Name: Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes dhippocampe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Apprenez les enregistrements pairés en patch clamp sur des coupes d'hippocampe organotypiques pour étudier les circuits synaptiques minimaux. Cette méthode permet d'isoler l'activité synaptique entre deux neurones connectés.

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Nous tenons à remercier les membres des laboratoires de Montgomery et de Madison pour cette discussion utile. Nous reconnaissons le financement reçu des sources suivantes dans cette recherche : NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC et NIH.

Déclaration d&#39;éthique animale: Les protocoles décrits dans ce manuscrit suivent les directives de protection des animaux établies par l&#39;Université d&#39;Auckland et de l&#39;Université de Stanford. Les ratons P7 ont été euthanasiés par décapitation rapide. Dissection de l&#39;hippocampe est alors immédiatement effectué comme décrit ci-dessous. 1. organotypique hippocampe Slice Culture <ol><li> Préparation <ol><li> Préparer dissection moyen (utilisé seulement pour la dissection du cerveau). Mélanger 200 ml de milieu essentiel minimum, 2 ml de solution de pénicilline-streptomycine (10 000 unités de chaque, dans 0,85% de NaCl), 5 ml de solution tampon HEPES, 2 ml de Tris 1 M solution stock (pH 7,2), et stériliser par filtration avec filtre de 0,22 um . Effectuer une dissection de l&#39;hippocampe dans le milieu de dissection glacée. </li><li> Refroidir le milieu de dissection. Placer le support de dissection au congélateur environ 1 heure avant le début de la dissection jusqu&#39;à ce que le liquide est très froid. Ne pas laisser grand cr de glaceystals à former. Stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Préparer le milieu de culture (utilisé pour tout, sauf de dissection hippocampes). Mélanger 100 ml de milieu essentiel minimum (concentration de 1 x, liquide) w / des sels de Hank, w / L-glutamine, 2 ml de solution de pénicilline-streptomycine (liquide, 10 000 unités de chaque, dans NaCl à 0,85%), 2,5 ml de HEPES 1 M de tampon solution, 50 ml solution saline équilibrée de Hank, 50 ml de sérum de cheval (défini, inactivé par la chaleur), et stériliser par filtration avec filtre de 0,22 um. </li><li> Préparer les boîtes de culture. Placer 1 ml de milieu de culture par boîte de 35 mm de la culture, et ajouter un insert de membrane à chaque plat. Mettre en place à sept de ces plats dans une boîte de Pétri de 150 mm (ci-après comme «plaque»). Placer la plaque dans un incubateur à CO 2 pendant au moins une heure avant le début de la dissection, afin que le milieu de culture dans les plats atteint la température et le pH approprié. </li></ol></li><li> Dissection de la hippocampes de rats chiots à Jour Post-natal 7 (P7) <ol><li> Pré-stériliser tous les outils de dissection sous lumière UV avant la procédure. </li><li> Après décapitation rapide, retirer le cerveau et le lieu dans un milieu réfrigéré dans un plat, et puis la retirer pour un morceau de papier filtre humidifié pour la dissection. Taquiner le cortex loin du mésencéphale utilisant émoussés lisses spatules décoratifs recouverts de plastique, ce qui expose l&#39;hippocampe. Couper le cul de sac, puis retirez doucement la spatule sous l&#39;hippocampe pour la retourner (Figure 1A). NOTE: Le succès des cultures de tranche peuvent être préparés en utilisant des animaux jusqu&#39;à P10. </li><li> Coupez l&#39;hippocampe isolé loin du reste du cerveau. Transférer la hippocampes dans un nouveau plat contenant médias de dissection froide à l&#39;aide d&#39;un pinceau doux humide (par exemple, blanc sable # 4). </li><li> Nettoyez le dessous (c&#39;est à dire le côté plat) de l&#39;hippocampe de plexus choroïde lors de la dissection, comme ces tissus spongieux, Meninge-comme il est difficile de séparer l&#39;hippocampedes tranches les unes des autres par la suite. REMARQUE: Laissez ces tissus en place si elles ne peuvent pas être taquiné loin doucement. </li><li> Effectuer l&#39;ensemble de dissection aussi rapidement que possible sans endommager le hippocampes. REMARQUE: Une dissection minutieuse est plus important que d&#39;un, rapide, aussi longtemps que les conditions