Name: Confocale Accéléré Imaging comme une méthode efficace pour lévaluation cytocompatibilité de composites dentaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez l'imagerie confocale 3D en accéléré pour évaluer la cytocompatibilité des composites dentaires. Cette méthode permet de surveiller en temps réel le comportement des fibroblastes gingivaux humains.

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Saremco Dental Switzerland et Olympus Microsystems France Les entreprises sont vivement remerciées pour leur soutien financier. Saremco Dental est également récompensé pour le don généreux des composites dentaires ELS extra low shrinkage. Les auteurs souhaitent également exprimer leur gratitude au Dr Simon Banks du département de chimie (University College London) pour son aide dans la révision de l’anglais.

Le protocole est constitué de trois étapes principales: la première étape comprend la préparation de l&#39;extrait composite dans un milieu de culture; le second concerne le primaire humaine gingivales fibroblastes (HGF) culture cellulaire, le contact des cellules avec des extraits composites et coloration des cellules; la troisième étape consiste à imagerie confocale et l&#39;analyse du signal fluorescent. Pour tissus gingivaux prendre, le protocole a été approuvé en conformité avec la législation française, le consentement éclairé et le comité d&#39;éthique local. 1. Extraits composite Préparation Utilisation milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) comme milieu d&#39;élution. Assurez-vous que le rapport entre l&#39;aire de surface des éprouvettes et le volume de milieu d&#39;extraction est au niveau le plus bas de la norme ISO 10993/12 exigences. La procédure est décrite récemment 11 et a brièvement ci-dessous: <ol><li> Former des échantillons sphériques du composite dentaire non durci à l&#39;aide d&#39;une cale sur mesureer. La taille du support est de 2 mm de rayon, qui est conforme à la profondeur de durcissement généralement indiqué dans le traitement clinique par voie orale. </li><li> Préparer des puits de la plaque, contenant chacun 1 ml de milieu de culture (DMEM), avec un mélange de 5% de pénicilline / streptomycine et 1% de l&#39;amphotéricine mais sans sérum de veau fœtal (FBS). </li><li> échantillons de guérison dans le milieu DMEM contenant bien en utilisant une lampe LED avec un 1070 mW cm -2 intensité (λ = 465 à 475 nm) pendant 40 secondes. Assurez-vous que la distance entre la pointe de durcissement et les échantillons est de l&#39;ordre de 0,5 mm. Utilisez ce mode de cuisson pour simuler le contact temporaire entre la dent et le composite dentaire non durci. En situation clinique, le contact se produit lorsque le matériau composite de restauration est placée dans la cavité buccale. </li><li> Incuber les échantillons (composites échantillons dans le milieu DMEM) à 37 ° C sous atmosphère humide à 5% de CO 2 dans l&#39;air. Incuber le milieu DMEM (sans échantillons composites) pour les cellules de contrôle dans les mêmes conditions. </li></ol> 2. HGF culture cellulaire, Composite Extraits d&#39;essais et cellules colorées <ol><li> La croissance et le maintien de cultures de cellules Isoler les fibroblastes gingivaux humains provenant de biopsies de tissus gingivaux sains de patients pris pendant extractions orthodontiques routine. <ol><li> Cultiver les fibroblastes gingivaux humains dans du DMEM en présence de 10% de FBS, 5% de pénicilline / streptomycine et 1% de l&#39;amphotéricine B. maintenir les cellules à 37 ° C dans un incubateur sous atmosphère humide à 5% de CO 2 dans l&#39;air. </li><li> Moyennes changés tous les 3 jours, et passage des cellules tous les 5 jours. Après avoir atteint la confluence, les cellules de récolte par traitement à la trypsine. </li><li> Centrifuger les cellules à 90 g pendant 5 min et remettre en suspension les dans le milieu de culture. Comptez cellule avec un compteur de cellules automatisé sceptre de poche. </li><li> Graine suspension de cellules à une densité cellulaire de 2,5 x 10 4 cellules / ml dans un système de chambre de coulissement. Laisser l&#39;incubation des cellules pendant une nuit à 37 ° C dans une atmosphère à 5%. </li></ol></li><li> L&#39;addition de composés extraits de cellules en culture <ol><li> Remplacer le support de deux puits de la glissière de la chambre par 1 ml de l&#39;extrait composites testés (après 24 h d&#39;incubation). </li><li> Maintenir les deux autres puits (cellules témoins) dans les mêmes conditions. </li><li> Incuber la lame de la chambre contenant les quatre puits à 37 ° C dans un incubateur sous atmosphère humide à 5% de CO 2 dans l&#39;air. </li></ol></li><li> Coloration fluorescente Utilisez Live cytotoxicité Morte tache / pour les cellules eucaryotes selon les instructions du fabricant. REMARQUE: le kit fournit un rapide Fluorescent Assay deux couleurs pour déterminer la viabilité des