Name: Propagation d Virus-01 Homalodisca coagulata Par Homalodisca vitripennis Culture Cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Découvrez la propagation du virus HoCV-1 en culture cellulaire d'Homalodisca vitripennis. Cette méthode permet d'extraire et quantifier l'ARN viral par qRT-PCR pour étudier la réplication virale in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier le Texas Pierce’s Disease Research and Education Program et l’USDA-APHIS pour leur soutien financier à ce projet. Nous tenons également à remercier Hema Kothari du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à Tyler pour son aide en microscopie confocale.

1 Culture Cellulaire REMARQUE: les lignées cellulaires de Homalodisca établies par le laboratoire Dr. Wayne Hunter au USDA Agricultural Research Service (Ft. Pierce, FL USA) ont été utilisés pour initier un stock de laboratoire composé de stades cellulaires mixtes incluant les fibroblastes initiales et monocouches. <ol><li> Effectuez les procédures suivantes dans un environnement de laboratoire stérile maintenue dans une plage de température de 20-24 ° C avec 25 cm 2 flacons de culture. </li><li> Cultiver et maintenir les cultures dans 25 cm 2 flacons de culture de tissu en utilisant un milieu H2G + cicadelle, un média d&#39;abeilles WH2 modifié 10 (tableau 1). </li><li> Incuber des flacons de culture à 24 ° C avec ~ 53% d&#39;humidité. </li><li> Utilisez un microscope inversé à un grossissement total (TM) de 100X pour surveiller la croissance de la culture, par exemple, vérifier toute croissance cellulaire anormale, surveiller les contaminants potentiels, et vérifier les progrès de la croissance dans le culsurface ture. </li><li> Effectuer un changement de milieu complet (~ 4 ml de milieu de culture par flacon) tous les 7 - 10 jours sans perturber la surface de culture. </li><li> Faire passer les cultures lorsque la surface de culture est d&#39;environ 80% couvert par une croissance cellulaire (confluent) en utilisant 0,25% de trypsine contenant de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour dissocier les cellules. Ajouter ~ 2 - 3 ml de trypsine à chaque flacon de culture et d&#39;exposer la culture (s) de l&#39;enzyme de courtes périodes de temps (5-10 minutes) pour réaliser une dissociation complète des cellules. </li><li> Ajouter une quantité égale de milieu frais au récipient de culture (s) (~ 2 - 3 ml) pour arrêter l&#39;activité enzymatique et de transférer l&#39;ensemble de la solution dans un tube conique de centrifugation. </li><li> cellules de pellets par centrifugation à 4 ° C pendant 6 minutes à 350 x g. </li><li> Eliminer le surnageant sans perturber le culot de cellules et ajouter ~ 8 ml de milieu frais à chaque tube. Homogénéiser doucement cellules à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> cultures de Split à un ratio 1: 2 pour 25 cm 2 flacons (~ 4 ml de soluti cellulairepar ballon sur) et laisser les cultures fraîchement passés au repos pendant 48 heures pour permettre aux cellules en suspension à attacher à la surface du ballon. REMARQUE: La culture de cellules de 48 puits stériles, des plaques de culture de tissu avec une surface de 1 cm 2 de croissance est également possible et on peut être maintenue de la même façon que les flacons de culture à une réduction de volume du milieu de culture à ~ 250 ul. </li></ol> 2 Extraction de virus entier <ol><li> Homogénéiser corps entiers de virus H. positif vitripennis dans un tampon phosphate, pH ~ 7,2, avec diéthyldithiocarbamate de sodium à 0,02% trihydrate (DETCA) par vortex pendant ~ 10 secondes d&#39;intervalle jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y ait plus de grosses touffes de tissus présents. Extrait virus via superspeed centrifugation à 124 500 g pendant 4 heures à 4 ° C ou 22 000 g pendant 16 heures à 4 ° C. Si un précipité se forme à la surface, les retirer avec un coton-tige stérile 11. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Recueillir le culot etdissoudre avec 5 ml de tampon phosphate 10 mM (pas de DETCA), pH ~ 7,2, contenant 0,4% d&#39;acide désoxycholique et Na-éther de polyéthylène glycol d&#39;hexadécyle de 4% (Brij 52). <ol><li> Pour bien mélanger le culot, retirez la boulette du côté du tube et écraser jusqu&#39;à en solution si nécessaire. </li><li> Ajouter plus de tampon phosphate 10 mM dans ~ 5 ml incréments pour aider le culot aller dans une solution en cas de besoin et de les combiner en 2 tubes 11. </li></ol></li><li> Centrifuger la solution à 300 g pendant 15 min 11. </li><li> Enlever le surnageant et passer la solution à travers un filtre de 0,45 um, et recueillir le filtrat dans un tube à grande collection 11. </li><li> Transférer le filtrat sur ​​une membrane de dialyse avec un poids moléculaire coupée (MWCO) de 3,5 kD, en utilisant de petites quantités de tampon phosphate 10 mM (pH 7) contenant aucun DETCA 11 si nécessaire. </li><li> Placer la membrane de dialyse dans un grand bol rempli de trou DDH 2 O à 4 ° C. Changer le trou DDH 2 O chaque heure fou 5-6 heures, jusqu&#39;à ce qu&#39;un précipité blanc se forme dans la membrane 11. </li><li> Recueillir le virus purifié à partir de l&#39;intérieur de la membrane et de soumettre la solution de virus à 100% pour une série de dilutions de 10 fois par l&#39;ajout de 10 ul de solution de 90 pl de trou DDH 2 O. Ensuite ajouter 10 ul de la dilution d&#39;un autre 90 ul de trou DDH 2 O jusqu&#39;à une dilution de 1: 100 000. </li><li> solution de virus de magasin à -80 ° C. </li></ol> 3. réplication virale <ol><li> cellules de semences dans des plaques de culture de 48 puits et se développent toutes les lignes jusqu&#39;à ce que la croissance des cellules est de 80% de confluence (environ post-passe 72 heures si les cellules se développent à un taux moyen). </li><li> Inoculer chaque rangée de cellules par le virus dilué en série lorsque la croissance cellulaire atteint la confluence, c&#39;est à dire, une ligne d&#39;une dilution de 1:10, une ligne d&#39;une dilution de 1: 100, etc, à l&#39;exception de la rangée du haut. Utilisez la rangée du haut comme témoin et ajouter 10 ul de ddH 2 O dans chaque puits comme un contrôle de volume. <ol><li> Afin d&#39;établir une concentration de cellules de base de départ pour la comparaison avec le nombre de cellules expérimentales, de dissocier et de compter le premier puits de chaque rangée avant l&#39;inoculation initiale de tous les puits dans les cultures infectées par le virus. </li></ol></li><li> Surveiller les plaques de culture toutes les 24 h après l&#39;inoculation virale de tout changement de couleur dans le milieu indiquant un changement de pH et des éventuelles modifications de la morphologie des cellules. </li><li> L&#39;image