonctionnent également.</td></tr><tr><td>Hartman Mesquito Pince hémostatique</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Swabsticks</td><td>Perdue Products L.P.</td><td>BSWS1S</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaïne</td><td>Hospira</td><td>0409-1160-01</td><td>Peut être remplacé par de la lidocaïne ou une anesthésie locale similaire.</td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>LC Laboratories</td><td>P-9600</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Hématocrite Tubes Capillaires, Hépariné</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tube Capillaire Sealant&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-678</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J souris</td><td>Fox Chase Cancer Center, Laboratoire Animal Facility spetromètre de masse API</td> 4000 Q-Trap élevé en interne <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

infusions de l&#39;artère carotide pour pharmacocinétiques et pharmacodynamiques analyse des taxanes chez la souris

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Au moment de proposer l&#39;utilisation d&#39;un médicament, la combinaison de médicaments, ou l&#39;administration de médicaments dans un nouveau système, il faut évaluer la pharmacocinétique du médicament dans le modèle d&#39;étude. Parce que l&#39;utilisation de modèles de souris sont souvent une étape essentielle dans la découverte de médicaments préclinique et le développement de médicaments 1-8, il est nécessaire de concevoir un système pour introduire des médicaments dans des souris dans une manière uniforme, reproductible. Idéalement, le système devrait permettre la collecte des échantillons de sang à intervalles réguliers au cours d&#39;une évolution dans le temps de consigne. La capacité de mesurer les concentrations de médicament par spectrométrie de masse, a permis aux enquêteurs de suivre les changements dans les niveaux plasmatiques du médicament au fil du temps chez les souris individu 1, 9, 10. Dans cette étude, le paclitaxel a été introduit dans des souris transgéniques comme une perfusion artérielle continue sur trois heures, tandis que les échantillons de sang ont été prélevés en même temps par des saignements rétro-orbital à des instants de consigne. Infusions de l&#39;artère carotide sont une alternative potentielle aux perfusions de veine jugulaire, lorsque des facteurs tels quetumeurs mammaires et d&#39;autres obstacles infusions jugulaires impraticable. En utilisant cette technique, les concentrations de paclitaxel dans le plasma et les tissus ont atteint des niveaux similaires à celles obtenues à perfusion jugulaire. Dans ce tutoriel, nous allons démontrer comment son cathéter avec succès l&#39;artère carotide par la préparation d&#39;un cathéter optimisé pour chaque modèle de la souris, puis montrer comment insérer et fixer le cathéter dans l&#39;artère carotide de souris, passer la fin du cathéter à travers l&#39;arrière du cou de la souris, et brancher la souris à une pompe pour fournir une vitesse contrôlée de médicament afflux. Saignements rétro-orbital à faible volume multiples permettent l&#39;analyse des concentrations plasmatiques du médicament au fil du temps.

Répartition de paclitaxel suit modèles prévisibles pendant 3 heures un schéma posologique d'une injection à grande vitesse 15 min, suivie d'une perfusion à faible vitesse de 165 min. La figure 1 montre une comparaison de la veine-perfusion de paclitaxel concentrations de plasma jugulaire et l'artère carotide-infusions. Les concentrations de paclitaxel tombent rapidement dans les 15 premières minutes après une perfusion de grand volume initial, puis se stabilisent au cours de...

Cette méthode a été développée dans le but de fournir une solution stable de médicament via l&#39;artère carotide, pour évaluer la pharmacocinétique de nouveaux médicaments dans des modèles murins.

Infusions de l&#39;artère carotide pour pharmacocinétiques et pharmacodynamiques Analyse des taxanes chez la souris