cellules dans une population basée sur l&#39;intégrité de la membrane plasmique et de l&#39;activité de l&#39;estérase. Le colorant direct de distinguer les cellules endommagées par marquage simultanément avec vert fluorescent, la calcéine-AM pour indiquer une activité estérase intracellulaire et d&#39;éthidium homodimère fluorescent rouge-1 (EthD-1) pour indiquer la perte de membranl&#39;intégrité des e. <ol><li> Préparer une solution de travail des deux réactifs de coloration contenant 2 uM de calcéine AM et 4 uM de EthD-1 (concentration finale rapportée comme étant approprié pour la coloration des fibroblastes). Ajouter le colorant aux cellules adhérentes cultivées en présence ou en absence des composés extraits sélectionnés. </li><li> Respecter les populations directement et rapidement des cellules colorées au moins 15 min après coloration et par l&#39;imagerie time-lapse. Ne pas centrifuger et ne fixe les cellules colorées. </li></ol></li></ol> 3. confocale Accéléré imagerie et d&#39;analyse du signal Le système utilisé est équipé de quatre unités d&#39;un laser à diode et d&#39;une image multi-colorées pendant un maximum de quatre colorants fluorescents pour chaque échantillon. Le système peut effectuer une image de la cartographie (10X de grossissement) qui donne un aperçu de l&#39;échantillon d&#39;essai sur lequel on peut se déplacer pour observer une région d&#39;intérêt (600X grossissement). <ol><li> Time lapse imagerie <ol><li> Placez les specimens (la lame de la chambre contenant les échantillons colorés) sur la chambre noire de l&#39;incubateur intégré confocal (37 ° C, 5% de CO 2 et l&#39;atmosphère humide). </li><li> Sélectionnez les lasers correspondants. Utilisez les deux sources laser 473 nm (15 mW) et 559 nm (18 mW) pour exciter la calcéine et EthD-1. </li><li> Utilisez un mode deux séquentielle d&#39;acquérir des images à travers des séquences de ligne sans diaphonie en imagerie avec les deux colorants fluorescents usagés. </li><li> Utilisation d&#39;un détecteur avec un spectre nouvellement mis au point pour régler automatiquement les conditions en conformité avec le colorant fluorescent dans l&#39;unité de balayage. </li><li> Optimiser la largeur de bande de la fluorescence détectée pour chaque canal au maximum. Enregistrer toutes les acquisitions de manière séquentielle pour éviter croisée potentielle parler. </li><li> Sélectionner les conditions de formation d&#39;image les plus appropriées sur la base de la sélection d&#39;un colorant fluorescent à l&#39;aide du logiciel d&#39;acquisition. </li><li> Acquérir une image de la carte qui est automatiquement créé à partir du centre dans un motif en spirale,avec la zone d&#39;intérêt étant facilement sélectionné pour un examen plus approfondi. </li><li> Sélectionnez le mode d&#39;observation. Sélectionnez jusqu&#39;à cinq types de modes d&#39;observation, y compris time-lapse, Z-stack, et multi-zone si nécessaire. Utilisez une combinaison de Z-stack et modes time-lapse dans la présente étude et compléter rapidement la capture d&#39;image, </li><li> Changer et passer le colorant fluorescent. En variante, la fluorescence et superposer les images de contraste de lumière entre eux. Observez l&#39;image en direct en utilisant le point sélectionné sur l&#39;écran en bas à gauche de la carte. </li><li> Déterminer la zone d&#39;imagerie en utilisant l&#39;encadrement et les fonctions de zoom. Eventuellement, commuter entre les affichages pour chaque type de colorant fluorescent. REMARQUE: Le microscope utilisé dans ce protocole a la même fonctionnalité que confocal classique haut dans un design compact. Le microscope est équipé d&#39;objectifs immersion dans l&#39;eau inversées qui sont parfaitement adaptés pour stable imagerie time-lapse de cellules vivantes avec un incubateur intégré simplifié. </li&gt; </ol></li><li> l&#39;analyse et la quantification du signal <ol><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie pour quantifier le signal de fluorescence. Obtenir cinq images de carte avec l&#39;objectif 10X pour l&#39;échantillon et la cellule de contrôle testé. </li><li> Obtenu 1024 × 1024 pixels images régulières, avec une taille 0,231 um x 0,231 um de pixel. Stocker des images au format d&#39;image Olympus (OIF) pour l&#39;analyse du signal. Ce format permet de stocker différents paramètres et images. Utilisez des outils d&#39;analyse (mesure de profil d&#39;intensité, rapport d&#39;intensité entre les deux canaux utilisés). </li><li> Stocker les images de projection maximale des fichiers TIFF 12 bits / pixel. </li><li> Préforme analyses statistiques en utilisant le logiciel de commandant R. Analyser les différences en utilisant une analyse de variance (Anova) avec un test de répétition. Rapport résulte écart-type moyen (± SD) et la signification statistique à p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents, qu’ils n’ont rien à divulguer.