d&#39;une colonne de la plaque d&#39;essai à chaque point de temps, à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé à 100X TM. </li><li> Retirez tout support de la colonne qui a été reproduite à chaque point de temps de 24 heures et le stocker à court terme à -20 ° C pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et la quantification virale ou à long terme à -80 ° C. </li><li> Dissocier les cellules des puits après l&#39;élimination du milieu tel que décrit précédemment dans les étapes 1.6 à 1.9, en utilisant seulement ~ 250 pl de 0,25% d&#39;EDTA à la trypsine et du milieu frais pour arrêter l&#39;activité enzymatique et ~ 250 pl de milieu frais pour remettre en suspension la pelle cellulairet. </li><li> Ajouter 10 ul de 0,4% trypan bleuissement à chaque tube contenant des cellules pour effectuer des comptages de cellules après dissociation de cellule pour chaque période de 24 heures sur une semaine. Laisser tache à reposer pendant 10 min avant d&#39;effectuer la numération des cellules. <ol><li> Effectuer le nombre de cellules dans 1 heure d&#39;exposition à tacher ou cellules viables va commencer à absorption tache ainsi que les cellules non-viables. </li></ol></li><li> Ajouter lentement 10 ul de la solution de cellules colorées de chaque côté d&#39;un hémocytomètre standard à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Laisser la solution pour être repris par une action capillaire pour éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Compter le nombre de cellules viables (non colorées) des deux côtés de l&#39;hématimètre (l&#39;équivalent de 4 chefs d&#39;accusation de 16 places dans le hématimètre). Effectuer le nombre de cellules de chaque puits de la colonne qui a été supprimé. </li><li> En moyenne le nombre de cellules de chaque colonne et utiliser la formule suivante pour obtenir le nombre total de comptage cellulaire: (nombre moyen de cellules / 4) x facteur de dilution = nombre de cellules x 10 <sup&gt; 4 ml. Il s&#39;agit de la densité cellulaire ou le nombre de cellules viables dans la culture. </li></ol> 4. Virus Extraction de culture cellulaire <ol><li> Retirer H. traité vitripennis cellules provenant des flacons de culture tel que décrit précédemment dans les étapes 1.6 à 1.8, en utilisant seulement ~ 250 ul d&#39;EDTA 0,25% de trypsine et du milieu frais pour arrêter l&#39;activité enzymatique. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Extrait virus à partir des cellules de culture en suivant le protocole précédemment décrit dans les étapes 2.3 à 2.8. </li></ol> 5 Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Extraire l&#39;ARN à partir d&#39;échantillons prélevés au cours de chaque moyen d&#39;essai de virus d&#39;une semaine à l&#39;aide d&#39;une extraction thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium conçu pour des échantillons liquides par le protocole du fabricant. </li><li> Magasin extrait des échantillons à -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Établir des normes viraux pour la RT-PCR en exécutant PCR traditionnelle utilisant lepaire d&#39;amorces primaire HoCV RT-PCR 1 (avant 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-inverser ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;) par le virus isoler de tout corps H. vitripennis. </li><li> Sous réserve de produit de PCR à une électrophorèse sur gel de 60 min à 120 V dans un gel d&#39;agarose à 2% contenant 0,1% de bromure d&#39;éthidium. </li><li> Exciser les bandes à partir du gel et on purifie en utilisant un kit d&#39;extraction de gel selon le protocole du fabricant. </li><li> Piscine toute excisée et le produit purifié sur gel et purifier davantage par précipitation à l&#39;éthanol de base. On élue le produit de précipitation dans environ 30 ul de Tris EDTA (TE) pour augmenter la concentration de l&#39;échantillon global. </li><li> Quantifier le niveau de l&#39;ADNc dans les échantillons mis en commun par spectrophotométrie en utilisant les paramètres de longueur d&#39;onde 260/230 pour la détection d&#39;acide nucléique. </li><li> Effectuer une série de dilution en série de dix fois de l&#39;échantillon purifié allant de 57 ng / ul à 57 ag / ul (10 -18). Réaliser des dilutions en série du même type que celui décrit in 2.8 avec des ajustements effectués pour la différence dans les exigences de concentration. </li><li> Déterminer les limites de détection de la série de dilutions en effectuant qRT-PCR en utilisant un kit de qRT-PCR avec une quantification fiable de transcrits de faible abondance. REMARQUE: Les concentrations virales inférieure à 5 x 10 -3 copies ne sont pas détectables. </li><li> Extraire l&#39;ARN à partir d&#39;échantillons expérimentaux comme décrit précédemment à l&#39;étape 5.1 et de quantifier par spectrophotométrie. </li><li> Normaliser tous les échantillons prélevés à 5 ng / ul avec de l&#39;eau sans nucléase. </li><li> Effectuer qRT-PCR sur tous les échantillons, en double, que les réactions 25 ul en utilisant un kit qRT-PCR en une seule étape avec la possibilité de détecter un faible nombre de copies de la manière suivante: 50 ° C pendant 10 min tenir; 95 ° C pendant 5 min; 30 cycles de 95 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 s; faire fondre de 50 à 99 ° C pendant 5 secondes à chaque étape. <ol><li> Faire le mélange maître de sorte que chaque mélange réactionnel contient 12,5 pi de maste 1xr mélange, 1,0 pi (0,3 M) de l&#39;amorce de l&#39;avant, 1,0 pi (0,3 M) de l&#39;amorce inverse, 0,25 ul de la transcriptase inverse et des quantités variables de modèle basé sur des valeurs de normalisation. </li><li> Amener le volume réactionnel total de 25 ul avec de l&#39;eau libre de la RNase. </li><li> Inclure les cinq concentrations standard dans chaque PCR effectuées avec les nombres de copies suivantes: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 et 5 x 10 -2 copies. Régler le seuil pour chaque course juste au-dessous d&#39;une fluorescence de 10x -2,5 à réduire le bruit lors de l&#39;acquisition précoce au début de chaque course. </li></ol></li></ol> 7. microscopie confocale <ol><li> Cultiver les cellules Homalodisca de douze dans une même plaque contenant des lamelles de verre mesurant 18 mm de diamètre dans chaque puits. </li><li> Inoculer une colonne sur la plaque toutes les 24 heures pendant une période de quatre jours, une fois par monocouche est obtenue. Veiller à ce que chaque cOLONNE puits contient un contrôle, une faible dilution virale (1:10) et ainsi une dilution virale élevée (1: 100.000) bien. Utiliser des solutions de virus obtenus à l&#39;étape 2.8. </li><li> Retirez tous les supports sur le cinquième jour et laver les cellules deux fois avec 1x PBS (pH 7,4). </li><li> Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% à froid à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Ajouter 500 ul de 1x tampon phosphate salin (PBS) pour les cellules et les laver pendant 10 min à température ambiante sur un agitateur à faible vitesse. Laver les cellules trois fois. </li><li> Ajouter 500 ul de 0,1% de Triton X-100 aux cellules pour les perméabiliser. Laisser reposer pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules de nouveau tel que décrit précédemment à l&#39;étape 7.5. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;une albumine de sérum bovin (BSA), une solution à 5% pour bloquer les cellules à température ambiante. Laisser reposer pendant 2 h puis retirez. </li><li> Diluer actions rhodamine phalloïdine conjugué à du rouge (RCP) 1: 250 dans du PBS 1X contenant 5% de BSA et ajouter 250 microlitres de la dilution à chaque puits pour tache de F-actine. </li><li> Plaque de couverture en aluminium fhuile pour empêcher le colorant de blanchiment et incuber les cellules à 4 ° CO / N. </li><li> Retirez le RCP après 12 heures d&#39;incubation et le remplacer par 250 pi de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (250 pg / ml) dilué dans du PBS 1X contenant 5% de BSA, pour colorer les noyaux des cellules . </li><li> Incuber les cellules contenant du DAPI à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS 1x, comme décrit précédemment à l&#39;étape 7.5. </li><li> Retirez délicatement les lamelles des puits et installer des lames de microscope à l&#39;aide d&#39;un milieu de montage avec un réactif anti-fade. </li><li> Laisser sécher les lames en opaque boîtes à être examinés au microscope confocal. Voir préparé diapositives dès que possible en tant que colorants peuvent s&#39;estomper rapidement. </li><li> Images colorées cellules en utilisant un système confocal équipé d&#39;un microscope contenant une lentille 63X (huile) Plan-apochromate. <ol><li> Définissez les longueurs d&#39;onde laser à 543 ± 10 nm excitation et 575 ± 10 nm émission pour Rhoadmine phalloïdine rouge-conjucated, Et 369 ± 10 nm excitation et 450 ± 30 nm émission pour DAPI. </li><li> Utilisation gain identique et les paramètres pour compenser le détecteur afin d&#39;obtenir toutes les images. </li><li> Traiter les images en utilisant un logiciel approprié pour le traitement de l&#39;image et de tri et d&#39;importer des images de votre choix dans un logiciel de gestion d&#39;image. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%3A+Cicadellinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li>
<li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+capsid+protein+of+Homalodisca+coagulata+Virus-1%2C+a+new+leafhopper-infecting+virus+from+the+glassy-winged+sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata.</a> J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+molecular+characterization+of+Homalodisca+coagulata+virus-1%2C+a+novel+virus+discovered+in+the+glassy-winged+sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae).</a> Virology. 350 (1), 67-78 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+natural+host+range+of+Homalodisca+coagulata+virus-1+%28HoCV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1).</a> Virology. 153, 61-67 (2008).</li>
<li>Jones, W. A., Setamou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Biometry+of+Sharpshooter+Homalodisca+coagulata+%28Homoptera%29+Cicadellidae%29+Reared+on+Cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).</li>
<li>Turner, W. F., Pollard, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+histories+and+behavior+of+five+insect+vectors+of+phony+peach+disease%5BTitle%5D)+AND+%22US+Dep.+Agric.+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease.</a> US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+primary+nutrients+by+the+polyphagous+xylophage%2C+Homalodisca+coagulata%2C+reared+on+single+host+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+dietary+nitrogen+and+nitrogen+form+on+the+development+of+xylophagous+leafhoppers%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).</li>
<li>Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Cell+Lines+Developed+from+the+Glassy-winged+Sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).</li>
<li>Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+for+development+of+bee+cell+cultures+%28Apis+mellifera%3A+Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).</li>
<li>Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).</li>
<li>Rhoades, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economics+of+baculovirus+%E2%80%93+insect+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Economics of baculovirus – insect cell production.</a> Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).</li>
<li>Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+time+and+passage+number+on+the+morphological+and+physiological+development+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells.</a> P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+Rescues+the+Adverse+Effects+of+Telomere+Loss+and+Cooperates+with+Telomere+Dysfunction+to+Accelerate+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis.</a> Cell. 97 (4), 527-538 (1999).</li>
<li>Counter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+associated+with+chromosome+instability+is+arrested+in+immortal+cells+which+express+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.</a> Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).</li>
<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+some+antibiotics+on+the+growth+of+human+diploid+skin+fibroblasts+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture.</a> In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).</li>
<li>Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoriell%2C+LL+%22Contamination+in+Tissue+Culture%22">Contamination in Tissue Culture</a>. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).</li>
<li>Hambor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Abbot, A., Cyranoski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%E2%80%99s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biology’s new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Préoccupations croissantes concernant l&#39;introduction d&#39;espèces invasives agricoles ont conduit à une demande accrue de nouvelles méthodes pour se défendre contre les ravageurs et agents pathogènes émergents. Un centre de prévention et de gestion de la maladie implique la gestion des vecteurs de pathogènes et était la cible principale de cette étude. Economie jouent un rôle essentiel dans la décision de produire ce type de biopesticide pour gérer les vecteurs de pathogènes dans l&#39;agriculture parce que l&#39;a...

