Name: Vibratome sectionnement rétine de souris pour préparer des cultures photoréceptrices (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Apprenez à isoler la couche des photorécepteurs de la rétine de souris par sectionnement au vibratome pour des cultures primaires. Cette méthode permet d'étudier la biologie rétinienne et d'explorer des thérapies contre les dégénérescences héréditaires.

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Igal Gery et David Hicks pour les anticorps anti-SAG. Ram Fridlich pour la lecture du manuscrit.

NOTE: La procédure a été approuvée par le comité d&#39;éthique de l&#39;Université de Darwin Pierre et Marie Curie (CE5 / 2009/048) 1. Préparation de la solution de gélatine, Instruments, Vibratome, Culture, des Médias et de la Culture Plate <ol><li> Préparer une solution de gélatine à 20% d&#39;au moins un jour avant l&#39;expérience. <ol><li> Sous le capot, ajouter 500 pi de gentamicine [10 mg / ml] pour une bouteille de 500 ml contenant du CO 2 moyennes indépendante (CO 2 -i). </li><li> Dans un bêcher séparé, ajouter 20 ml de CO2-I (de l&#39;étape 1.1.1) et chauffer à 95 ° C sur un bloc chauffant avec une agitation constante pendant 15 min. Observer un changement de couleur au jaune, indiquant que la solution est prête pour une nouvelle utilisation. </li><li> Peser 4 g de gélatine et pauvre graduellement à la solution préparée ci-dessus (étape 1.1.2), sous agitation accrue et chauffage à 95 ° C pendant 45 min, pour obtenir une solution de couleur jaune. Laisser la solution de gélatine refroidir sousla hotte pendant environ 5 min. </li><li> Verser 4 ml de la solution de gélatine dans 35 mm des boîtes de culture de diamètre sans introduire de bulles d&#39;air. Gardez le plat à 21 ° C pendant 30 min. Couvrez les plats avec un film plastique, et tourner les plats à l&#39;envers. Eventuellement, stocker les plats à 4 ° C pendant jusqu&#39;à deux mois avant utilisation. </li></ol></li><li> Préparer une solution de gélatine à 4%. <ol><li> Sous le capot, ajouter 25 ml de CO 2 -i milieu dans un récipient en plastique stérile, et on chauffe à 42 ° C sur un bloc chauffant. Retirez le support du bloc de chauffage et ajouter graduellement 1 g de gélatine au milieu chaud et remuer. Revenir rapidement le récipient sur le bloc de chauffage (42 ° C) et le garder au chaud pendant le processus. </li></ol></li><li> Mise en place de l&#39;appareil vibratome: <ol><li> Retirer les boîtes contenant une solution de gélatine à 20% conservé à 4 ° C. Coupez la gélatine avec un scalpel. Retournez la tranche de la gélatine et le coller sur le disque de support noir du vibratome en utilisant une goutte de super colle. </li><li> Casser une lame de rasoir en deux moitiés, et insérez une moitié dans le vibratome tenant réceptacle. Insérez le disque de support noir sur l&#39;appareil de vibratome. Tournez sur le bouton noir sur le côté droit. Fixer le récipient contenant sur la tête de la vibratome. Ajouter une quantité suffisante de CO 2 -i milieu dans le réservoir de vibratome pour couvrir le bloc de gélatine. </li><li> Allumez le vibratome et couper trois tranches de 100 um bloc de gélatine. Gardez le bloc de gélatine pour une utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Préparer 40 ml de milieu de culture: <ol><li> Préparer un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de veau foetal (FCS) sous le capot. Préparer 1 mg / ml de poly-D-lysine en utilisant une solution saline tamponnée phosphate (PBS) pH 7,4. </li><li> Dans une plaque à 96 puits, ajouter 2 g / cm 2 de Poly-D-Lysine pour revêtir le fond des puits. Incuber la plaque pendant 45 min à 37 ° C sous 5% de CO 2 incubateur. Après l&#39;incubation, retirer et remplacer PBS avec 200 pi/ Puits DMEM et le lieu à nouveau à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur avant d&#39;utiliser. </li></ol></li></ol> 2. Dissection de Retina entière <ol><li> Énucléer la souris: <ol><li> Sacrifiez la souris selon la directive européenne 2010/63: par dislocation cervicale. Couper la tête avec des ciseaux courbés et placez-le dans une boîte de Pétri de diamètre 100 mm après avoir désinfecté l&#39;œil avec un désinfectant. </li><li> Retirer l&#39;oeil après avoir détaché le nerf optique en sectionnant l&#39;aide très soigneusement une poignée incurvée. Ensuite, placez les deux yeux dans un plat de 35 mm de Pétri contenant du CO 2 moyennes -i stérile à 21 ° C. </li></ol></li><li> Retrait de la rétine: <ol><li> Faire un trou au niveau de l&#39;œil-membre avec l&#39;aide d&#39;une aiguille de 18 G pour être en mesure d&#39;introduire les ciseaux dans le globe oculaire. Présentez-ciseaux droits à l&#39;intérieur du trou et découpez soigneusement la sclérotique ci-dessous l&#39;iris sur tout le périmètre du globe oculaire pour enlever le corps ciliaire. </li><li&gt; Retirez la cornée et le cristallin et de garder la chambre postérieure de l&#39;œil avec le contiguë rétine à la sclérotique. Avec deux pinces fines, retirer le corps vitré situé à l&#39;intérieur de la chambre postérieure sans endommager la rétine. Effectuer quatre coupes radiales (rétine / sclère) pour permettre un aplatissement de la rétine. </li><li> Reprise du globe oculaire et peler comme un &quot;orange&quot;. Détachez la rétine de la sclérotique et l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (RPE). Détachez la rétine encore attaché au niveau du nerf optique très soigneusement avec de fines courbes-ciseaux. </li><li> Détacher le corps vitré restante de la périphérie vers le centre de la rétine avec deux pinces fines. Assurez-vous que tout le corps vitré est complètement retiré pour permettre l&#39;aplatissement de la rétine. </li><li> Couper l&#39;extrémité d&#39;une pipette en plastique et le transfert de la rétine à plat de diamètre 35 mm de Pétri contenant du milieu -i CO 2 avec la pipette en plastique. </li></ol></li></ol> 3. étanchéité de Flat-Mounted Retina sur gélatine Bloquer <ol><li> Retirer 20 à 30 ml de CO 2 -i milieu de la cuve de vibratome (le bloc est libre de gélatine) pour permettre le scellage de la rétine à plat monté. </li><li> Transférer la rétine sur une lame de verre en utilisant une pipette en plastique et ajouter une goutte de milieu -i CO 2 avant le transfert à la tranche de la gélatine avec le photorécepteur vers le bas sur la tranche de la gélatine. </li><li> Attacher la rétine au bloc de gélatine en injectant lentement réchauffé 4% de gélatine sur une face du bloc entre la rétine et le bloc de gélatine et expulsant simultanément gélatine chaude de l&#39;autre côté. </li><li> Aspirer 4% de gélatine avec une pipette Pasteur. Attendez 10 minutes pour permettre une étanchéité totale. Ajouter CO 2 moyennes -i pour immerger le bloc et la lame complètement. </li></ol> 4. sectionner le Retina NOTE: Cette étape est essentielle pour