le comportement des matériaux de biocompatibilité est le paramètre le plus préalable être évalués avant usage médical. Les normes internationales couvrent dispositifs médicaux ISO 10993 33 et plus particulièrement les matériaux dentaires ISO 7405 34. L&#39;absence des effets toxiques sur les cellules environnantes est la norme clé dans l&#39;évaluation de la biocompatibilité de ces matériaux. Cela est la raison pour laquelle l&#39;essai de cytotoxicité a une telle importance dans l&#39;évaluation de la biocompatibilité d&#39;un matériau dentaire 35-37. L&#39;ISO a suggéré des méthodes d&#39;essai pourraient être basés sur l&#39;activité métabolique ou à l&#39;intégrité de la membrane. Critères d&#39;évaluation retenus doivent respecter certaines conditions particulières de classement des effets néfastes induits par un matériau d&#39;essai afin de réduire le temps et le coût des tests d&#39;évaluation. La méthode actuelle de l&#39;enquête (3D temps confocale lapse d&#39;imagerie) est l&#39;intégrité de la membrane à base. L&#39;évaluation de la cytotoxicité par l&#39;intermédiaire de ce point d&#39;extrémité semble être un marqueur utile de la cellule de biocompatibilité avec des matériaux testés et il est également certifiée ISO extrémité. Les tests in vitro sont conçus pour déterminer comment un échantillon de matériau affecte un type cellulaire particulier. Le test colorimétrique au MTT a été décrite à l&#39;origine par Mossman (1983) comme une méthode utile pour la mesure de la cytotoxicité in vitro et la prolifération cellulaire. Le test MTT est basé sur la conversion du sel de tétrazolium en cristaux de formazan par les cellules actives, qui détermine l&#39;activité mitochondriale. Cela peut se traduire par le taux de viabilité 38. Gupta et ses collaborateurs ont indiqué que le test MTT est la méthode la plus largement utilisée pour mesurer la cytotoxicité des résines composites. Succinique déshydrogénase et les réponses de la phosphatase alcaline ont également été utilisés dans le même but 39. Cependant, les cellules du devenir ne peuvent pas être suivi, depuis le test MTT nécessite tuer les cellules à chaque point de mesure du temps. Afin de suivre de plus près le comportement des cellules colorées dans la présente étude, direct observation de cellules vivantes a été réalisée grâce à laps de temps CLSM imagerie combinée avec une coloration de protocole court, l&#39;analyse automatique d&#39;images et fluorescent signal de quantification. Composites dentaires sont en contact étroit avec les tissus buccaux, en particulier les cellules gingivales et la pulpe. Fibroblastes seraient la cible de composants libérés de ces composites de restauration 40 - 41. De plus, plusieurs études ont rapporté que les cellules immortalisées et les cellules primaires peuvent avoir différentes réponses cellulaires en contact avec des biomatériaux. Les cellules primaires ont été trouvés à être plus approprié pour évaluer les effets des biomatériaux 42. Ceci explique l&#39;utilisation de cellules de fibroblastes gingivaux humains primaires comme modèle cellulaire pour l&#39;évaluation de la cytotoxicité du composite dentaire testée dans la présente étude. Le potentiel de toxicité des substances rejetées par composite dentaire a été largement étudiée 43-44. Afin d&#39;évaluer til cytotoxique potentiel des matériaux, deux cellules modèles de contact pourraient être effectuées. Dans le système de modèle de contact direct du matériau est placé directement avec les cellules cibles alors que dans le