Le vitreux ailé tireur (Homalodisca vitripennis Germar 1821) a été identifié comme le vecteur principal de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l&#39;agent causal de la maladie de Pierce de la vigne (PD) en Amérique du Nord 1. Gestion des populations d&#39;insectes est rapidement devenu le centre de recherche pour lutter contre ce problème dévastateur pour l&#39;industrie de la viticulture en Californie et dans le sud des États-Unis. Un sens positif, virus à ARN simple brin appartenant à la famille Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) a été identifié dans H. sauvage populations vitripennis et démontré que l&#39;augmentation de la mortalité chez les populations de 2-4, tout en réduisant la résistance de l&#39;insecte aux insecticides. Développement de méthodes de manière efficace arrière infecté H. vitripennis à l&#39;âge adulte dans un environnement de laboratoire ont été difficiles car <em&gt; H. vitripennis ont des besoins nutritionnels spécifiques de stade qui nécessitent une grande variété de plantes hôtes 5-8. Installations spécifiques sont nécessaires pour H. direct arrière vitripennis aux États-Unis; Par conséquent, la culture cellulaire est plus économique et une alternative viable, ainsi que de plus en plus vital pour HoCV-01 détection et la réplication 2,9. Bien que les méthodes de base pour établir des cultures de cellules de H. vitripennis sont décrites, ces méthodes n&#39;ont pas encore été utilisées pour la production commerciale d&#39;agents de lutte biologique, tels que les virus 2. L&#39;objectif global des procédures suivantes est de produire une forte concentration de HoCV-01 convient pour une utilisation comme agent de lutte biologique. La réplication virale nécessite une cellule vivante, ce qui explique pourquoi cultiver avec succès et l&#39;optimisation de H. vitripennis cultures est vitale pour le progrès de produire des niveaux rentables de virus.