obtenir une couche de cellules photoréceptrices sans les autres cellules de la rétine (Figure 1). <ol><li> En partant du haut sur le bloc de gélatine, couper 100 um coupes en série pour atteindre la rétine. Ensuite, couper 100-120 um sections de la couche interne. Selon l&#39;application, cette couche peut être jeté ou conservé dans de l&#39;azote liquide. Assurez-vous que la vitesse de la vibratome est très lent (à 1 ou 2) au cours de la découpe des couches de couches ou photorécepteurs intérieures. </li><li> Effectuer sections intermédiaires 15 um de la rétine correspondant à l&#39;interface entre l&#39;intérieur et la rétine externe. Observez cette section sous un microscope. L&#39;absence de vaisseaux sanguins indique que la rétine externe a été atteint. </li><li> Couper 200 um de la rétine externe (la couche photoréceptrice) avec de la gélatine et le transférer dans un plat de 35 mm de diamètre rempli de 3 ml de milieu 2 CO -i. Conserver sur de la glace jusqu&#39;à ce que toutes les sections de couche de photorécepteur de tous les rétines sont obtenus. </li></ol> 5. Les cellules photoréceptrices dissociant <ol><li> Sortez le plat (s) contenant la couche (s) de photorécepteur et mettre le (s) dans un incubateur à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Aide d&#39;une pince doucement séparer la couche des photorécepteurs de la gélatine et le transférer dans un nouveau plat rempli avec 3 ml de la solution de Ringer. Répéter cette étape (5.2) pour chaque préparation de la couche de photorécepteur. </li><li> Incuber 2 unités de papaïne avec 25 pi de solution d&#39;activateur (mM EDTA 1,1; 5,5 mM de L-cystéine; 60 uM β-mercaptoéthanol) en un polypropylène tube stérile de 5 ml et incuber 30 min à 37 ° C sous 5% de CO 2 incubateur . L&#39;activation de la papaïne est réalisée à 37 ° C. Pendant cette incubation, couper la couche des photorécepteurs en 2 mm 2 morceaux (pas trop petits) et de transférer ces morceaux dans un tubes de 5 ml. </li><li> Rincer la rétine deux fois avec 1,5 ml de solution de solution de Ringer, suivie par sédimentation par gravité. Enlever toute solution restante de Ringer du tube avec le spécimen. </li><li> Ajouter 475 ul de la solution de Ringer au tube contenant de la papaïne activée et mélange. Ajouter cette solution dans le tube contenant la rétine. </li><li> Incuber le tube avec la rétine pendant 20 min à 37 ° C sous 5% de CO 2 incubateur. Arrêter la réaction en ajoutant 1 ml de FCS à 10% dans du DMEM. Ajouter 25 U de désoxyribonucléase I (DNAse I) à l&#39;ADN digéré à partir de cellules de la mort. Homogénéiser soigneusement la suspension de cellules en utilisant une pipette de 1 ml-. Spin à 50 g pendant 6 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant pour éliminer les traces de sérum et ajouter du milieu DMEM avec des suppléments (voir tableau des reagents_equipment spécifique) à la cellule-culot et remettre soigneusement la suspension de cellules avec une pipette de 1 ml. Spin à 50 g pendant 6 min à température ambiante. Répétez cette étape (5,7) une fois de plus. </li></ol> Culture de cellules photoréceptrices 6 <ol><li> La couche photoréceptrice d&#39;une souris à PN8 contient environ 1 à 1,5 million de cellules en utilisant cette technique. Ensemencer les cellules photoréceptrices à 1x 10 5 cellules / cm 2 dans une plaque de culture avec du milieu de culture et la culture des cellules pendant 5 jours à 37 ° C sous 5% de CO 2 incubateur. Au jour 5, passez à l&#39;immunochimie et d&#39;étude suivant des méthodes de transfert de Western fournies par les fournisseurs d&#39;anticorps. REMARQUE: des mesures pour arrêter la culture et les essais préliminaires sont décrits dans la référence 21. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La rétine est un organe de modèle en biologie. Étude de la rétine a conduit à six grandes découvertes en biologie. Il est à l&#39;origine du premier gène suppresseur de tumeur RB1. Il révèle la liaison moléculaire entre les tyrosine kinases de récepteur et les MAP kinases par l&#39;interaction avec Fils de sevenless. Il a été impliqué dans la découverte de PAX6, le premier gène de commande maître pour la morphogenèse d&#39;organes. Il est au centre de l&#39;association génétique du facteur de complément H (CFH) à la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge (DMLA), le premier gène de susceptibilité à la maladie identifié par écran large génome d&#39;association (GWAS). Enfin, il a conduit à la première thérapie génique réussie pour amaurose congénitale de Leber, le premier essai de thérapie génique chez l&#39;homme correctives de toute maladie héréditaire. La structure de cet organe est conservée dans la plupart des espèces de vertébrés. Son accessibilité pour la manipulation in vivo a encouragé dès le début de génomique fonctionnelle des enquêtes sur cette partie intégrante du central système nerveux. Nous montrons ici comment séparer la couche de photorécepteur à partir de la couche interne de la rétine par sectionnement vibratome. Cette étape est essentielle pour obtenir des cultures pures de photorécepteur. Notre protocole de dissection rend la contamination par des cellules RPE très peu probable. L&#39;un des principaux défis est l&#39;aplatissement de la rétine qui est nécessaire à la section correctement l&#39;intérieur et la rétine externe. Le sectionnement de la rétine est préférable de rétine avec un petit diamètre que ceux des rongeurs et ce diamètre est une limitation de la technique avec des matériaux actuellement disponibles. Il est recommandé avant de commencer une expérience biologiquement significative, à pratiquer sur un échantillon de la rétine. Nous illustrons la méthode par des résultats représentatifs obtenus à partir de cellules photoréceptrices de culture, en utilisant le matériel pour effectuer l&#39;étude de l&#39;expression des deux ARNm et des protéines. Des études d&#39;expression peuvent également être réalisées en variante sur sections obtenus par microdissection laser, mais les cultures sont réalisées en utilisant mieux vibratome sectionnement. Nous aurions pu utiliser la technique de microdissection laser avec une stratégie complètement différente. Mais, pour collecter la couche de photorécepteur avec le dispositif de microdissection pour la culture, il serait nécessaire d&#39;éviter fixateur et cela compliquerait sensiblement la méthodologie actuelle. Nous développons un protocole visant à étudier la cinétique de l&#39;expression génique et protéique dans vibratome sections au cours de la dégénérescence des photorécepteurs dans les modèles de la rétinite pigmentaire. Nous croyons que la description détaillée du protocole sera utile aux chercheurs dans le domaine de la biologie de la rétine, et tout particulièrement pour les études protéomiques et métabolomiques.