expérimentales sont refroidis. Trancher le hippocampes de rats trois simultanément. L&#39;état de santé de la tranche ne soit pas affectée aussi longtemps que le temps total du début à lorsque les tranches étalées entrent dans l&#39;étuve est de moins de 30 min. </li></ol></li><li> Tranchage <ol><li> Couper les hippocampes transversalement en 400 um sections en utilisant une trancheuse manuelle des tissus. La méthode par laquelle le découpage est réalisé n&#39;est pas important, tant qu&#39;il n&#39;est pas trop dommageable pour le tissu et produit des tranches d&#39;épaisseur uniforme avec une architecture laminaire facilement visible (c&#39;est à dire la corne d&#39;Ammon est facile de voir à conserver dans le tissu). </li><li> Allongez la hippocampes sur la scène du tissuhachoir sur une triple épaisseur de # 2 de papier-filtre. Le hippocampes sont entièrement tranché sans retirer les tranches individuellement (c&#39;est à dire l&#39;ensemble de l&#39;hippocampe est laissé sur la scène de l&#39;hélicoptère jusqu&#39;à ce que toutes les coupes ont été faites, mais plutôt comme des miches de pain tranché à ce stade, figure 1B). </li><li> Transférer la hippocampes dans le milieu de dissection à l&#39;aide d&#39;un pinceau doux posé à côté de l&#39;hippocampe (blanc sable 2 #). Poussez doucement chaque hippocampe sur le côté pour briser l&#39;adhérence entre l&#39;hippocampe et le papier filtre sous-jacent. Rouler la brosse sous chaque hippocampe à ramasser sur la scène. Placez tous les hippocampes dans la même boîte de Pétri de 35 mm de milieu de dissection froide. Séparez les hippocampes en tranches individuelles en agitant manuellement le plat en alternant mouvements droite et à gauche. </li><li> Inspectez les tranches sous un microscope à dissection et supprimer tout ce qui est endommagé, petit, ou qui ne possèdent pas de cellule visiblecouches de corps. NOTE: Il sera souvent le cas que toutes les tranches sont séparés de leur fratrie avec succès de cette façon. Dans ce cas, ils peuvent être séparés en les tournant sur le bord et à les pousser du bout des pinces fines. Les «bons» des tranches sont ensuite transférés dans un autre plat propre Petri contenant un milieu de dissection froide à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur coupée et polie à la flamme (figures 1C-E). </li></ol></li><li> Stockage <ol><li> Placez les tranches individuelles sur les cartouches filtrantes à membrane. Avec une pipette Pasteur coupée et le feu poli pour donner un plus gros calibre, transférer individuellement tranches les inserts de culture. REMARQUE: La taille du trou créé lors de la coupe et la pipette de polissage-le-feu est important. Trop petit et les tranches ne seront pas facilement quitter la pipette pour la membrane. Fluide trop grand excès et est placé sur la surface de la membrane avec la tranche. Le diamètre de l&#39;alésage mieux est généralement d&#39;environ la moitié de la diammètre du cylindre de la pipette. Lors de la coupe, ce diamètre peut être choisi en coupant au bon endroit sur le cône de la pipette. </li><li> Transfert tranche <ol><li> Remplir la pipette avec le milieu, et ensuite aspirer une seule tranche de petites forces d&#39;aspiration. Cela permet de maintenir la tranche près de l&#39;ouverture de la pipette et empêche l&#39;expulsion trop fluide dans l&#39;insert de placer la tranche. </li><li> Appliquez une légère pression sur l&#39;ampoule afin de former une petite goutte de suspension, permet la tranche de s&#39;installer dans cette gouttelette, puis touchez que des gouttelettes de la membrane et laisser la tranche «chute» sur la membrane. Généralement trois tranches sont placées sur chaque insert de membrane. REMARQUE: si la gouttelette de liquide est trop importante, les gouttes provenant des trois tranches ont tendance à fusionner sur la surface de la membrane, et les tranches seront donc tout rassembler vers le centre de la membrane, ce qui rend plus difficile de les séparer pour l&#39;enregistrement électrophysiologique par la suite. </li></ol></li><li> Enlev fluideal <ol><li> Aspirer tout milieu en excès de la partie supérieure de l&#39;insert de plaque de culture de toutes les tranches en ce que la plaque (3 tranches par plaquette = 21 tranches par plaque), de