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

L’objectif global de cette procédure est d’injecter un médicament d’intérêt à travers l’artère carotide afin d’analyser le profil pharmacocinétique du médicament. Ceci est accompli en fabriquant d’abord un cathéter personnalisé à partir d’un tube en polyéthylène, puis en fixant le cathéter dans l’artère carotide de la souris. Ensuite, la souris est attachée à une pompe à perfusion automatisée via le cathéter de l’artère carotide.Dans la dernière étape, le médicament est injecté dans la souris à un rythme régulier et des échantillons de sang sont prélevés à intervalles réguliers. En fin de compte, la chromatographie liquide, la spectrométrie de masse est utilisée pour déterminer la concentration du médicament dans les échantillons de tissu et de plasma. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le bolus, l’injection intrapéritonéale ou l’injection dans la veine caudale ou la perfusion jugulaire, est qu’elle est représentative des débits de perfusion cliniques, et qu’elle est généralement plus facile à réaliser que l’insertion jugulaire.Cette méthode peut répondre à des questions clés en pharmacologie, telles que la distribution in vivo d’un médicament, ou nous pouvons déterminer si un inhibiteur ou un modulateur a un impact sur la fonction de la protéine. Pour préparer un cathéter pour l’expérience, établissez d’abord une flamme basse et constante sur un bec Bunsen. Tenez ensuite un morceau de tube près de la flamme pour ramollir le polyéthylène.Lorsque le tube commence à fondre, séparez lentement les deux extrémités pour créer une fine section de tube d’environ 0,25 millimètre de diamètre. Ensuite, coupez une extrémité biseautée dans le tube à environ 0,75 centimètre le long de la section mince, puis passez rapidement l’extrémité à travers la flamme pour la faire s’arrondir et s’agrandir. L’embout s’accrochera légèrement, ce qui aidera à ancrer le tube lors de l’insertion dans l’artère.Coupez le tube à 6,0 centimètres du point où il commence à s’amincir pour faire un cathéter, puis remplissez une seringue équipée d’une aiguille émoussée avec 200 microlitres de solution d’héparine. Insérez l’aiguille dans l’extrémité large du cathéter et remplissez le cathéter d’héparine. En prenant soin d’éviter les bulles.Rangez ensuite l’aiguille et le cathéter dans un endroit stérile pour isoler l’artère carotide. Commencez par faire une coupe longitudinale d’un centimètre légèrement à droite de la ligne médiane du cou de l’animal, puis utilisez une pince pour séparer la graisse et le muscle et exposer la trachée. L’artère carotide est parallèle à la trachée.Ensuite, séparez soigneusement le fascia recouvrant l’artère, puis écartez légèrement le nerf VA. Insérez la pince dans l’espace entre l’artère carotide et le nerf VA, et ouvrez doucement la pince pour créer un espace dans le facia. Retirez délicatement le nerf de l’artère, en dégageant un espace entre la fourche de l’extrémité antérieure près du larynx et l’extrémité postérieure la plus exposée, en isolant une longueur d’artère d’au moins trois millimètres.Ensuite, à l’aide d’une pince, tirez un fil de suture en soie sous l’artère et faites un nœud sécurisé pour fermer l’artère aussi loin que possible vers l’extrémité antérieure. Après avoir placé un deuxième fil, faites un nœud rétractable pour fermer temporairement l’artère aussi loin que possible vers l’extrémité postérieure. Ensuite, utilisez un troisième fil pour faire un nœud très lâche entre les deux premières sutures à utiliser pour fixer rapidement le cathéter après la mise en place.Pour insérer le cathéter, saisissez le nœud de suture inférieur pour tirer l’artère légèrement tendue. Ensuite, entaillez l’artère au-dessus et très près de la suture antérieure. En prenant soin de ne pas couper trop profondément.Vérifiez la fente pour vous assurer que l’ouverture n’est pas obstruée. Retirez le cathéter rempli d’héparine de l’aiguille de la seringue, puis prenez soin de ne pas créer de grandes poches d’air. À chaque extrémité, manipulez le cathéter pour positionner l’extrémité biseautée à un angle confortable vers le bas et légèrement vers la main dominante.Ensuite, tout en tenant la suture, pour maintenir l’artère légèrement tendue, insérez doucement le cathéter dans la fente. Ensuite, à l’aide de la pince, saisissez le nœud de suture antérieur et tirez doucement l’artère vers le bas sur le cathéter. Relâchez avec précaution le cathéter et la suture antérieure.Serrez ensuite le nœud du milieu pour fixer le cathéter près de l’entrée du cathéter dans l’artère tout en prenant soin de ne pas obstruer l’écoulement à travers le cathéter. Faites un triple nœud serré avec la suture centrale, puis utilisez la suture antérieure pour fixer le cathéter en place sous l’entrée de l’artère. Utilisez maintenant une fiche de connecteur pour fixer une sonde saline au cathéter en prenant soin de ne pas créer de bulles.Saisissez ensuite les extrémités de la suture postérieure et tirez-la doucement pour libérer le nœud, manœuvrez la suture le long de l’artère et sur l’extrémité du cathéter sans retirer le fil. Le sang doit circuler dans le cathéter lorsque le flux semble dégagé. Utilisez le fil de la suture postérieure pour faire un nœud supplémentaire légèrement au-dessus de la suture médiane.Ensuite, rincez le cathéter du sang et utilisez un hémostat pour serrer l’extrémité du cathéter près de la fiche du connecteur. Remplacez le connecteur par un bouchon de port pour sceller l’extrémité du cathéter et retirer l’hémostat. Ensuite, utilisez une paire de pinces pour tenir le cathéter juste en dessous de la suture antérieure, et une autre pince pour enfoncer un pli dans le cathéter afin qu’il se plie facilement sur le côté après avoir créé un deuxième pli.De la même manière, tournez la souris sur son côté gauche et nettoyez la zone en dessous et juste derrière l’oreille de l’animal avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée. Lorsque la zone a été désinfectée, faites une petite incision de quatre millimètres dans la peau. Ensuite, utilisez une pince pour maintenir ouvert le lambeau de tissu et travaillez une sonde creuse émoussée sous la peau pour créer un canal à travers la joue jusqu’à la cavité du cou.Utilisez la pince pour libérer soigneusement un espace pour la sortie de la sonde, puis enfilez doucement le bouchon de port et le cathéter à travers la sonde jusqu’au trou de sortie. En prenant soin de ne pas écraser ou resserrer les vaisseaux sanguins ou les organes après que l’animal a été laissé se rétablir pendant 30 à 60 minutes, fixez une aiguille émoussée à l’une des extrémités d’un morceau de tube en polyéthylène de 40 centimètres et un port de connecteur à l’autre. Ensuite, aspirez le médicament d’intérêt dans une seringue dont le diamètre intérieur est connu.Fixez l’aiguille à la seringue et chargez le médicament à travers l’aiguille et la tubulure. Après avoir placé la seringue dans la pompe, selon les instructions du fabricant, amorcez la pompe de manière à ce que le médicament s’écoule en douceur hors du connecteur. Branchez ensuite pour connecter l’animal à la pompe, maintenez la souris stable et utilisez l’hémostat pour serrer le cathéter près du bouchon du port.Enfin, remplacez la fiche par un connecteur fixé à la seringue et au tube. Administrez rapidement une pompe rapide pour dégager le volume du cathéter, puis passez immédiatement au débit de perfusion souhaité. Dans cette première figure, une comparaison de la concentration plasmatique de Paclitaxel après perfusion de la veine jugulaire et perfusion de l’artère carotide est présentée.La concentration du médicament chute rapidement dans les 15 premières minutes suivant une perfusion initiale à haut volume, puis se stabilise au cours des 150 minutes suivantes. En comparaison, les niveaux de paclitaxel dans une perfusion médiocre commencent relativement bas et oscillent de haut en bas tout au long du test, très probablement en raison d’un blocage de la ligne au début de la perfusion. Ici, les niveaux relatifs de paclitaxel dans le foie, le cerveau et le plasma sanguin à la fin d’une perfusion de trois heures sont montrés Comme prévu, l’animal présente une liaison élevée aux protéines plasmatiques, associée à de faibles concentrations de médicament dans le tissu cérébral Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre 45 à 60 minutes si elle est correctement exécutée.Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une artère carotide, d’insérer un cathéter et d’effectuer une perfusion.