La rétine est une partie intégrante du système nerveux central qui présente une architecture conservée chez les vertébrés. Les neurones de la rétine neurale sont organisés en couches, avec le plus éloigné de la lumière incidente, la couche de photorécepteur en contact étroit avec l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l&#39;arrière de l&#39;œil. Bâtonnets et des cônes photorecptors sont des cellules sensibles à la lumière qui se appuient sur des molécules sensibles opsin pour la capture des photons. Ces molécules sont jointes sur des membranes de disque d&#39;une structure alvéolaire, situé sur le segment externe du photorécepteur qui pointe dans la direction de l&#39;EPR 1. Cette structure, qui est le plus souvent touché très tôt dans les cas de dégénérescence des photorécepteurs, est renouvelé au taux de 10% tous les jours. La couche dite interne contient la plupart des autres neurones qui calculent le signal reçu en provenance des photorécepteurs, les bipolaires, amacrines et de cellules horizontales ainsi que les cellules ganglionnaires. Ces derniers avec leurs axonesformer un faisceau qui est le nerf optique. Cette superposition est donc conservé que les biologistes ont utilisé le terme déplacées cellules amacrines lorsque les cellules se trouvent en dehors de la couche interne plexiforme 2. Couches de neurones sont répartis au sein d&#39;une armature des cellules gliales radiales Müller. Cellules bipolaires lien photorécepteurs aux cellules ganglionnaires. Elles sont situées entre la couche plexiforme externe et la couche plexiforme interne. Les cellules ganglionnaires forment la couche plexiforme interne en relation avec les cellules bipolaires. Les cellules amacrin sont nommés comme des cellules d&#39;association situés dans la couche plexiforme interne entre les cellules bipolaires et les cellules ganglionnaires. La couche plexiforme externe contient des cellules horizontales. Cet arrangement unique de couches neuronales du système nerveux central permet l&#39;isolement de la couche photoréceptrice de la couche cellulaire interne par tranchage de la rétine à plat monté en utilisant un vibratome. À l&#39;origine, cette technique a été utilisée pour isoler photorécepteurs pour transplantation dans l&#39;oeil de la souris rd1, un modèle de la rétinite pigmentaire humaine (RP) 3. La souris rd1 porte une mutation dans le gène récessif PDE6B qui code pour la sous-unité bêta de la phosphodiestérase spécifique de tige. Mutations récessives de ce résultat de gène dans RP chez les humains 4. Après photorécepteurs ont dégénéré en forme de tige, le patient perd la vision de nuit, de façon surprenante et photorécepteurs de cône, qui ne expriment pas le gène muté, dégénèrent en tant que seconde étape. Parce que les cônes sont nécessaires pour la vision des couleurs et l&#39;acuité visuelle, les patients deviennent progressivement aveugle et un traitement efficace de la maladie n&#39;a pas encore développé. En greffant couche des photorécepteurs d&#39;une souris de type sauvage la dégénérescence de cône de la souris hôte est retardée 3,5. Les tiges perdus dans le modèle de dégénérescence tige-cône ne pourraient être remplacés par une greffe parce que la connexion synaptique entre les tiges et les cellules bipolaires ne peut être obtenue à un stade spécifique de retinal développement, marqué par l&#39;apparition de Nrl expression 6. La couche de photorécepteurs est introduit par chirurgie dans l&#39;espace sous-rétinien de la rétine RD1 moins de tige, entre le RPE et la rétine externe correspondant à seulement 3% des photorécepteurs restants, les cônes. Deux semaines après la chirurgie, 40% des cônes de l&#39;animal transplanté d&#39;une couche photoréceptrice a survécu à la normale par rapport à l&#39;animal transplanté d&#39;une couche de cellules de la rétine normale intérieures ou à l&#39;animal pseudo-opérées. La topographie de la survie de cône, étalée sur toute la surface de la rétine mutée situé à la position du tissu greffé indique que l&#39;effet protecteur est due à une molécule diffusible 7. Ensuite, nous avons utilisé un système de co-culture, ainsi que des milieux de culture conditionnés pour valider le fait que l&#39;effet protecteur se appuie sur la sécrétion d&#39;une protéine par des tiges 8,9. Nous émettons l&#39;hypothèse que cette protéine sera exprEssed en continu et en particulier par des tiges et que leur mort au cours de la première phase de la maladie va déclencher la dégénérescence du cône secondaire par la perte d&#39;un signal de protection à partir de tiges de manière autonome sans cellule 10. En raison de l&#39;importance de cône médiation vision centrale chez les primates cette protéine putative sera un outil thérapeutique très pertinent pour RP. Préserver les cônes dans RP serait théoriquement empêcher un total de 1,5 millions de patients du monde entier à devenir aveugle 11. Nous avons utilisé une approche de dépistage teneur élevée et un modèle de culture de cône enrichi à identifier un ADNc codant Cone Rod dérivés viabilité Factor (RdCVF) à partir d&#39;une banque d&#39;ADNc de la rétine 12. RdCVF est le produit épissé du gène NXNL1 qui est intéressant homologue au gène codant pour des protéines analogues à la thiorédoxine impliqués dans l&#39;homéostasie redox 13. Le deuxième produit épissé du gène, RdCVFL est une enzyme qui protège sa cible, la protéine tau contre la dégradation oxydative dAmage 14. L&#39;administration de RdCVF empêche la dégénérescence secondaire des cônes et la perte de leur fonction visuelle dans un récessif, et le modèle dominant de RP 12,15. Cela démontre deux aspects importants de cette stratégie thérapeutique innovante 16. En premier lieu, elle peut être appliquée dans la plupart des cas de RP dans un gène de manière indépendante. Deuxièmement, contrairement au facteur concurrence survie CNTF, RdCVF est associée avec le maintien de la fonction visuelle 17. L&#39;absence de l&#39;effet fonctionnel peut expliquer la raison de l&#39;absence de bénéfice clinique de l&#39;administration de CNTF aux patients atteints de RP 18. RdCVF est probablement l&#39;un du signal de survie importante entre les bâtonnets et les cônes depuis cône sauvetage in vitro est inhibée par 12 RdCVF immunodéplétion. En outre, la disruption du gène cône viabilité tige dérivé conduit à un dysfonctionnement photorécepteur et la sensibilité au stress oxydatif 19. L&#39;utilisation decouche photoréceptrice est à l&#39;origine de l&#39;identification de RdCVF et d&#39;un signal de nouveau redox impliqués dans des maladies neurodegeneratives 20. Ce manuscrit décrit le protocole utilisé pour isoler et cultiver des cellules de la couche de photorécepteur pour caractériser l&#39;activité de RdCVF. Les photorécepteurs peuvent être maintenues en culture pendant 5 à 7 jours 21. Cette technique peut également être utilisée pour étudier l&#39;expression de gènes spécifiques de photorécepteur.