sorte que les tranches ne sont pas immergés dans ou entourés par un réservoir de milieu de dissection. </li><li> Effectuez ce soit avec un non coupée, mais poli-feu pipette Pasteur. Laisser la tranche de régler et d&#39;adhérer à la membrane pendant une minute avant pipetage. Prenez soin de ne pas aspirer la tranche dans la pipette. Effectuer le retrait de fluide pour les inserts qui sont immatriculés en premier lieu, à laisser suffisamment de temps pour les tranches de s&#39;installer. </li></ol></li><li> Tranche de stockage <ol><li> cultures tranche de magasin dans un incubateur à CO2 de 5,0% à 37 ° C. Observez la disposition finale des cultures de la figure 1E. Les tranches individuelles reposent sur un insert de plaque de culture qui a une membrane poreuse d&#39;un fond, et s&#39;ajuste à l&#39;intérieur de cette pièce une boîte de Pétri remplie avec une petite quantité de milieu; par ce moyen, les tranches ne sont pas immergés dans la medium, mais elle est ouverte uniquement à travers la membrane au fond de l&#39;insert de plaque de culture. </li><li> Eventuellement, retirer les tranches de l&#39;étude peut, soit en retirant l&#39;insert de plaque de culture ou en découpant une section de la membrane de l&#39;insert contenant une tranche. </li></ol></li></ol></li><li> Entretien <ol><li> Remplacer le milieu dans les boîtes de Pétri jours après la prise de cultures. Transfert de l&#39;insert de plaque de culture à une nouvelle boîte de Pétri contenant 1 ml de milieu de culture frais qui est équilibrée dans l&#39;incubateur pendant au moins une heure avant le transfert. </li><li> Changer le milieu de nouveau de la même manière, le troisième jour après la prise de cultures. Le troisième jour, le transfert des cultures à un incubateur réglé à 34 ° C. Changer le support deux fois par semaine (tous les 3-4 jours). </li><li> Identifier les cultures saines. Sélectionnez cultures saines pour les enregistrements de cellules entières paires. REMARQUE: Les cultures en bonne santé ont un bord bien défini et une couche de cellules pyramidales clairement définie. Cultures d&#39;esprith foncé (nécrotique probable) zones présente un aspect ou vacuole avec des frontières aplaties sont rejetées. En utilisant ces critères, normalement les deux tiers de cultures de tranches sont suffisamment saine pour l&#39;enregistrement. </li><li> Utiliser ces cultures dans un délai assez petite fenêtre de temps. Ne pas les tissus utilisés qui sont cultivées depuis plus de deux semaines que les neurones commencent à afficher un comportement légèrement épileptique qui s&#39;aggrave lentement avec le temps. La limite supérieure exacte de la survie neuronale n&#39;est pas connu, mais il est possible d&#39;enregistrer le fonctionnement des cellules pyramidales aussi tard que 16 semaines en culture. </li></ol></li></ol> 2. paires enregistrements de cellules entières <ol><li> ACSF et Solutions intracellulaires <ol><li> Préparer la solution d&#39;électrode présynaptique en mélangeant (en mM) 120 gluconate de potassium, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP, et 0,3 NaGTP (pH 7,2 avec KOH, osmolarité: 290 mOsm). Alors que la même solution de l&#39;électrode est utilisée pour les neurones post-synaptiques, gluconate de césium (120 mM) Est généralement utilisé comme le principal sel dans l&#39;électrode post-synaptique, plus mM QX314 5. NOTE: Ceci permet de serrage de tension stable à des potentiels positifs pour enregistrer les courants NMDAR médiation post-synaptiques 8-10,13. Elle empêche également l&#39;hyperexcitabilité induite par le potassium, le neurone présynaptique de la solution en écoulement interne de l&#39;électrode d&#39;enregistrement avant un joint postsynaptique de giga ohm est faite. </li><li> Préparer la solution d&#39;électrode postsynaptique composition (en mM) 120 gluconate de césium, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, NaATP 2, et 0,3 NaGTP (pH 7,2 avec CsOH, osmolarité: 290 mOsm). Tirez microélectrodes de verre à 5-10 résistance de MQ et remplir avec une solution interne filtré. </li><li> Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) composition (en mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 glucose, pH 7,4, saturé avec 95% O 2, 5 % de CO 2. REMARQUE: Si r AMPAR médiationEPONSES doivent être bloquées pour l&#39;examen des NMDAR EPSCs, comprennent 10 uM CNQX ou NBQX dans l&#39;ACSF. </li></ol></li><li> Obtenir jumelés entiers enregistrements cellulaires <ol><li> Pour examiner la transmission synaptique entre deux neurones individuels, désigner un neurone comme le neurone présynaptique et maintenir pince de courant pour induire des potentiels d&#39;action et de lancer la transmission synaptique. </li><li> Désigner le deuxième neurone, comme le neurone post-synaptique, et le maintenir en pince de courant ou de tension en fonction de l&#39;information requise par le chercheur. Obtenir un examen détaillé des courants glutamatergiques, avec EPSCs AMPAR médiation examinés à -65 mV et EPSCs NMDAR médiation examinés à +30 mV 6-16 en tenant le neurone post-synaptique de la tension de serrage </li><li> Établir un enregistrement associé. Pour établir un enregistrement associé, l&#39;enregistrement de la cellule entière présynaptique on obtient toujours la première, permettant à plusieurs neurones post-synaptiques séquentielles à obtenir jusqu&#39;à celui qui est synaptique actuellement connectésd est obtenu. Si la réalisation d&#39;expériences de plasticité synaptique, il est particulièrement important d&#39;obtenir le premier neurone présynaptique comme l&#39;induction de la LTP dans le neurone post-synaptique doit être initiée dans les 10 minutes de l&#39;obtention de l&#39;ensemble des enregistrements de cellules de lavage pour éviter les facteurs cytoplasmiques nécessaires à 8,19 LTP. </li><li> Éviter la perte cellulaire induite par le mouvement. Un défi majeur lors de l&#39;exécution des enregistrements de cellules entières paires est d&#39;éviter les vibrations et les perturbations induites mouvement du premier enregistrement de la cellule entière tout en obtenant le deuxième enregistrement. <ol><li> Obtenir le premier enregistrement de cellules entières et de passer ensuite au microscope objectif 10-200 pm de l&#39;axe x de telle sorte que l&#39;enregistrement créé est situé au bord de la zone visible sur l&#39;écran (figure 2A). </li><li> Soulevez la lentille du microscope ~ 5-10 mm, tout en assurant que le ACSF maintient toujours le contact avec la lentille. Montez la seconde électrode et de guider dans le ménisque de fluide (figure 2B </strong&gt;). </li><li> Déplacer l&#39;électrode dans le plan xy jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit directement sous le trajet de la lumière à travers la lentille, mais encore de façon significative au-dessus de l&#39;électrode d&#39;enregistrement établi. Une fois que l&#39;électrode est visible au microscope, est de veiller à la pointe à l&#39;extrémité de l&#39;écran éloignée de la première électrode. </li><li> Déplacer la deuxième électrode vers le bas dans l&#39;ordre de la mise au point du microscope jusqu&#39;à ce que les deux électrodes sont dans le même plan focal. Il est important que le niveau de pression positive est suffisamment forte pour éviter le blocage pointe, mais pas trop forte de manière à interrompre le premier enregistrement de cellules entières. Cela se traduit par la pression positive induire un mouvement à 2-3 neurones à partir de l&#39;électrode quand il pénètre dans la tranche. </li><li> Trouver un partenaire post-synaptique dans un plan focal similaire au premier enregistrement pré-synaptique (figure 2C). L&#39;enregistrement est généralement jumelé obtenir des enregistrements entre les neurones pyramidaux CA3 la deuxième de cellules entières d&#39;un 0-200 mm neurone de la première rnregistrement (figures 2C, D). REMARQUE: La transmission synaptique entre deux neurones sont stables sur des périodes allant jusqu&#39;à 3-4 heures lors de l&#39;utilisation de ces techniques d&#39;enregistrement de cellules standards entiers. </li></ol></li></ol></li><li> Plasticité synaptique: Once Upon obtenir un succès paire de cellules pyramidales synaptique connecté (3A Figures, B), examiner les caractéristiques de transmission et la plasticité synaptique. <ol><li> Induction de LTP. <ol><li> Induire la LTP en associant des potentiels d&#39;action présynaptiques (1 Hz) avec une dépolarisation post-synaptique à -10 à 0 mV pendant 1 min (figure 3C) 7-9,12-14. Procédez au couplage à moins de 10 min de pause dans le neurone post-synaptique. REMARQUE: LTP peut aussi être induite par les neurones qui s&#39;est tenue à pince de courant en associant des potentiels d&#39;action présynaptiques et post-synaptiques à 1 Hz pendant 1 min, avec des potentiels d&#39;action post-synaptiques suscité 10 ms après l&#39;injection de courant dans le neurone présynaptique 8 </sjusqu&#39;à&gt;. </li></ol></li><li> En outre induire LTD par une faible stimulation de fréquence (EPA) à 1 Hz combinée à une légère dépolarisation du neurone post-synaptique à -55 mV pendant 5-10 min (figure 3C) 9. </li></ol></li></ol>

