Vibratome sectionnement rétine de souris pour préparer des cultures photoréceptrices

L’objectif global de cette procédure est d’isoler la couche photoréceptrice de la souris. Pour la culture, la première étape consiste à obtenir une rétine plate complète et à la sceller sur un bloc de gélatine. Ensuite, les couches rétiniennes sont coupées avec succès afin d’isoler la couche photoréceptrice.

La dernière étape consiste à ensemencer des cellules photoréceptrices purifiées en culture. En fin de compte, la pureté de la couche photoréceptrice est confirmée par la microscopie et l’immunofluorescence, suivies d’un test de facteur de viabilité des cônes dérivés de bâtonnets. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la micro-dissection laser, est d’isoler en toute confiance la couche photoréceptrice.

Les implications de cette technologie s’étendent au traitement de la dégénérescence rétinienne héréditaire. Comme il est très pratique d’étudier la biologie des photorécepteurs, nous avions initialement développé cette méthode pour étudier l’interaction cellulaire entre les photorécepteurs en bâtonnets et les photorécepteurs froids. La transplantation d’un photorécepteur de couche dans l’œil de la marque précoce a permis d’identifier tous les facteurs de viabilité dérivés.

La démonstration visuelle de ces méthodes est essentielle car l’opportunité de la rétine de montagne plate est difficile à réaliser car elle est délicate. Avant d’isoler la rétine, préparez le vibrato. Commencez avec des plats remplis d’une solution de gélatine à 20 % sortis de l’entrepôt à quatre degrés Celsius.

Coupez la gélatine à l’aide d’un scalpel, puis retournez la tranche de gélatine et collez-la sur le disque de support noir du vibromasseur à l’aide d’une goutte de super colle. Ensuite, cassez une lame de rasoir en deux moitiés et insérez-en une moitié dans le vibromasseur. Insérez ensuite le disque de support noir dans le vibromasseur et tournez le bouton noir vers la droite.

Maintenant, fixez le réceptacle de maintien à la tête du vibrato et couvrez le bloc de gélatine avec un fluide indépendant du CO2. Allumez le vibrato pour tester la configuration. Coupez trois tranches de 100 microns jusqu’à ce que le tranchage soit lisse et que des tranches plates soient produites.

Après avoir prélevé les yeux d’une souris et d’autres préparations, isolez la rétine. Tout d’abord, utilisez une aiguille de calibre 18 pour faire un trou au niveau du membre de l’œil. Ensuite, pour retirer le corps ciliaire, insérez des ciseaux droits à travers le trou et dans le globe oculaire, et coupez soigneusement la sclérotique sous l’iris, puis le long du périmètre du globe oculaire.

Ensuite, gardez la partie postérieure de l’œil avec la rétine contiguë à la sclérotique et retirez la cornée et le cristallin. Avec deux poignées fines, retirez le vitré, qui est attaché à la rétine sans endommager la rétine afin que la rétine puisse être posée à plat. Faites-y quatre coupes radiales.

Maintenant, retournez le globe oculaire et épluchez-le comme une orange. Ensuite, très soigneusement avec des ciseaux droits fins. Détacher la rétine de la sclérotique et de l’épithélium pigmenté rétinien.

Il doit rester attaché au niveau du nerf optique à l’aide de fines prises, détacher le vitré restant en commençant par la périphérie et en se déplaçant vers le centre de la rétine. Avec tout le vitré complètement enlevé, la rétine s’aplatira. Transférez maintenant la rétine dans une boîte de Pétri de 35 millimètres de diamètre.

Le processus de scellement de la rétine plate dans le bloc de gélatine est délicat et fondamentalement l’aspect le plus difficile de la section du tissu. Tout d’abord, retirez 20 à 30 millilitres de fluide du réservoir vibram. Deuxièmement, transférez la rétine sur une lame de verre à l’aide d’une pipette en plastique de gros calibre et appliquez une goutte de milieu indépendant du CO2 sur la lame.

Troisièmement, transférez la rétine dans une tranche de gélatine avec un photorécepteur vers le bas. Quatrièmement, fixez la rétine au bloc de gélatine. Injectez doucement de la gélatine chaude à 4 % d’un côté du bloc entre la rétine et le bloc de gélatine et expulsez la gélatine de l’autre côté.