<table><tbody><tr><td>Cytidine 5&prime ;-diphosphocholine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0256</td><td>4.7 &micro ; M Cytidine 5&prime ;-diphosphocholine</td></tr><tr><td>Cytidine 5&prime ;-diphosphoéthanolamine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0456</td><td>2.7 & micro ; M Cytidine 5&prime ;-diphosphoéthanolamine</td></tr><tr><td>Linole&iuml ; acide c/ albumine sérique bovine (BSA)*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8384</td><td>100 &micro ; g/ml de linole&iuml ; acide c/ albumine sérique bovine (BSA)</td></tr><tr><td>Triiodo-L-thyronine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>0,03 & micro ; M Triiodo-L-thyronine</td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>Greiner bio-one</td><td>655-095</td><td></td></tr><tr><td>Microscope binoculaire</td><td>Leica</td><td>MZ-75</td><td></td></tr><tr><td>CO2 indépendant (CO2-i)</td><td>Life Technologies</td><td>18045054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Forceps n&deg ; 5 Dumont</td><td>Bionic</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porcin de type A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip&nbsp ;</td><td>Affymetrix</td><td>U74v2</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Life Technologies</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>0.55 &micro ; M hydrocortison</td></tr><tr><td>Insuline* (I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0,86 & micro ; M insuline (I)</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington-biochem</td><td>WOLS03124</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6407</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556&nbsp ;</td><td>2.0 et micro ; M progestérone</td></tr><tr><td>Prostaglandine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5172</td><td>0,28 & micro ; M prostaglandine</td></tr><tr><td>Putrescine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>182 & micro ; M putrescine</td></tr><tr><td>Scalpel Albion</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Moria</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>Sélénite de sodium* (S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.29 &micro ; M Na2SeO3&nbsp ; &nbsp ; (L)</td></tr><tr><td>Taurine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td>3 mM taurine</td></tr><tr><td>Transferrin* (T)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.07 &micro ; M transferrine (T)</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000-S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Suppléments</td></tr></tbody></table>