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<li>Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+in+the+induction+of+long-term+potentiation+and+depression+of+synaptic+excitation+between+hippocampal+CA3-CA1+cell+pairs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole+cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).</li>
<li>DeBello, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-mediated+protein-protein+interactions+essential+for+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release.</a> Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).</li>
<li>Bekkers, J. M., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons%3A+quantal+levels%2C+oscillations%2C+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li>
<li>Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li>
<li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn%2C+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li>
<li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li>
<li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler

Ici, nous avons décrit les exigences pour établir des enregistrements cellulaires succès paires entières dans les cultures de tranches d&#39;hippocampe organotypiques. Les enregistrements par paires peuvent également être effectuées dans plusieurs préparations, y compris les tranches aiguës et des systèmes de culture 26,27 dissociées. Si l&#39;accent a été mis sur l&#39;induction de formes plus longues de la plasticité synaptique (à savoir LTP et LTD), il est important de souligner que les enregistrements de ...

Les récepteurs du glutamate médient la majorité de la transmission synaptique excitatrice dans les synapses du système nerveux central. Les deux principaux sous-types de récepteurs ionotropiques du glutamate localisées à la tête de la colonne vertébrale de la membrane post-synaptique sont la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoxazole-4-propionique acide (AMPA) des récepteurs. A des potentiels de membrane au repos, les récepteurs AMPA portent plus du courant post-synaptique au cours de la transmission synaptique. Dans l&#39;hippocampe, le récepteur NMDA joue un rôle clé dans le déclenchement de l&#39;évolution du nombre de récepteurs de l&#39;AMPA dans la membrane post-synaptique: en agissant comme un &quot;détecteur de coïncidence&quot; 1 à initier des changements dans la force synaptique 1, le récepteur NMDA participe aux mécanismes synaptiques qui sont pensés pour soutenir l&#39;apprentissage et la mémoire à un niveau subcellulaire. En réponse à la dépolarisation du neurone post-synaptique en parallèle avec la libération du transmetteur présynaptique, le calcium pénètre par le NMDArécepteur pour lancer l&#39;insertion du récepteur AMPA ou d&#39;enlèvement 2. Cette dynamique des récepteurs à la base de plasticité synaptique: une augmentation de la force synaptique est potentialisation à long terme 2,3 (LTP), alors qu&#39;une diminution de la force synaptique est la dépression à long terme 4 (LTD). Par conséquent, le mouvement du récepteur AMPA est considéré comme responsable de l&#39;expression de la plasticité synaptique, tandis que les récepteurs NMDA sont considérées pour contrôler son induction. Déterminer les mécanismes précis qui sous-tendent la transmission synaptique et la plasticité nécessite l&#39;étude de petites populations de synapses, idéalement synapses individuelles. Alors que certaines synapses sont parfaitement adaptés pour l&#39;étude à ce niveau, par exemple, le calice de Held 5, pour les populations les plus synaptiques ce qui est extrêmement difficile en raison de la petite et