<table><tbody><tr><td>Fioles de culture cellulaire Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Surface 25 cm2, col incliné, capuchon (joint d’étanchéité)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Microscope inversé et caméra</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0,25 %, filtré stérile, BioReagent, adapté à la culture cellulaire, 2,5 g de trypsine porcine et 0,2 g d’EDTA &bull ; 4Na par litre de Hanks&prime ; Solution saline équilibrée avec rouge de phénol</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Plaques de culture multipuits</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 puits (TC traité avec couvercle)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Diéthyldithiocarbamate de sodium trihydraté</td></tr><tr><td>Système de filtration sous vide pour bouteille Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Membrane en acétate de cellulose, taille des pores 0,45 & mu ; m, surface de la membrane 54,5 cm2, capacité du filtre 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polyéthylène glycol hexadécyléther</td></tr><tr><td>Solution tampon de phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Reçu sous forme de 100 mM dilué à 10 mM avec de l’eau stérile</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>Pour électrophorèse</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioRéactif, pour la biologie moléculaire, poudre</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4 % de paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Qualité réactif, cristallin</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Phosphate solution saline tamponnée</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine red conjuguée phalloïdine</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>La rhodamine phalloïdine est une sonde de haute affinité F-actine conjuguée au colorant fluorescent rouge-orange, tétraméthylrhodamine</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Système méta confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Logiciel</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Milieu insecte (supplémenté, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ cicadelle medium component</td></tr><tr><td>L-histidine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ cicadelle medium component Medium</td></tr><tr><td>199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ cicadelle medium component</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ cicadelle medium component</td></tr><tr><td>Hank' s Sels équilibrés (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ cicadelle moyenne composant</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ cicadelle moyen composant</td></tr><tr><td>MEM, mélange d’acides aminés (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ cicadelle moyen composant</td></tr><tr><td>1 M MgCl solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ cicadelle moyenne</td></tr><tr><td>composant Pen-Strep (avec / glutamine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ cicadelle moyenne composant</td></tr><tr><td>Nystatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ cicadelle moyenne composant</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ cicadelle moyenne</td></tr><tr><td>composant Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ cicadelle moyenne composant</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ cicadelle medium composant</td></tr></tbody></table>