vibratome sectionnement rétine de souris pour préparer des cultures photoréceptrices

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

La rétine est une partie du système nerveux central qui est organisé architecture, avec des couches de neurones dans les photorécepteurs, les bâtonnets et les cônes sont en contact avec l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine dans la partie la plus éloignée sur la rétine en considérant le sens de la lumière, et la cellules ganglionnaires de la distance la plus proximale. Cette architecture permet l&#39;isolement de la couche de photorécepteur par sectionnement vibratome. La rétine neurale disséqué d&#39;une souris âgée de 8 jours est plat intégré dans 4% de gélatine sur le dessus d&#39;une tranche de 20% couche des photorécepteurs de gélatine vers le bas. En utilisant un vibratome et une lame de rasoir à double tranchant, l&#39;épaisseur rétine interne 100 um est sectionné. Cette section contient les cellules ganglionnaires et la couche interne avec notamment les cellules bipolaires. Une section intermédiaire de 15 um est jeté avant 200 um de la rétine externe contenant les photorécepteurs est récupéré. La gélatine est éliminé par chauffage à 37 ° C. Des morceaux de couche extérieure sont incubaTed dans 500 pi de la solution de Ringer avec 2 unités de papaïne activée pendant 20 min à 37 ° C. La réaction est arrêtée par addition de 500 ul de 10% de sérum de veau foetal (FCS) dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), puis 25 unités de DNase I est ajouté avant la centrifugation à la température ambiante, on le lave plusieurs fois pour éliminer le sérum et les cellules sont remises en suspension dans 500 pl de DMEM et ensemencées à 1 x 10 5 cellules / cm 2. Les cellules sont cultivées à 5 jours in vitro et leur viabilité classé par dosage vivants / morts. La pureté de la culture est tout d&#39;abord déterminée par observation au microscope pendant l&#39;expérience. La pureté est ensuite validé par le semis et la fixation des cellules sur une lame et l&#39;analyse histologique en utilisant un anticorps polyclonal de lapin anti-affaissement, un marqueur de photorécepteur et monoclonal de souris anti-Rho, un marqueur spécifique tige de photorécepteur. En variante, la couche de photorécepteur (97% des tiges) peut être utilisé pour l&#39;analyse génétique ou l&#39;expression des protéines et pour la transplantation.