diffuse la nature des connexions synaptiques. Deux principales techniques d&#39;électrophysiologie ont été développés pour examiner les connexions synaptiques simples: La première est la stimulation minimale, where une fibre présynaptique est présumé stimulée extracellulaire. La deuxième technique est jumelé enregistrements, où deux enregistrements simultanés de cellules entières de neurones reliés par des synapses est effectuée. Un avantage majeur de stimulation minimal est qu&#39;elle est rapide et relativement simple à réaliser, comportant le placement d&#39;une électrode de stimulation extracellulaire dans le tube tout en enregistrant simultanément des axones d&#39;un neurone post-synaptique. La principale préoccupation lors de l&#39;utilisation de cette technique est que la stimulation fiable d&#39;une seule cellule peut rarement être garantie procès après procès. Au cours des quinze dernières années, nous avons utilisé couramment associé enregistrements de cellules entières de deux neurones pyramidaux reliés par des synapses 6-17. L&#39;avantage majeur de cette technique est que seul neurone présynaptique est stimulée cohérente et fiable. Il permet aussi non seulement la caractérisation électrophysiologique, mais aussi la manipulation pharmacologique du neurone présynaptique 6,18 &lt;/ Sup&gt;. Cependant, la probabilité de la connectivité synaptique entre les neurones est faible, ce qui rend difficile les paires connectées à obtenir 19. L&#39;utilisation de cultures de tranches de cerveau organotypiques de contourner cet obstacle comme la connectivité synaptique peut rétablir in vitro et d&#39;ailleurs la nature de la connexion qui en résulte est semblable à celle dans le tissu cérébral 20 native. En outre, les cultures organotypiques expriment LTP, LTD 7-10,12-15,21 et d&#39;autres formes de plasticité synaptique à court terme, y compris la facilitation double choc (PPF) et la dépression (PPD) 6,22,23, permettant mécanismes de plasticité à être étudiée dans des paires de neurones. Nous décrivons ici en détail la méthodologie nécessaire pour atteindre des succès enregistrements appariés dans ce système in vitro. Cette information peut aisément être adapté à d&#39;autres systèmes expérimentaux, y compris les tranches aiguës et d&#39;autres régions du cerveau.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essentiel Milieu</td><td></td><td></td><td>Micromanipulateurs motorisés stables&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Bain tissulaire peu profond</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td></td><td></td> tampon <td>Caméra DIC</td></tr><tr><td>1 M Tris stock solution</td><td></td><td></td><td>Amplificateur</td></tr><tr><td>Hank' s Sérum</td><td>pour cheval d’ordinateur</td>en solution <td></td><td></td> saline équilibrée</tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Table d’isolation des vibrations</td></tr><tr><td>Spatules miniatures plastifiées</td><td></td><td></td><td>Microscope vertical</td></tr><tr><td>Pinceau</td><td></td><td></td> mou <td>Logiciel d’acquisition et d’analyse de données</td></tr><tr><td>Hachoir manuel à</td><td></td><td></td> tissus <td>Extracteur d’électrodes</td></tr><tr><td>#2 Papier</td><td></td><td></td> filtre <td>Cage de Faraday</td></tr><tr><td>#5 Pinces</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserts membranaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capot de dissection Hotte</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de classe II</td></tr></tbody></table>

appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Les enregistrements de paires impliquent des enregistrements simultanés de cellules entières à partir de deux neurones synaptiquement connectés, permettant non seulement la caractérisation électrophysiologique directe des connexions synaptiques entre les neurones individuels, mais également la manipulation pharmacologique du neurone présynaptique ou postsynaptique. Lorsqu’il est effectué dans des cultures de coupes d’hippocampe organotypiques, la probabilité que deux neurones soient connectés synaptiquement est considérablement augmentée. Cette préparation permet facilement d’identifier les types de cellules, et les neurones conservent leur morphologie et leurs propriétés