propagation d&#39;<em&gt; virus-01 homalodisca coagulata</em&gt; par<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; culture cellulaire

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Le tireur vitreux ailé (Homalodisca vitripennis) est un insecte extrêmement polyphage et vagile trouvé dans tout le sud-ouest des États-Unis. Ces insectes sont les vecteurs prédominants de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), une bactérie du xylème limitée qui est l&#39;agent causal de la maladie de Pierce (PD) de vigne. La maladie de Pierce est économiquement dommageable; Ainsi, H. vitripennis sont devenus une cible pour des stratégies de gestion de l&#39;agent pathogène. Un dicistrovirus identifié comme virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) a été associée à une mortalité accrue chez H. populations vitripennis. En raison d&#39;une cellule hôte est nécessaire pour la réplication HoCV-01, la culture de la cellule fournit un environnement uniforme pour la réplication qui est ciblé sur le plan logistique et une valeur économique pour la production de bio-pesticide. Dans cette étude, un système de propagation à grande échelle de H. vitripennis cellules via la culture de tissus a été développé, pournir un mécanisme de réplication virale. HoCV-01 a été extrait des insectes de tout le corps et utilisée pour inoculer H. culture vitripennis cellules à différents niveaux. Le milieu de culture a été prélevé toutes les 24 h pendant 168 heures, l&#39;ARN extrait et analysé par qRT-PCR. Les cellules ont été colorées avec du bleu trypan et on les compte pour quantifier la survie des cellules en utilisant la microscopie optique. Particules virales entières ont été extraites jusqu&#39;à 96 heures après l&#39;infection, qui a été le point d&#39;être déterminé avant l&#39;effondrement total de culture cellulaire a eu lieu de temps. Les cellules ont été également soumis à coloration fluorescente et visualisés en utilisant la microscopie confocale pour étudier l&#39;activité virale sur l&#39;intégrité de l&#39;attachement et des noyaux F-actine. La conclusion de cette étude est que H. cellules vitripennis sont capables d&#39;être cultivées et utilisées pour la production de masse de HoCV-01 à un niveau approprié pour permettre la production d&#39;un biopesticide.