système à contact indirect, ciblent les cellules sont en contact avec élue de milieux biologiques. Dans les applications cliniques et les procédures de restauration, composite dentaire sont mis en contact indirect avec des tissus gingivaux. Pour cette raison, le protocole expérimental actuel est centré sur le système de contact indirect avec des fibroblastes gingivaux humains (cellules en présence des extraits composites testés). Comme indiqué précédemment par Dahl et collaborateurs, les réponses de cytotoxicité ont été classés comme sévère (&lt;30%), modérée (30-60%), faible (60-90%) ou non-cytotoxique (&gt; 90%) sur la base de l&#39;activité par rapport à Les valeurs obtenues pour les contrôles 45. Par conséquent, selon ce classement et à la lumière des résultats obtenus (tableau 1), composite ELS supplémentaire faible retrait pourrait être classé comme very légèrement cytotoxique et présente un comportement comparable aux cellules témoins pendant toute la période laps de temps. Utilisation de la précision même méthode d&#39;enquête, les résultats de cette étude pourraient être comparés à ceux d&#39;une étude récemment publiée. L&#39;ELS supplémentaire faible retrait composite démontré la biocompatibilité supérieure par rapport aux deux composites testés précédemment utilisés pour la même application clinique qui est la restauration directe 11. D&#39;autres études sont encore nécessaires pour établir une comparaison plus complète. Au moment de décider qui essai de cytotoxicité à approuver une évaluation spécifique de point final, il est important de comprendre les avantages et les limites de chaque méthode. Le but principal de l&#39;imagerie confocale est de réaliser une architecture 3-D de cellules et d&#39;organes. La technique est en mesure de révéler non seulement la surface de un spécimen, mais aussi son sous-sol. Le protocole décrit ici souligne l&#39;utilisation de la 3D CLSM laps de temps imagerie confocale, comme une sensiProcédé tive pour évaluer le comportement de biocompatibilité in vitro d&#39;un composite dentaire. Toutefois, afin d&#39;éviter les limitations rencontrées dans ce travail, les postes de travail anti-vibrations pourraient être utilisés afin de permettre laps imagerie en temps plus stable et plus; la table peut isoler le système confocal utilisé contre les effets néfastes que les vibrations dans le laboratoire peuvent causer. En outre, les matériaux utilisés dans la cavité buccale devrait idéalement être sans danger pour les tissus gingivaux et ne doit pas contenir de substances qui pourraient causer une toxicité systémique. Conformément à la méthodologie utilisée et les résultats obtenus dans la présente étude, on peut conclure que le composé testé (ELS très basse de retrait) est non cytotoxique dans les conditions expérimentales présentes. Comme la méthode de CLSM peut sensibilité donner le taux initial de cellules viables, d&#39;autres possibilités pourraient être envisagées pour évaluer plus de point final. En particulier, comme il a été récemment rapporté que des monomères composés affectent les cellules thrOugh espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) 46- 48, une enquête plus approfondie est nécessaire pour évaluer les corrélations entre le cas échéant cytotoxicité réseaux et la production de ROS signalisation. Le futur protocole pourrait être conçu pour évaluer simultanément la production de ROS (H 2 O 2 et / ou O 2 - coloration) et le taux de cytotoxicité (Live de coloration / mort) à l&#39;aide laps de temps CLSM imagerie.

