Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

L’objectif général de l’expérience suivante est de démontrer une interaction entre les récepteurs des protéines à l’aide du plasma de surface et de la résonance. Ceci est réalisé par l’injection des ions nickel sur la matrice de l’acide nitrotri-acétique ou NT a. Ensuite, l’une des protéines, appelée ligand, est immobilisée sur la puce du capteur à la suite d’une injection à blanc.

La deuxième protéine, appelée analyte, est injectée sur le ligand immobilisé. Afin de détecter une interaction entre les deux protéines, les résultats montrent que les deux protéines interagissent transitoirement : l’analyte s’associe et se dissocie du ligand. L’affinité de l’interaction peut être calculée sur la base des taux de dissociation et de dissociation mesurés des deux protéines.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le pull-down ou l’immunoprécipitation, est qu’elle peut identifier des interactions transitoires ou de faible affinité qui ont souvent de grandes conséquences biologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biochimie, par exemple si la protéine d’intérêt se lie à une autre protéine ou à une autre petite molécule, la nature de l’interaction peut être déterminée et l’affinité peut être mesurée. Pour préparer l’échantillon, prélever tous les agrégats de la protéine purifiée comme décrit dans le protocole textuel.

Préparez le tampon de fonctionnement et filtrez tous les tampons et échantillons de protéines à l’aide de filtres à point zéro de 22 microns. Assurez-vous à l’avance que les filtres sont compatibles avec les protéines avant de connecter la bouteille tampon en marche à l’entrée de la pompe. Gardez de côté 10 millilitres de tampon de coulage dans un tube séparé.

Diluez ensuite les échantillons contre la mémoire tampon en cours d’exécution pour éviter les incohérences de mémoire tampon. En règle générale, pour une démobilisation stable des ligands, utilisez de faibles concentrations de ligands avec des injections plus longues à faible débit par opposition à des concentrations élevées de ligands Avec des injections plus courtes à haut débit Diluez le stock de ligands concentré dans un tampon courant jusqu’à une concentration finale d’environ 20 microgrammes par millilitre. Enfin, diluez l’analyte dans le tampon de coulée à la concentration souhaitée.

Pour un système d’affinité inconnue, testez une gamme de concentrations d’analytes allant de 10 micromolaires à 10 anomolaires dans des dilutions décuplées. Dans cette démonstration, une puce couplée NTA adaptée à la capture de protéines avec un marqueur d’oli histidine est réutilisée. Après avoir retiré la puce stockée du tampon, rincez-la abondamment à l’eau distillée doublement, séchez-la doucement et placez-la dans sa gaine d’origine.

Pour ancrer la puce sur l’instrument SPR, ouvrez la porte de la puce du capteur et placez la puce dans sa gaine. Fermez la porte et appuyez sur la puce de la station d’accueil. Réglez la température de la pile de la puce à 25 degrés Celsius.

Réglez le compartiment des échantillons à sept degrés Celsius pour maintenir la protéine stable tout au long de l’expérience. Après avoir préparé les solutions pour le chargement et le dénudage comme décrit dans le protocole texte, amorcez l’instrument SPR avec la mémoire tampon en cours d’exécution. Pour l’étape suivante, réglez le débit à 50 microlitres par minute.

Définissez les chemins d’écoulement et la soustraction de référence pour obtenir les résultats décrits ici. Définissez les chemins d’accès à la cellule d’écoulement numéro un, à la cellule d’écoulement numéro deux et à la cellule d’écoulement numéro un, soustraits de la cellule d’écoulement numéro deux, après avoir sélectionné le support d’échantillons approprié, enregistrez le fichier de résultats avant de commencer l’expérience afin que les données soient sauvegardées pendant l’exécution. Chaque expérience est composée de cycles.

Gardez une trace claire des injections effectuées dans chaque cycle et séparez les ligands chargeant l’injection à blanc du tampon et l’injection d’analyte dans différents cycles. Le premier cycle est la préparation des copeaux et le chargement du nickel. Assurez-vous que le débit et les voies sont réglés, puis injectez 350 millimolaires d’EDTA pendant une minute pour éliminer les molécules restantes.

Ensuite, réglez le débit à 10 microlitres par minute. Injectez ensuite 0,5 millimolaire de chlorure de nickel pendant deux minutes. Maintenant, la résine de la puce est recouverte d’ions nickel.

Le deuxième cycle est l’immobilisation du ligand. Réglez le débit à 15 microlitres par minute et réglez le chemin d’écoulement sur la cellule d’écoulement. Deuxièmement, injectez le ligand A jusqu’à ce qu’il atteigne des valeurs d’unité de réponse ou de R ru qui sont 10 à 20 fois supérieures au poids moléculaire du ligand.