attachement cellulaire et la croissance a été observée dans les 48 heures de passage dans les deux petites et grandes flacons de culture, de cultures primaires et les passages continus. la croissance des fibroblastes et le développement a également été observée dans ce laps de temps. Lorsque flacons nouvellement ensemencées ont été perturbés avant 48 h, il y avait un déclin visible dans la fixation des cellules, conduisant à des cultures à croissance plus lente et parfois pas de fixation ou de croissance du tout. Les ce...

Nous présentons ici un protocole de propager les cellules de Homalodisca et HoCV-1 in vitro. Le milieu a été retiré de HoCV-1 et des cultures positives ARN extrait tous les 24 h pendant 168 h. Cellule de survie a été quantifiée par coloration au bleu trypan. Particules virales entières ont été extraits après l&#39;infection. L&#39;ARN extrait a été quantifiée par qRT-PCR.

Propagation d&#39;<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Par<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Culture Cellulaire

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer si le virus un de Homalodisca coagulata, ou HOCV-un, peut être répliqué à l'aide de cultures cellulaires de Homalodisca vitripennis, puis extrait pour des utilisations ultérieures. Cet objectif est atteint en cultivant avec succès H. vitripennis afin d'introduire du HOCV-un purifié pour permettre sa réplication. Dans un deuxième temps, le milieu et les cellules contenant le virus sont prélevés de la culture, puis soumis à des extractions de virus et d'ARN. Ensuite, l'ARN extrait des cultures infectées est soumis à une PCR afin de déterminer si l'ARN viral est présent dans les cellules. Les résultats montrent que le HOCV peut se répliquer in vivo, sur la base du décompte des cellules vivantes avant et après l'infection et d'une analyse par qRT-PCR.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'élevage d'insectes vivants infectés, est qu'elle est plus économique et facilement gérable avec un minimum d'installations et d'équipements. L'utilisation de cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la lutte biologique. Par exemple, un virus d'insecte ou un virus spécifique à une espèce d'insecte peut-il être utilisé pour contrôler un ravageur à grande échelle ?Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la gestion de cet insecte spécifique, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme la gestion des fourmis de feu rouges importées à l'aide d'un virus de la même famille que le HOCV. Avant de commencer cette procédure, cultivez et maintenez les cultures dans des flacons de culture tissulaire de 25 centimètres carrés en utilisant le milieu H2G enrichi pour cicadelles, un milieu pour abeilles modifié WH-deux. Homogénéisez les corps entiers de H. vitripennis positifs au virus dans un tampon phosphate contenant 0,02 % de DETCA par vortexage par intervalles d'environ dix secondes jusqu'à disparition complète des gros agrégats tissulaires. Extrayez le virus par ultracentrifugation à 22 000 g pendant 16 heures à quatre degrés Celsius.Après avoir éliminé le surnageant, récupérez le culot et dissolvez-le dans cinq millilitres de tampon phosphate 10 millimolaire contenant 0,4 % d'acide sodium désoxycholique et 4 % d'éther hexadécyl de polyéthylène glycol. Pour bien mélanger le culot, détachez-le de la paroi du tube et broyez-le si nécessaire. Après une centrifugation à 300 ×g pendant 15 minutes, éliminez le surnageant, puis faites passer la solution à travers un filtre de 0,45 micromètre et récupérez le filtrat dans un grand tube de collecte.Transférez le filtrat dans une membrane de dialyse ayant un seuil de coupure en poids moléculaire de 3,5 kilodaltons, en utilisant de petites quantités de tampon phosphate 10 millimolaire ne contenant pas de DETCA si nécessaire. Placez la membrane de dialyse dans un grand bécher rempli d'eau doublement distillée à quatre degrés Celsius. Renouvelez l'eau toutes les heures pendant cinq à six heures, jusqu'à l'apparition d'un précipité blanc dans la membrane. À ce stade, ensemencez les cellules dans des plaques de culture 48 puits.Lorsque la croissance cellulaire atteint 80 % de confluence, inoculez chaque rangée de cellules avec le virus dilué en série. Ajoutez ensuite 10 microlitres d'eau doublement distillée dans chaque puits comme contrôle de volume. Afin d'établir une concentration initiale de référence des cellules pour la comparaison avec les dénombrements cellulaires expérimentaux, dissociez le premier puits de chaque rangée avant l'inoculation initiale de n'importe quel puits des cultures avec le virus. Ensuite, comptez les cellules.Ensuite, retirez tout le milieu de la colonne qui a été imagée à chaque point temporel de 24 heures et conservez-le à moins 20 degrés Celsius pour l'extraction d'ARN et la quantification virale. Après avoir extrait le virus des cellules en culture selon le protocole décrit précédemment, extrayez l'ARN à partir des échantillons de milieu recueillis lors de chaque essai viral hebdomadaire en utilisant une extraction au thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme conçue pour les échantillons liquides, conformément au protocole du fabricant. Pour la RT-PCR, établissez des étalons viraux en réalisant une PCR classique à l'aide de la paire d'amorces HOCV RT-PCR primer-one avec un isolat viral provenant du corps entier de H. vitripennis.Ensuite, effectuez une série de dilutions sérielles d’un facteur dix de l’échantillon purifié, allant de 57 nanogrammes par microlitre à 57 attogrammes par microlitre. Déterminez les limites de détection de la série de dilutions par qRT-PCR en utilisant un kit de qRT-PCR permettant une quantification fiable des transcrits peu abondants.Après avoir extrait l'ARN à partir des échantillons expérimentaux comme décrit précédemment, quantifiez à l'aide de la spectrophotométrie. Ensuite, effectuez une qRT-PCR sur tous les échantillons en double, sous forme de réactions de 25 microlitres, en utilisant un kit de qRT-PCR en une étape capable de détecter les faibles nombres de copies comme suit. Préparez le mélange maître de sorte que chaque mélange de réaction contienne 12,5 microlitres de mélange maître 1x, 1,0 microlitre d'amorce sens à 0,3 micromolaire, 1,0 microlitre d'amorce antisens à 0,3 micromolaire, 0,25 microlitre de transcriptase inverse et des quantités variables d'ADN matrice selon les valeurs de standardisation. Puis, ajustez le volume total de la réaction à 25 microlitres avec de l'eau dépourvue d'ARN. Incluez cinq concentrations standards dans chaque cycle de PCR : cinq fois 10 à la puissance moins 10, cinq fois 10 à la puissance moins 8, cinq fois 10 à la puissance moins 6, cinq fois 10 à la puissance moins 4 et cinq fois 10 à la puissance moins 2 copies. Réglez le seuil pour chaque cycle juste en dessous d'une fluorescence de 10 à la puissance -2,5 afin de réduire le bruit durant l'acquisition initiale au début de chaque cycle. Une fois que les cellules de Homalodisca vitripennis ont été cultivées dans une plaque de 12 puits contenant des lamelles de verre, inoculer une colonne toutes les 24 heures pendant quatre jours, dès qu'une monocouche est obtenue avec le virus extrait. À la fin, fixer les cellules avec du paraformaldéhyde froid à 4 % à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, ajouter 500 microlitres de PBS 1X aux cellules et les laver pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur à faible vitesse. Après avoir lavé les cellules trois fois, ajouter 500 microlitres de TritonX-100 à 0,1 % pour perméabiliser les cellules pendant 10 minutes.Une fois les cellules lavées avec du PBS 1X, ajouter 500 microlitres d'une solution d'albumine de sérum bovin à 5 % pour bloquer les cellules à température ambiante. Après deux heures, retirer la solution des cellules. Ensuite, ajouter 250 microlitres d'une solution diluée de Phalloidine conjuguée à la Rhodamine-Rouge dans chaque puits afin de marquer l'actine F. Couvrir la plaque avec du papier d'aluminium pour éviter que le colorant ne se décolore et incuber les cellules à quatre degrés Celsius toute la nuit. Après l'incubation, retirer la solution de rhodamine et la remplacer par 250 microlitres de DAPI dilué dans du PBS 1X contenant 5 % de BSA afin de marquer les noyaux des cellules. Après une incubation d'une heure à température ambiante, laver les cellules trois fois avec du PBS 1X comme décrit précédemment.Enfin, retirez délicatement les lamelles des puits et montez-les sur des lames de microscope en utilisant un milieu de montage contenant un réactif antifade.L'attachement cellulaire et le développement des fibroblastes ont été observés dans les 48 heures suivant le passage dans des flacons de culture petits et grands. Lorsque les flacons nouvellement ensemencés étaient perturbés, on notait une diminution de l'attachement cellulaire, entraînant des cultures à croissance plus lente, voire parfois aucun attachement ni croissance.Les cellules étaient environ à 80 % confluentes après une semaine et formaient une monocouche en 10 à 14 jours. Les cultures infectées présentaient des signes de dégradation de l'intégrité de la forme cellulaire, et des trous importants étaient visibles à la surface des cellules 48 heures après l'infection. Les cellules rétrécissaient et se détachaient de la surface de culture environ 72 à 96 heures après avoir été infectées avec le HOCV-one non dilué. Le nombre moyen de cellules vivantes a été représenté graphiquement afin de montrer les différences d'abondance des cellules vivantes entre les charges virales au fil du temps. Les groupes traités avec une charge virale plus élevée montrent un déclin beaucoup plus marqué de la santé des cultures, avec une forte diminution du nombre de cellules vivantes entre 48 et 72 heures. En revanche, les groupes à faible charge virale ont connu un déclin lent, suivi d'une chute vers 144 heures. La probabilité de survie des cellules inoculées avec des charges virales plus élevées était plus faible, comme l'ont montré les courbes de Kaplan-Meier, ce qui corrobore les analyses du nombre moyen de cellules vivantes. Bien que non significatif, les données suggèrent que les cellules exposées au virus ont 88 % plus de chances de présenter des taux de survie plus bas au fil du temps. La diminution du nombre de noyaux présents ainsi que l'aspect altéré de l'actine F dans les cellules exposées au HOCV-one indiquent un impact majeur sur la culture.Les cellules saines exposées à la charge virale la plus élevée, soit 10, ont montré un stress accru. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer chaque étape du protocole en temps voulu, car certaines étapes sont sensibles au temps et à la température. Après cette procédure, d'autres méthodes comme le test ELISA peuvent être utilisées pour répondre à des questions essentielles, par exemple, quelle quantité de virus est présente dans une culture cellulaire après l'inoculation de quantités variables de virus ? Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser une lignée cellulaire d'insecte pour répliquer un virus à ARN, extraire ce virus, puis le quantifier par qRT-PCR.