L&#39;une des principales normes citées dans les recommandations de l&#39;ISO pour définir la biocompatibilité est l&#39;absence de toxicité matière de cellules. Composites dentaires à base de résine peuvent libérer des composants de la matrice résineuse, qui pourraient être d&#39;abord dû à la polymérisation partielle, et / ou plus tard en raison de processus de dégradation au fil du temps 1-4. Ces composants libérés entrer en contact avec les tissus buccaux et peuvent avoir différents inconvénients comme des réactions urticariennes et des muqueuses 5, le développement de l&#39;allergie et des réactions d&#39;hypersensibilité chez les patients 6, les modifications de fibroblastes gingivaux morphologie et la réduction de collagène de type I protéines 7, immunosuppression ou immuno-stimulation sur mitogène axées sur l prolifération des lymphocytes T purifiés et les cellules de la rate 8 et dommages à l&#39;ADN dans les fibroblastes gingivaux humains primaires, ce qui souligne leur potentiel génotoxique 9. De nombreux paramètres peuvent influer sur la toxicité composite dentaire comme l&#39;ombre de la che de la dentine, la photopolymérisation, la composition chimique du monomère de la résine, la charge et le degré de conversion de 10 13. Depuis potentiel toxique in vitro de matériaux peut prédire dans des situations in vivo et pourrait être comparé à des situations cliniques de l&#39;étude de certains paramètres pertinents. La cytotoxicité des composites dentaires et de leurs composants ont été largement évaluée en utilisant des systèmes de culture cellulaire 14- 16. Ces systèmes in vitro ont été élaborés pour évaluer les composites dentaires biocompatibilité en terme de: la croissance cellulaire et l&#39;apoptose cellulaire en utilisant THP-1monocytes comme les cellules 17, la cytotoxicité dans les fibroblastes gingivaux humains 18, le potentiel inflammatoire dans HaCaT kératinocytes comme les cellules 2, fonctionnalité des cellules odontoblast- comme MDPC-23 cellules 19, la réduction des niveaux d&#39;ARN totaux, et une augmentation significative de l&#39;induction de l&#39;apoptose sur gingival kératinocytes humains 20 etlésions de l&#39;ADN sur la gencive et pulpe fibroblastes cellules 21. Différentes méthodes sont proposées pour étudier la biocompatibilité des composites dentaires. Les dosages colorimétriques, qui impliquent des colorants spécifiques et des mesures d&#39;adsorption de lumière, restent le plus communément utilisé, en raison de leur relative simplicité et son faible coût 22- 26. analyse de microscopie par contraste lumineux consomme souvent plus de temps et entraîne des coûts plus élevés. Cependant, ces techniques de microscopie présentent certains avantages importants. L&#39;observation de la structure cellulaire donne des informations étendues sur les effets toxiques expérimentés, fournissant ainsi des données plus pertinentes et sensibles. En particulier, l&#39;introduction de la microscopie confocale 27 a permis l&#39;observation de structures biologiques à l&#39;amélioration de la résolution axiale par rapport à l&#39;ensemble du champ des microscopes traditionnels de fluorescence d&#39;imagerie. Par conséquent, l&#39;imagerie confocale est devenu un puissant outil d&#39;enquête dans différents domaines de larecherches médicales et scientifiques. Contrairement aux techniques de microscopie électronique, microscopie confocale à balayage offre la possibilité de visualiser des composants distincts de cellules par incorporation de marqueurs fluorescents spécifiques. La plupart de ces traceurs spécifiques sont stables dans un environnement aqueux, sensiblement mesurable, peu coûteuse et non toxique 28, ce qui permet leur utilisation en clinique ainsi que des études de recherche en laboratoire. En outre, le séchage et la fixation de l&#39;échantillon utilisé pour l&#39;analyse par microscopie électronique conventionnelle ne sont pas nécessaires pour l&#39;imagerie confocale laps de temps, donc acquisition en fonction du temps est également possible sur des échantillons. Par rapport à l&#39;imagerie bidimensionnelle, le principe de l&#39;imagerie confocale permet une visualisation sous la surface de l&#39;échantillon et la reconstruction de la structure tridimensionnelle à partir des différentes images de profondeur obtenues; détails qui se traduisent par, plus précises et plus structurels 29, 30 L&#39;étude de la vidéo. présent est un exemple de l&#39;utilisation des trois dimensions Time-Lapse Confocal à balayage laser (CLSM 3D) associé à un étiquetage Vivant / Mort fluorescent et le signal quantification comme une méthode innovante. La technique présentée dans ce document a l&#39;avantage de permettre l&#39;évaluation sensible et imagerie time-lapse de cellules vivantes sans modifier la structure de la cellule évalué. Aucun étapes de préparation sont nécessaires avant l&#39;analyse confocale. Auparavant, la même coloration a été utilisé pour évaluer la viabilité de culture des carottes de 31 os spongieux mais sans confocale time-lapse suivant. De même, la même procédure time-lapse confocale a été utilisé pour évaluer l&#39;activité érythromycine temps-kill dans les bactéries des boues activées en fonction de leur type Gram 32 en utilisant une bactérie spécifique Live / coloration mort. Ces méthodes ont été récemment utilisée et adapté pour comparer la toxicité des composites dentaires à base de monomères de méthacrylate 11.