Par exemple, chargez un ligand de 50 kilodaltons à entre 501 000 rus. Tenez un registre de la valeur RU atteinte. Ensuite, réglez le débit à 15 microlitres par minute et le chemin d’écoulement à la cellule d’écoulement numéro un, injectez le ligand de contrôle B jusqu’à la même valeur RU que celle du ligand a, surveillez la soustraction, sensori Graham en ligne pour aider à contrôler la longueur d’injection.

Ensuite, réglez le débit sur 50 microlitres par minute et le chemin d’écoulement sur la cellule d’écoulement numéro un et la cellule d’écoulement. Deuxièmement, lavez le système pendant cinq à 20 minutes jusqu’à ce que la ligne de base se stabilise. Le troisième cycle est l’injection à blanc.

Cette injection servira à la soustraction à blanc. Par conséquent, incluez tous les composants qui seront injectés avec l’analyte, à l’exception de l’analyte lui-même. La durée de l’injection peut varier en fonction du temps nécessaire pour atteindre l’équilibre.

Réglez le débit à 15 microlitres par minute et réglez le chemin d’écoulement sur la cellule d’écoulement numéro un et la cellule d’écoulement numéro deux, et la cellule d’écoulement numéro un, soustraites de la cellule d’écoulement. Deuxièmement, insérez la commande de poids pendant 30 secondes pour obtenir une ligne de base stable. Injectez ensuite la mémoire tampon pendant 13 secondes.

Attendez 120 à 600 secondes pour enregistrer la phase de dissociation. La durée de cette étape varie en fonction du kd. Plus la dissociation est lente, plus cette étape doit être longue.

Le quatrième cycle est l’injection d’analyte. Copiez et collez les conditions exactes utilisées dans le troisième cycle afin que ces deux injections puissent être soustraites plus tard. Modifiez l’emplacement de l’emplacement dans le rack de celui qui contient la solution de contrôle à celui qui contient la solution d’analyte.

Choisissez une concentration légèrement supérieure à la constante de dissociation d’équilibre attendue. Si aucune connaissance préalable n’est disponible, choisissez une micromolaire comme bon point de départ. Après avoir effectué l’injection de tampon et l’injection d’analyte une deuxième fois, effectuez le septième cycle de déclenchement des puces.

Réglez le débit à 50 microlitres par minute, puis injectez 350 millilitres molaires d’EDTA pendant une minute. Répétez cette étape deux fois de plus. N’utilisez pas une seule injection de trois minutes car cela pourrait endommager la puce.

Ensuite, injectez du sulfate de sodium à 0,25 % pendant une minute. Répétez cette étape deux fois. N’utilisez pas une seule injection de trois minutes car cela pourrait endommager la puce suite au chargement du nickel, le transporteur d’intérêt est immobilisé sur la cellule d’écoulement numéro deux jusqu’à 3 500 R rus.

Ensuite, en utilisant le même débit et la même durée d’injection, le ligand de contrôle est injecté dans la cellule d’écoulement numéro un, atteignant initialement seulement jusqu’à 3000 R pour s’assurer que des quantités similaires de protéines sont immobilisées sur les deux cellules d’essai. Le ligand de contrôle est en outre chargé avec une injection plus courte tout en surveillant la charge jusqu’à 3 500 RDU. La forme de l’escalier représente l’augmentation progressive de la masse sur la cellule d’écoulement numéro un à chaque injection, représentée ici est la cellule d’écoulement numéro un, soustraite de la cellule d’écoulement.

Deuxièmement, il est important de varier la durée de l’injection des ligands pour obtenir une charge égale. En revanche, la durée de l’injection de l’analyte doit être maintenue constante pour toutes les concentrations utilisées pour obtenir des données quantitatives. Une gamme de concentrations d’analytes est injectée.

On voit ici des injections de différentes concentrations d’analytes avec une longueur d’injection constante. Les différentes concentrations d’analytes sont injectées dans un ordre aléatoire et les doubles capteurs à blanc sont alignés sur l’axe des x avant l’analyse pour dériver l’affinité et la constante de vitesse. Un ajustement modèle est appliqué.

La constante de dissociation à l’équilibre calculée pour l’interaction mod BCA est d’environ trois fois 10 puissance moins six molaire avec un KA modérément rapide et un KD rapide une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée quelques heures après avoir regardé cette vidéo. Vous devez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir et d’effectuer une expérience SPR en utilisant la protéine qui vous intéresse.