En dehors de la transplantation, les couches photoréceptrices ont aussi été utilisées pour étudier la signalisation cellulaire par l'ensemencement des cellules de cultures pour la fabrication de photorécepteurs 12,22. En outre, ils sont utilisés pour étudier l'expression des gènes et du rythme circadien 23,24. Nous avons utilisé la couche photoréceptrice de cellules provenant d'une souris de type sauvage au jour post-natal 8 pour préparer des cultures de photorécepteurs en l'absence de FCS et maintenu les cellules pendant 5 jours à 37 ° C dans un incubateur avec 5% de CO 2 (Figure 1E ). Les cellules ont ensuite été fixées à l'aide de 4% paraformadehyde et ont ensuite procédé à l'analyse immunocytochimique en utilisant des procédés sont fournis par des fournisseurs d'anticorps soit avec des anticorps monoclonaux de souris anti-Rho (1: 250, Millipore Mab5316) ou polyclonal de lapin anti-affaissement (1: 200, un généreux don de Igal Gery et David Hicks). Nous avons utilisé anti-RHO et anti-SAG (bien anti-SAG cônes d'étiquettes et tiges) en raison du fait que l'anti-SAG est un marqueur plus tôt, que les anti-Rho. La proportion de cells positifs pour l'anticorps anti-RHO est plus bas que ceux positif pour les anticorps anti-SAG (figure 2). Ceci peut se expliquer par le fait que SAG, la arrestine de tige est également exprimé par des cônes qui font 3% des photorécepteurs dans la couche d'isolement, ou bien par le fait que lors de la maturation post-natal de la rétine, l'expression de SAG précède que RHO de 25,26. La couche des photorécepteurs a également été utilisé pour surveiller l'expression spécifique de gènes par des photorécepteurs de la rétine de type sauvage et le cerveau des animaux âgés de 35 jours ARN ont été préparés en utilisant CsCl ultracentrifugation 27 et hybride à puce à ADN de la souris Array. Les messagers de la rhodopsine (RHO), S-arrestine (Sag) et cône transducine (Gnat2) sont exprimés spécifiquement dans la rétine par rapport au cerveau (figure 3A). L'expression est importante dans la couche de photorécepteur (PR) par rapport à l'ensemble de la rétine qui englobela couche intérieure de la rétine montrant que ces gènes sont exprimés en effet par des photorécepteurs. Pour Gnat2, l'expression relative par rapport à Rho Sag et montre qu'il est exprimé par des cônes contenus dans la couche photoréceptrice isolé. L'expression de Recoverin (Rcvrn) dans la couche de photorécepteur par rapport à la rétine entière est augmentée (figure 3B). La couche des photorécepteurs a également été utilisé pour surveiller l'expression de RHO et GNAT2 utilisant western blot suivant des méthodes fournies par les fournisseurs d'anticorps et de comparer à la couche de la rétine interne (Figure 4). Notez l'absence de RHO GNAT2 et 28, les marqueurs de bâtonnets et les cônes, respectivement, dans l'ensemble de la rétine et dans la rétine de souris rd1 au jour post-natal 35. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg"> Figure 1. Vue schématique du sectionnement de vibratome de la rétine de souris. Ajouté (A) Installation de la rétine plate-monté avec le photorécepteur vers le bas sur la tranche de la gélatine. (B) Section de la rétine interne avec la lame de vibratome. (C) de la section de la rétine externe de gélatine. (D) Contrôle des la présence de photorécepteur au niveau du bord du fragment de la rétine après l'isolement de la couche photoréceptrice. La barre d'échelle utilisée pour la fluorescence verte est utilisée d'un microscope optique blanc. Les photorécepteurs sont situés dans le bord de l'image. (E) cellules photoréceptrices de culture (post-cinq jours). (F) grossissement supérieur du panneau E. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550"> Figure 2. Expression différentielle de RHO SAG et dans la culture des photorécepteurs de la souris. (A) Coloration des noyaux (image bleue), (B) SAG de coloration (vert), (C) RHO de coloration (rouge). (D) ont fusionné. Parce que la coloration de la SAG est exprimé plus tôt que RHO coloration, seules deux cellules sont doublement marquées SAG et RHO (voir *). Barre d'échelle:. 23 pm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg"> Figure 3. Comparaison de l'expression de trois gènes dans le cerveau et la rétine photorécepteurs ensemble et des animaux de type sauvage âgés de 35 jours. (A) rhodopsine (Rho), S-arrestine (Sag) et cône transducine (Gnat2). (B) Calbindin (Calb1) et Recoverin (Rcvrn). Les données sont affichées comme expression relative. L'expression relative est une valeur d'expressionobtenu à partir des données de puces à ADN après normaliszation avec le logiciel robuste multi-gamme moyenne (RMA) disponibles dans la base de connaissances kbass (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400"> Figure 4. Expression des RHO et GNAT2 dans la rétine externe de la rétine de type sauvage au post-natal jour 35. Absence de leur expression dans la rétine interne et dans la rétine de la souris RD1 au post-natal jour 35. ACTB, bêta actine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Rétine neurale d&#39;une souris âgée de 8 jours est au-dessus d&#39;un bloc de gélatine de 4%. Après isolement de la couche de photorécepteur (200 um) par vibratome, les photorécepteurs sont ensemencées après dissociation mécanique et enzymatique de la culture. La couche de photorécepteur peut être utilisé pour des analyses biochimiques ou la transplantation moléculaires.

Vibratome sectionnement rétine de souris pour préparer des cultures photoréceptrices

