Confocale Accéléré Imaging comme une méthode efficace pour l'évaluation cytocompatibilité de composites dentaires

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la microscopie confocale à balayage laser 3D pour l’imagerie en accéléré afin d’évaluer qualitativement et quantitativement la biocompatibilité in vitro des composites dentaires. Pour ce faire, on prélève d’abord des échantillons sphériques de composite dentaire non durci dans un deuxième temps. Des fibroblastes gingivaux humains sont cultivés en présence ou en l’absence de ces extraits composites, puis les cellules sont marquées avec une coloration morte vivante.

Des images cartographiques sont ensuite générées des cultures cellulaires et des images superposées sont créées pour les zones d’intérêt. En fin de compte, les différences en temps réel de comportement cellulaire qui se produisent en présence ou en absence des composites testés peuvent être surveillées en fonction des changements dans les signaux fluorescents verts ou rouges observés dans les images. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont qu’elle permet de surveiller en temps réel des cellules vivantes sans induire de modifications de la structure cellulaire.

Aucune étape de fixation ou de séchage n’est nécessaire après la coloration cellulaire ou avant l’observation en accéléré. Pour préparer l’extrait composite, commencez par utiliser un support sur mesure avec un rayon de deux millimètres pour former des échantillons sphériques du composite dentaire non durci. Transférez les échantillons dans des puits individuels d’une plaque à six puits contenant un millilitre de milieu de culture, en prenant soin de laisser certains puits avec des milieux uniquement pour les cultures cellulaires de contrôle, puis disposez une lampe LED d’une intensité de 1070 milliwatts centimètre carré à moins de 0,5 millimètre des échantillons.

Durcir les échantillons pendant 40 secondes pour simuler le contact temporaire entre les dents et le composite dentaire non soigné, puis incuber les échantillons composites pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu tous les trois jours et les cellules de passage tous les cinq jours. Ensuite, une fois que la culture a atteint la co-fluidité, récoltez les cellules et faites-les tourner pendant cinq minutes à 90 fois G et à 37 degrés Celsius.

Remettez la pastille en suspension dans un milieu de culture, puis après avoir compté les cellules, ensemencez la suspension cellulaire à une densité cellulaire de 2,5 fois 10 à la quatrième cellule par millilitre dans un système de lame de chambre pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %. Le lendemain matin, remplacez le média dans deux puits de la lame de chambre par un millilitre d’extraits composites testés, et replacez la lame dans l’incubateur pour imager les cellules par confocale. Imagerie en accéléré.

Étiquetez d’abord les cellules composites co-cultivées et les cellules témoins avec une coloration de cytotoxicité morte vivante pour les cellules eucaryotes conformément aux instructions du fabricant. 15 minutes après la coloration, placez la lame de la chambre dans l’obscurité de la chambre confocale intégrée dans des conditions de culture cellulaire et réchauffez les lasers de 473 nanomètres et 559 nanomètres. Ensuite, utilisez un détecteur avec un spectre nouvellement développé pour régler automatiquement les conditions d’imagerie du laser de 473 nanomètres.

Utilisez les fonctions de cadrage et de zoom pour sélectionner la zone d’intérêt, puis choisissez le mode d’observation. Sélectionnez jusqu’à cinq types de modes d’observation, y compris time-lapse Zack et multi-zone selon les besoins, puis capturez rapidement cinq images cartographiques avec un laser de 473 nanomètres sous l’objectif 10 x pour l’échantillon de test et les cellules de contrôle lorsque les images souhaitées ont été acquises. Passez au laser de 559 nanomètres et capturez des images de la cellule à la seconde fluorescente comme nous venons de le démontrer.

Vous pouvez également superposer les images fluorescentes et les images à contraste clair à l’aide du point sélectionné sur l’écran en direct du X 60 pour observer le stockage d’images en direct. Les images de la carte au format d’image Olympus pour l’analyse du signal et les images de projection maximale sont de 24 bits par pixel. Les fichiers TIFF utilisent ensuite les différents outils d’analyse pour mesurer le profil d’intensité du signal et le rapport d’intensité entre les deux canaux fluorescents.

Enfin, analysez les différences de signalisation des cellules fluorescentes entre les deux groupes à l’aide du logiciel approprié. Dans ces images cartographiques de cellules de coloration TED vivantes dans des milieux seuls ou exposées à un extrait composite, aucune différence n’a été observée dans la viabilité des cellules 15 minutes après le début de la période d’intervalle. Ici, les images de projection maximale des cellules de contrôle montrent le devenir amplifié des cellules dans les 15 premières minutes et cinq heures plus tard à la fin de la période d’intervalle, comme observé, il n’y avait pas de variation significative de la fluorescence à l’intérieur des cellules de contrôle au cours de la période d’incubation.

Les cellules exposées à très faible rétrécissement de l’ELS ont supposé une morphologie du fuseau similaire à celle des cellules témoins, mais ont montré une légère diminution du signal fluorescent vert et une très légère augmentation de la fluorescence rouge à la fin de la période d’intervalle. Le profil d’intensité des cellules colorées est illustré dans ces graphiques dans lesquels les intensités d’émission de fluorescence de l’homodimère d’endothélium calcique ont été mesurées sur des cellules témoins et composites exposées à des intervalles d’une heure pouvant aller jusqu’à cinq heures. Aucune différence significative dans la signalisation n’a été observée entre les deux cultures.

Les rapports de viabilité des cellules témoins et des cellules composites exposées sont indiqués dans le tableau. En présence du composite testé, le pourcentage de cellules vivantes a légèrement diminué, passant de 100 à 93,9 %, après une heure de contact après cinq heures. Des différences significatives dans la viabilité cellulaire ont été observées entre l’ELS composite testé, le retrait extra faible et les cultures de cellules témoins négatives malgré la non-cytotoxicité du composite.

Les données actuelles mettent en évidence l’utilisation de l’imagerie confocale time-lapse comme méthode précise et sensible pour évaluer le comportement des fibroblastes au contact des composites dentaires après son développement. Cette méthode permet aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie d’explorer la cytotoxicité et l’évaluation des risques des matériaux dentaires, des médicaments, des substances chimiques et d’autres dispositifs médicaux.