<table><tbody><tr><td>Olympus Fluoview FV10i&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Microscope confocal</td></tr><tr><td>O2/CO2 Incubateur</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td><td>Incubation cellulaire</td></tr><tr><td>Kit vivant/mort</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>MP 03224</td><td>Tache&nbsp ;</td></tr><tr><td>ELS extra faible retrait &nbsp ;</td><td>Saremco&nbsp ;</td><td></td><td>Milieu DMEM composite dentaire</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr> système de lames de chambre <tr><td>de cellules de prélèvement &nbsp ;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td>Chambre de culture</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine&nbsp ;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>Comptage cellulaire&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

confocale accéléré imaging comme une méthode efficace pour l&#39;évaluation cytocompatibilité de composites dentaires

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Il est généralement admis que l&#39;interaction in vitro de la matière dans la cellule est un critère utile pour l&#39;évaluation de la biocompatibilité d&#39;un matériau dentaire. L&#39;objectif de cette étude était d&#39;utiliser 3D CLSM laps de temps imagerie confocale pour évaluer la biocompatibilité in vitro des composites dentaires. Cette méthode fournit une indication précise et sensible de taux de cellules viables en contact avec des extraits de composites dentaires. L&#39;ELS supplémentaire faible retrait, une composite dentaire utilisé pour la restauration directe, a été pris comme exemple. Évaluation in vitro a été réalisée sur des cellules en culture primaire de fibroblastes gingivaux humains en utilisant en direct coloration / Dead. Les images ont été obtenues avec le système biologique confocal inversé FV10i et analysés avec le logiciel FV10 3,1-ASW. L&#39;analyse des images a montré une très légère cytotoxicité en présence du composite testé après 5 heures de laps de temps. Une légère diminution de la viabilité cellulaire a été montré en contact avec le composite extraits compar testéed à contrôler les cellules. Les résultats ont mis en évidence l&#39;utilisation de 3D CLSM laps de temps d&#39;imagerie comme une méthode sensible pour évaluer qualitativement et quantitativement le comportement de la biocompatibilité des matériaux composites dentaires.

Figure 1 montre une vue d'ensemble des cellules colorées vivants / morts dans des images de cartographie obtenus (objectif 10x) à la fois pour le contrôle et les cellules exposées aux extraits composites testés (ELS très basse de retrait). La structure tridimensionnelle de cellules peut être visualisée au grossissement 600X. La visualisation des cellules prélevées dans la chambre de commande et des cellules prélevées dans la chambre en présence des extraits composites testés est présentée en figure 2. La projection maximale (60X objectif) montre le sort des populations de cellules sélectionnées au début de l'intervalle de temps (à 15 min) et à la fin de la période d'intervalle de temps (à 5 h). Cinquante-sept piles d'images (xyzt de balayage mod, 39 images par piles, voxel-profondeur 1,00 um) ont été obtenus au cours de cette période. Une légère diminution du signal fluorescent vert et très légère variation dans la fluorescence rouge ont été obtenus dans les cellules exposées. Aucune variation significative n'a été observée pour le contrôlecellules. Cellules exposées extraits composites supposés morphologie de la broche similaire aux cellules témoins; morphologie n'a pas été altérée dans ces conditions expérimentales (en dépit de la diminution du signal vert et le rouge augmentation du signal en présence du composé testé). L'analyse d'image a été effectuée sur cinq sélectionnées différentes piles d'image correspondant à des populations à partir des images obtenues pour le composite testé de cellules par rapport aux cellules témoins négatifs pour les deux signaux vert et rouge. Le profil d'intensité de cellules colorées est illustré sur la figure 3; le vert et le rouge évolution du signal des cellules en contact avec le composite testée était comparable à celles des cellules témoins. Calcéine et EthD-1 intensités d'émission de fluorescence ont été mesurées sur des cellules de contrôle et sur les cellules exposées composites. La mesure a été effectuée à intervalles d'une heure pour un maximum de cinq heures. Le ratio vert / rouge fluorescence (sur la base des intensités intégrées de la verte 495-515 nm et rouges signaux nm 620-650) A été calculée au cours de la période time-lapse. Les ratios de viabilité pour le contrôle et les cellules exposées à ELS extraits très basse de retrait sont présentés dans le T mesure 1. En présence du composite testé, le pourcentage de cellules vivantes a été trouvé à diminuer légèrement de 100% à 93,9% après 1 heure de contact. Différence significative n'a été observée entre le composite testé et le contrôle négatif (cellules sans extraits composites) après 5 h de la période time-lapse indiqué. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg"> Figure 1: Vue d'ensemble image de cartographie de révélé des cellules à l'objectif 10X, (a) des cellules de contrôle et (b) des cellules colorées en présence d'extraits composites (ELS très basse de retrait) au début de la période de laps de temps (t = 15 min). Les espaces verts sont des cellules vivantes et les zones rouges sont les cellules endommagées. Dans ceconditions de l'expérience, aucune variation (à la fois pour la fluorescence verte et rouge) a été observée pour les composites ont exposé des cellules par rapport aux cellules témoins négatifs. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg"> Figure 2: images CLSM à objectif 60X d'une population de cellules de (A) chambre de commande et (B) chambre des extraits composites dans le début et la fin de la période d'exposition time-lapse (I: 15 min et II: 5 h, respectivement ). Les espaces verts sont des cellules vivantes et les zones rouges sont les cellules endommagées. Le panneau des images démontré léger changement dans le signal d'intensité (légère diminution du signal vert et très légère augmentation dans le rouge). Aucune altération de la morphologie cellulaire ont été observées en présence d'extraits composites; exposer les cellules conservé leur morphologie en forme de fuseau et de fibroblastes que les cellules témoins. Figure 3: profil de la ligne de cellules observées en microscopie time-lapse cellules (A) de contrôle (B) des cellules extraits composites exposés: (i) à 15 min et (II) à 5 h.. Aucune variation visible dans l'évolution du signal vert en présence de composé testé quel que soit le temps de contact. Cependant, on a observé une légère augmentation du signal rouge en présence de composite après 5 h de contact. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Le temps de contact (heures) </td><td colspan="5"> La viabilité cellulaire (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Les cellules témoins </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS supplémentaire faible retrait ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Taux de HGF direct cellules évolution après 1, 2, 3, 4 et 5 heures de contact avec les extraits composites La viabilité des cellules a été analysé par coloration à l'aide du kit de la cytotoxicité Vivant / Mort. Les données montrent des valeurs moyennes ± SD de cinq images empile analyse. Les valeurs sont significativement différentes de cellules de contrôle à p &lt;0,05.

L&#39;aspect le plus étudié de la biocompatibilité des matériaux composites dentaires est leur cytotoxicité 3D CLSM laps de temps imagerie combiné avec le signal fluorescent quantification permet une évaluation sensible du destin cellulaire au cours du temps. En utilisant cette méthode pourrait être un outil efficace pour évaluer la cytocompatibilité des composites dentaires.

Confocale Accéléré Imaging comme une méthode efficace pour l&#39;évaluation cytocompatibilité de composites dentaires

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la microscopie confocale à balayage laser 3D pour l’imagerie en accéléré afin d’évaluer qualitativement et quantitativement la biocompatibilité in vitro des composites dentaires. Pour ce faire, on prélève d’abord des échantillons sphériques de composite dentaire non durci dans un deuxième temps. Des fibroblastes gingivaux humains sont cultivés en présence ou en l’absence de ces extraits composites, puis les cellules sont marquées avec une coloration morte vivante.Des images cartographiques sont ensuite générées des cultures cellulaires et des images superposées sont créées pour les zones d’intérêt. En fin de compte, les différences en temps réel de comportement cellulaire qui se produisent en présence ou en absence des composites testés peuvent être surveillées en fonction des changements dans les signaux fluorescents verts ou rouges observés dans les images. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont qu’elle permet de surveiller en temps réel des cellules vivantes sans induire de modifications de la structure cellulaire.Aucune étape de fixation ou de séchage n’est nécessaire après la coloration cellulaire ou avant l’observation en accéléré. Pour préparer l’extrait composite, commencez par utiliser un support sur mesure avec un rayon de deux millimètres pour former des échantillons sphériques du composite dentaire non durci. Transférez les échantillons dans des puits individuels d’une plaque à six puits contenant un millilitre de milieu de culture, en prenant soin de laisser certains puits avec des milieux uniquement pour les cultures cellulaires de contrôle, puis disposez une lampe LED d’une intensité de 1070 milliwatts centimètre carré à moins de 0,5 millimètre des échantillons.Durcir les échantillons pendant 40 secondes pour simuler le contact temporaire entre les dents