Enfin, aspirez la gélatine à l’aide d’une pipette en verre et attendez sept à 10 minutes pendant que la rétine est scellée dans le bloc. Ajoutez maintenant un fluide indépendant du CO2 dans le réservoir et immergez le bloc et la lame pour la section en commençant par le haut du bloc de gélatine. Coupez des sections en série de 100 microns jusqu’à ce que la lame atteigne la rétine.

Ensuite, à l’aide d’une vitesse très lente, comme une ou deux coupes de 100 à 120 microns de la couche interne de la rétine. Selon l’application, cette couche peut être jetée ou stockée dans de l’azote liquide, ce qui permet de maintenir une vitesse lente à l’interface entre la couche intérieure et la couche externe. Prenez des sections de 15 microns.

Examinez ces sections au microscope pour détecter la présence de vaisseaux sanguins. Lorsqu’il n’y en a pas, la rétine externe a été atteinte à travers la couche externe. Coupez lentement des sections de 200 microns.

Transférez ces tranches dans un plat de 35 millimètres avec trois millilitres de milieu froid, indépendant du CO2, maintenu sur de la glace. Procédez à la collecte de toutes les sections de la couche photoréceptrice de toutes les rétines à sectionner dans cette boîte. Commencez par transférer les photorécepteurs tranchés dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, à l’aide d’une pince, séparez délicatement chaque couche photoréceptrice de la gélatine et transférez-les dans une nouvelle boîte remplie de trois millilitres de solution de ringer à température ambiante. Une fois que tous les photorécepteurs ont été isolés de la gélatine, combinez deux unités de papaïne avec 25 microlitres de solution activatrice dans un tube stérile en polypropylène de cinq millilitres et incubez pendant 30 minutes. Pour activer la papaïne pendant cette incubation, coupez les tranches de la couche photoréceptrice en morceaux carrés de deux millimètres et pas beaucoup plus petits.

Transférez ces morceaux dans un tube de cinq millilitres avec 1,5 millilitre de solution de sonnerie. Aspirez ensuite les sonneries et replacez-les pour un deuxième lavage. Attendez que toutes les tranches se déposent par gravité, sédimentation, puis retirez toute la solution de bague restante du tube.

Ensuite, ajoutez 475 microlitres de solution de ringer dans le tube contenant la papaïne activée et mélangez. Transférez ce mélange dans le tube contenant les tranches et incubez-les pendant 20 minutes. Après 20 minutes, arrêtez la digestion de la papaïne en ajoutant un millilitre de FCS à 10 % de DMEM.

Ajoutez ensuite 25 unités de D Ns.One pour digérer l’ADN des cellules photoréceptrices qui sont mortes, homogénéisez soigneusement la suspension avec pipetage pour paper les cellules photoréceptrices. Faites tourner le tube à 115 G pendant six minutes à température ambiante, jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans du DMEM supplémenté à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Répétez cette opération, essorez et réanimez la suspension. Une fois.

Maintenant, à partir de l’œil récolté, une à 1,5 million de cellules devraient être prêtes à être ensemencées. Ensemencez-les à 100 000 cellules par centimètre carré et cultivez-les pendant cinq jours avant les applications en aval En utilisant les méthodes décrites, des cultures de cellules photoréceptrices ont été faites à partir de souris de type sauvage au huitième jour postnatal. Sans FCS, les cellules ont été fixées et colorées pour l’anti-rangée ou un marqueur anti-affaissement antérieur.

Moins de cellules étaient positives pour l’anti-rang, car SAG précède l’expression des RE. Des photorécepteurs ont également été préparés à partir de souris âgées de 35 jours pour examiner l’expression de l’ARNm, du sag RO et du cône transductant GA deux. Ces gènes s’expriment de manière plus proéminente dans les photorécepteurs par rapport à l’ensemble du cerveau.

G NAT deux est spécifiquement exprimé par les cônes. L’expression protéique de RO et g. NAT deux dans les photorécepteurs a été examinée en comparant les cellules de la couche photoréceptrice avec les cellules de la couche rétinienne interne.

Cela a été fait avec des souris de type sauvage et avec des souris mutantes RD. Les souris mutantes n’ont montré aucune expression de l’une ou l’autre protéine au jour 35. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir une couche photoréceptrice purifiée appropriée.

Cette technique peut être réalisée en cinq à six heures environ pour quatre à huit rétines si elle est effectuée correctement après cette procédure. En outre, des méthodes telles que le sang occidental peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’expression des protéines lors de la dégénérescence des photorécepteurs après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie rétinienne pour étudier le transcrit, le protéome et le métabolisme de modèles animaux pertinents.