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Les tumeurs du système nerveux central (SNC) sont la principale cause de décès liés au cancer chez les enfants, et les thérapies immunitaires locorégionales sont de plus en plus testées pour les patients dans les essais cliniques. Ce protocole décrit des méthodes d’implantation de canules locorégionales chez la souris pour l’évaluation préclinique de perfusions immunothérapeutiques ciblant les tumeurs du SNC.

Implantation intracrânienne de canules pour des perfusions de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) locorégional en série chez la souris

La réparation de l’artère intracarotide dans un modèle murin après injection ramène le flux sanguin vers l’artère sans affecter négativement la distribution du matériau injecté. La réparation du site d’injection facilite les injections ultérieures par la même artère et prévient l’ischémie cérébrale chez les souches de souris qui n’ont pas un cercle complet de Willis.

Facilitation des injections intracarotidiennes répétées dans des modèles murins par une nouvelle technique de réparation du site d’injection

Le présent protocole décrit une méthode chirurgicale standardisée pour l’induction d’anévrismes carotidiens dans un modèle murin par une seule opération chirurgicale.

Un modèle murin de la formation d’un anévrisme carotidien

Apprenez à réaliser des infusions par artère carotide chez la souris pour analyser la pharmacocinétique des taxanes. Cette méthode utilise un cathéter sur mesure et une pompe automatisée pour une administration contrôlée.

Infusions de l'artère carotide pour pharmacocinétiques et pharmacodynamiques Analyse des taxanes chez la souris

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