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous utilisons un adénovirus porteur du gène de la recombinase Cre pour infecter les fibroblastes de souris embryonnaires primaires portant un allèle floxés Rac1.

Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

Nous décrivons une méthode pour traiter et d'un écran moustiques récoltés sur le terrain pour une diversité des virus par un test de culture de cellules Vero. En employant cette technique, nous avons détecté 9 virus différents de 4 familles taxonomiques dans les moustiques collectés dans le Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

virus de la vaccine (VV) a été largement utilisé dans la recherche biomédicale et l'amélioration de la santé humaine. Cet article décrit une méthode simple, très efficace pour modifier le génome de VV en utilisant un système CRISPR-cas9.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

HERPESVIRUS de dindons et dindes (HVT) est largement utilisé comme une plateforme de vecteur pour la génération de vaccins recombinants contre un certain nombre de maladies aviaires. Cet article décrit une méthode simple et rapide pour la génération de vaccins recombinants HVT-guidé à l’aide d’un NHEJ-CRISPR/Cas9 intégré et système de Cre-Lox.

Génération des vecteurs recombinants Avian Herpesvirus avec CRISPR/Cas9 gène édition

Ce protocole décrit comment établir une infection virale in vivo chez Drosophila melanogaster en utilisant la méthode de nano-injection et les techniques de base pour analyser l’interaction virus-hôte.

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Ce protocole décrit un processus expérimental pour produire des particules virales pseudotyped infectieuses à haut titre (pp) avec des glycoprotéines d'enveloppe de deux souches de grippe A et comment déterminer leur infectiosité. Ce protocole est très adaptable pour développer des pps de n'importe quel autre type de virus enveloppés avec différentes glycoprotéines d'enveloppe.

Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

Décrit ici est une méthode efficace sur la façon de produire des stocks de trier virale élevé du virus de l’hépatite E (HEV) pour infecter efficacement les cellules hépatomes. Avec la méthode présentée, les particules virales non enveloppées et les particules virales enveloppées peuvent être récoltées et utilisées pour inoculer diverses lignées cellulaires.

Un modèle de culture cellulaire pour la production de stocks élevés de virus de l’hépatite E de Titer

De nombreuses nouvelles séquences pseudo-virales ont été trouvées chez les moustiques en raison de l’utilisation intensive des technologies de séquençage. Nous fournissons une procédure efficace pour isoler et amplifier les virus à l’aide de lignées cellulaires de vertébrés et de moustiques, qui pourrait servir de base à de futures études sur les virus associés aux moustiques, y compris les virus transmis par les moustiques et les virus spécifiques aux moustiques.

Isolement du virus associé aux moustiques à partir de moustiques collectés sur le terrain

Découvrez la propagation du virus HoCV-1 en culture cellulaire d'Homalodisca vitripennis. Cette méthode permet d'extraire et quantifier l'ARN viral par qRT-PCR pour étudier la réplication virale in vitro.

Propagation d'

Explorer plus de vidéos