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler la couche photoréceptrice de la souris. Pour la culture, la première étape consiste à obtenir une rétine plate complète et à la sceller sur un bloc de gélatine. Ensuite, les couches rétiniennes sont coupées avec succès afin d’isoler la couche photoréceptrice.La dernière étape consiste à ensemencer des cellules photoréceptrices purifiées en culture. En fin de compte, la pureté de la couche photoréceptrice est confirmée par la microscopie et l’immunofluorescence, suivies d’un test de facteur de viabilité des cônes dérivés de bâtonnets. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la micro-dissection laser, est d’isoler en toute confiance la couche photoréceptrice.Les implications de cette technologie s’étendent au traitement de la dégénérescence rétinienne héréditaire. Comme il est très pratique d’étudier la biologie des photorécepteurs, nous avions initialement développé cette méthode pour étudier l’interaction cellulaire entre les photorécepteurs en bâtonnets et les photorécepteurs froids. La transplantation d’un photorécepteur de couche dans l’œil de la marque précoce a permis d’identifier tous les facteurs de viabilité dérivés.La démonstration visuelle de ces méthodes est essentielle car l’opportunité de la rétine de montagne plate est difficile à réaliser car elle est délicate. Avant d’isoler la rétine, préparez le vibrato. Commencez avec des plats remplis d’une solution de gélatine à 20 % sortis de l’entrepôt à quatre degrés Celsius.Coupez la gélatine à l’aide d’un scalpel, puis retournez la tranche de gélatine et collez-la sur le disque de support noir du vibromasseur à l’aide d’une goutte de super colle. Ensuite, cassez une lame de rasoir en deux moitiés et insérez-en une moitié dans le vibromasseur. Insérez ensuite le disque de support noir dans le vibromasseur et tournez le bouton noir vers la droite.Maintenant, fixez le réceptacle de maintien à la tête du vibrato et couvrez le bloc de gélatine avec un fluide indépendant du CO2. Allumez le vibrato pour tester la configuration. Coupez trois tranches de 100 microns jusqu’à ce que le tranchage soit lisse et que des tranches plates soient produites.Après avoir prélevé les yeux d’une souris et d’autres préparations, isolez la rétine. Tout d’abord, utilisez une aiguille de calibre 18 pour faire un trou au niveau du membre de l’œil. Ensuite, pour retirer le corps ciliaire, insérez des ciseaux droits à travers le trou et dans le globe oculaire, et coupez soigneusement la sclérotique sous l’iris, puis le long du périmètre du globe oculaire.Ensuite, gardez la partie postérieure de l’œil avec la rétine contiguë à la sclérotique et retirez la cornée et le cristallin. Avec deux poignées fines, retirez le vitré, qui est attaché à la rétine sans endommager la rétine afin que la rétine puisse être posée à plat. Faites-y quatre coupes radiales.Maintenant, retournez le globe oculaire et épluchez-le comme une orange. Ensuite, très soigneusement avec des ciseaux droits fins. Détacher la rétine de la sclérotique et de l’épithélium pigmenté rétinien.Il doit rester attaché au niveau du nerf optique à l’aide de fines prises, détacher le vitré restant en commençant par la périphérie et en se déplaçant vers le centre de la rétine. Avec tout le vitré complètement enlevé, la rétine s’aplatira. Transférez maintenant la rétine dans une boîte de Pétri de 35 millimètres de diamètre.Le processus de scellement de la rétine plate dans le bloc de gélatine est délicat et fondamentalement l’aspect le plus difficile de la section du tissu. Tout d’abord, retirez 20 à 30 millilitres de fluide du réservoir vibram. Deuxièmement, transférez la rétine sur une lame de verre à l’aide d’une pipette en plastique de gros calibre et appliquez une goutte de milieu indépendant du CO2 sur la lame.Troisièmement, transférez la rétine dans une tranche de gélatine avec un photorécepteur vers le bas. Quatrièmement, fixez la rétine au bloc de gélatine. Injectez doucement de la gélatine chaude à 4 % d’un côté du bloc entre la rétine et le bloc de gélatine et expulsez la gélatine de l’autre côté.Enfin, aspirez la gélatine à l’aide d’une pipette en verre et attendez sept à 10 minutes pendant que la rétine est scellée dans le bloc. Ajoutez maintenant un fluide indépendant du CO2 dans le réservoir et immergez le bloc et la lame pour la section en commençant par le haut du bloc de gélatine. Coupez des sections en série de 100 microns jusqu’à ce que la lame atteigne la rétine.Ensuite, à l’aide d’une vitesse très lente, comme une ou deux coupes de 100 à 120 microns de la couche interne de la rétine. Selon l’application, cette couche peut être jetée ou stockée dans de l’azote liquide, ce qui permet de maintenir une vitesse lente à l’interface entre la couche intérieure et la couche externe. Prenez des sections de 15 microns.Examinez ces sections au microscope pour détecter la présence de vaisseaux sanguins. Lorsqu’il n’y en a pas, la rétine externe a été atteinte à travers la couche externe. Coupez lentement des sections de 200 microns.Transférez ces tranches dans un plat de 35 millimètres avec trois millilitres de milieu froid, indépendant du CO2, maintenu sur de la glace. Procédez à la collecte de toutes les sections de la couche photoréceptrice de toutes les rétines à sectionner dans cette boîte. Commencez par transférer les photorécepteurs tranchés dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, à l’aide d’une pince, séparez délicatement chaque couche photoréceptrice de la gélatine et transférez-les dans une nouvelle boîte remplie de trois millilitres de solution de ringer à température ambiante. Une fois que tous les photorécepteurs ont été isolés de la gélatine, combinez deux unités de papaïne avec 25 microlitres de solution activatrice dans un tube stérile en polypropylène de cinq millilitres et incubez pendant 30 minutes. Pour activer la papaïne pendant cette incubation, coupez les tranches de la couche photoréceptrice en morceaux carrés de deux millimètres et pas beaucoup plus petits.Transférez ces morceaux dans un tube de cinq millilitres avec 1,5 millilitre de solution de sonnerie. Aspirez ensuite les sonneries et replacez-les pour un deuxième lavage. Attendez que toutes les tranches se déposent par gravité, sédimentation, puis retirez toute la solution de bague restante du tube.Ensuite, ajoutez 475 microlitres de solution de ringer dans le tube contenant la papaïne activée et mélangez. Transférez ce mélange dans le tube contenant les tranches et incubez-les pendant 20 minutes. Après 20 minutes, arrêtez la digestion de la papaïne en ajoutant un millilitre de FCS à 10 % de DMEM.Ajoutez ensuite 25 unités de D Ns.One pour digérer l’ADN des cellules photoréceptrices qui sont mortes, homogénéisez soigneusement la suspension avec pipetage pour paper les cellules photoréceptrices. Faites tourner le tube à 115 G pendant six minutes à température ambiante, jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans du DMEM supplémenté à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Répétez cette opération, essorez et réanimez la suspension. Une fois.Maintenant, à partir de l’œil récolté, une à 1,5 million de cellules devraient être prêtes à être ensemencées. Ensemencez-les à 100 000 cellules par centimètre carré et cultivez-les pendant cinq jours avant les applications en aval En utilisant les méthodes décrites, des cultures de cellules photoréceptrices ont été faites à partir de souris de type sauvage au huitième jour postnatal. Sans FCS, les cellules ont été fixées et colorées pour l’anti-rangée ou un marqueur anti-affaissement antérieur.Moins de cellules étaient positives pour l’anti-rang, car SAG précède l’expression des RE. Des photorécepteurs ont également été préparés à partir de souris âgées de 35 jours pour examiner l’expression de l’ARNm, du sag RO et du cône transductant GA deux. Ces gènes s’expriment de manière plus proéminente dans les photorécepteurs par rapport à l’ensemble du cerveau.G NAT deux est spécifiquement exprimé par les cônes. L’expression protéique de RO et g. NAT deux dans les photorécepteurs a été examinée en comparant les cellules de la couche photoréceptrice avec les cellules de la couche rétinienne interne.Cela a été fait avec des souris de type sauvage et avec des souris mutantes RD. Les souris mutantes n’ont montré aucune expression de l’une ou l’autre protéine au jour 35. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir une couche photoréceptrice purifiée appropriée.Cette technique peut être réalisée en cinq à six heures environ pour quatre à huit rétines si elle est effectuée correctement après cette procédure. En outre, des méthodes telles que le sang occidental peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’expression des protéines lors de la dégénérescence des photorécepteurs après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie rétinienne pour étudier le transcrit, le protéome et le métabolisme de modèles animaux pertinents.