et le composite dentaire non soigné, puis incuber les échantillons composites pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu tous les trois jours et les cellules de passage tous les cinq jours. Ensuite, une fois que la culture a atteint la co-fluidité, récoltez les cellules et faites-les tourner pendant cinq minutes à 90 fois G et à 37 degrés Celsius.Remettez la pastille en suspension dans un milieu de culture, puis après avoir compté les cellules, ensemencez la suspension cellulaire à une densité cellulaire de 2,5 fois 10 à la quatrième cellule par millilitre dans un système de lame de chambre pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %. Le lendemain matin, remplacez le média dans deux puits de la lame de chambre par un millilitre d’extraits composites testés, et replacez la lame dans l’incubateur pour imager les cellules par confocale. Imagerie en accéléré.Étiquetez d’abord les cellules composites co-cultivées et les cellules témoins avec une coloration de cytotoxicité morte vivante pour les cellules eucaryotes conformément aux instructions du fabricant. 15 minutes après la coloration, placez la lame de la chambre dans l’obscurité de la chambre confocale intégrée dans des conditions de culture cellulaire et réchauffez les lasers de 473 nanomètres et 559 nanomètres. Ensuite, utilisez un détecteur avec un spectre nouvellement développé pour régler automatiquement les conditions d’imagerie du laser de 473 nanomètres.Utilisez les fonctions de cadrage et de zoom pour sélectionner la zone d’intérêt, puis choisissez le mode d’observation. Sélectionnez jusqu’à cinq types de modes d’observation, y compris time-lapse Zack et multi-zone selon les besoins, puis capturez rapidement cinq images cartographiques avec un laser de 473 nanomètres sous l’objectif 10 x pour l’échantillon de test et les cellules de contrôle lorsque les images souhaitées ont été acquises. Passez au laser de 559 nanomètres et capturez des images de la cellule à la seconde fluorescente comme nous venons de le démontrer.Vous pouvez également superposer les images fluorescentes et les images à contraste clair à l’aide du point sélectionné sur l’écran en direct du X 60 pour observer le stockage d’images en direct. Les images de la carte au format d’image Olympus pour l’analyse du signal et les images de projection maximale sont de 24 bits par pixel. Les fichiers TIFF utilisent ensuite les différents outils d’analyse pour mesurer le profil d’intensité du signal et le rapport d’intensité entre les deux canaux fluorescents.Enfin, analysez les différences de signalisation des cellules fluorescentes entre les deux groupes à l’aide du logiciel approprié. Dans ces images cartographiques de cellules de coloration TED vivantes dans des milieux seuls ou exposées à un extrait composite, aucune différence n’a été observée dans la viabilité des cellules 15 minutes après le début de la période d’intervalle. Ici, les images de projection maximale des cellules de contrôle montrent le devenir amplifié des cellules dans les 15 premières minutes et cinq heures plus tard à la fin de la période d’intervalle, comme observé, il n’y avait pas de variation significative de la fluorescence à l’intérieur des cellules de contrôle au cours de la période d’incubation.Les cellules exposées à très faible rétrécissement de l’ELS ont supposé une morphologie du fuseau similaire à celle des cellules témoins, mais ont montré une légère diminution du signal fluorescent vert et une très légère augmentation de la fluorescence rouge à la fin de la période d’intervalle. Le profil d’intensité des cellules colorées est illustré dans ces graphiques dans lesquels les intensités d’émission de fluorescence de l’homodimère d’endothélium calcique ont été mesurées sur des cellules témoins et composites exposées à des intervalles d’une heure pouvant aller jusqu’à cinq heures. Aucune différence significative dans la signalisation n’a été observée entre les deux cultures.Les rapports de viabilité des cellules témoins et des cellules composites exposées sont indiqués dans le tableau. En présence du composite testé, le pourcentage de cellules vivantes a légèrement diminué, passant de 100 à 93,9 %, après une heure de contact après cinq heures. Des différences significatives dans la viabilité cellulaire ont été observées entre l’ELS composite testé, le retrait extra faible et les cultures de cellules témoins négatives malgré la non-cytotoxicité du composite.Les données actuelles mettent en évidence l’utilisation de l’imagerie confocale time-lapse comme méthode précise et sensible pour évaluer le comportement des fibroblastes au contact des composites dentaires après son développement. Cette méthode permet aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie d’explorer la cytotoxicité et l’évaluation des risques des matériaux dentaires, des médicaments, des substances chimiques et d’autres dispositifs médicaux.

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