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Nous décrivons ici une technique rentable pour la culture organotypique de la rétine porcine adulte pour sept jours. En bref, un papier filtre stérile a été utilisé pour soulever la rétine neurale décollé de l'EPR et le côté photorécepteur lieu sur un insert soulevées par un stand sur mesure.

Culture organotypique de pleine épaisseur Retina porcin adultes

Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteux afin de quantifier l'activité des éléments cis-régulateurs (par exemple, enhancer / promoteur) dans la vie des rétines de souris par électroporation explant. Analyse préparation de l'ADN, la dissection de la rétine, l'électroporation, la culture des explants rétiniens, et post-fixation et de quantification sont décrits.

Quantifier l&#39;activité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

Cette vidéo présente une technique de patch-clamp à cellules entières pour l’enregistrement électrophysiologique à partir d’une rétine de souris à montage plat. Une fine pipette en verre avec une électrode est utilisée pour approcher les cellules amacrines en étoile (SAC) dans la rétine. Après avoir formé un joint, une aspiration est appliquée pour rompre la membrane et former la configuration patch-clamp à cellules entières. Enfin, le flux d’ions à travers les récepteurs synaptiques SAC est...

Mise en place d’une pince de patch à cellules entières pour l’enregistrement électrophysiologique à partir d’une rétine de souris à montage plat

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

Nous montrerons comment préparer des coupes rétiniennes à partir de l’œil de souris et enregistrer les réponses lumineuses dans les neurones rétiniens. L’ensemble de la procédure est effectué dans des conditions adaptées à l’obscurité.

Enregistrement Light-réponses évoquées dans les neurones post-synaptiques dans Dark-adaptés, Préparations rétine de la souris tranche en utilisant des techniques de patch clamp

Nous décrivons un protocole à suivre Ca 2+ dynamique dans les terminaisons axonales des cônes photorécepteurs utilisant une préparation de tranches ex-vivo de la rétine de souris. Ce protocole permet à des études approfondies de cône Ca 2+ signalisation dans un important système modèle mammifère, la souris.

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Nous avons développé une préparation de tranche horizontale de la rétine adulte de mammifère avec le plan de la coupe parallèle à la surface de la rétine. champs dendritiques des neurones rétiniens orientés nonradially ne sont pas tronquées, permettant l'étude du traitement du signal avec des techniques de patch-clamp et d'imagerie.

Préparation des horizontales Tranches de souris adultes Retina pour les études électrophysiologiques

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

Ce travail présente une préparation alternative de rétine à montage plat dans laquelle l’ablation des corps cellulaires photorécepteurs permet une diffusion plus rapide des anticorps et un meilleur accès des pipettes patch aux neurones rétiniens internes pour l’immunohistochimie, l’hybridation in situ et les expériences d’électrophysiologie.

Split Retina en tant que préparation améliorée à montage plat pour l’étude des neurones de la couche nucléaire interne dans la rétine des vertébrés

Un protocole pour la préparation de cryocoupes rétiniennes de souris et la réalisation d’immunomarquage sur les photorécepteurs est décrit. Cet article permet aux chercheurs de produire de manière cohérente des coupes rétiniennes congelées de souris avec une morphologie bien préservée et des résultats d’immunomarquage de haute qualité.

Cryosectionnement et immunomarquage de la rétine de souris

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus &lt; 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les...

En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

Apprenez à isoler la couche des photorécepteurs de la rétine de souris par sectionnement au vibratome pour des cultures primaires. Cette méthode permet d'étudier la biologie rétinienne et d'explorer des thérapies contre les dégénérescences héréditaires.

Vibratome sectionnement rétine de souris pour préparer des cultures photoréceptrices

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