de fonction synaptique similaires à celles du tissu cérébral natif. L’un des principaux avantages de l’enregistrement de cellules entières appariées est qu’il fournit des informations très précises sur les propriétés de la transmission synaptique et de la plasticité, ce qui n’est pas possible avec d’autres techniques plus rudimentaires utilisant la stimulation axonale extracellulaire. Les enregistrements de cellules entières appariés sont souvent perçus comme trop difficiles à réaliser. Bien que cette technique comporte des aspects difficiles, des enregistrements appariés peuvent être effectués par toute personne formée au clampage de cellules entières, à condition que le matériel spécifique et les critères méthodologiques soient respectés. La probabilité d’obtenir des enregistrements appariés synaptiquement connectés augmente considérablement avec des coupes organotypiques saines et une micromanipulation stable permettant d’obtenir indépendamment des enregistrements de cellules entières pré- et postsynaptiques. Alors que les paires de cellules pyramidales CA3-CA3 sont les plus largement utilisées dans la préparation de tranches organotypiques de l’hippocampe, cette technique a également été couronnée de succès dans les paires CA3-CA1 et peut être adaptée à tous les neurones qui sont connectés synaptiquement dans la même préparation de tranches. Dans ce manuscrit, nous fournissons la méthodologie détaillée et les exigences pour établir cette technique dans tout laboratoire équipé pour l’électrophysiologie.

Connectivité synaptique est évident en stimulant le neurone présynaptique de tirer un potentiel d'action en passant une impulsion de courant de dépolarisation (typiquement 20-50 pA pour 20 ms) via l'électrode d'enregistrement. La trace de courant post-synaptique est alors examiné pour rechercher la présence d'un RPEC monosynaptique évoquée à court (&lt;5 ms) et des temps de latence cohérents après le pic du potentiel d'action présynaptique (Figure 3A). Dans la plupart des expériences multiples neurones ...

Les enregistrements de paires sont des enregistrements simultanés de cellules entières à partir de deux neurones synaptiquement connectés, permettant une caractérisation électrophysiologique et pharmacologique précise des synapses entre les neurones individuels. Nous décrivons ici la méthodologie détaillée et les exigences pour établir cette technique dans les cultures de coupes organotypiques d’hippocampe dans tout laboratoire équipé pour l’électrophysiologie.

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de pouvoir enregistrer l’électrophysiologie à partir du circuit synaptique minimal dans le cerveau. Ceci est réalisé dans des enregistrements réalisés à partir de cultures en tranches organotypiques de l’hippocampe de rat cultivées dans des inserts de culture en plastique. Ces tranches établissent des connexions synaptiques élaborées mais appropriées qui peuvent être facilement enregistrées après une période de croissance en culture.Faire des enregistrements dans ces coupes permet d’isoler l’activité synaptique du circuit synaptique minimal qui s’est formé entre seulement deux neurones, et permet ainsi d’étudier les propriétés les plus fondamentales des circuits neuronaux. Cette méthode peut être utilisée pour sonder la fonction des microcircuits synaptiques dans l’hippocampe, mais elle peut être utilisée pour n’importe quelle zone du cerveau où les neurones voisins sont connectés synaptiquement. La démonstration visuelle des méthodes d’enregistrement et de dissection est cruciale car de nombreuses étapes dépendent de l’identification précise des points de repère cérébraux et des neurones, à la fois avant de faire des tranches, prépare

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C'est un protocole pour préparer et maintenir une préparation de tranches de néocortex culture organotypique dans le but de réaliser des enregistrements électriques des neurones pyramidaux.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

Nous utilisons la technique de patch-clamp pour mesurer le GABA-activé un seul canal courants (GABAA canaux, récepteurs GABA) et les courants synaptiques et tonique qu'ils génèrent dans les neurones. L'activation des canaux diminue l'excitabilité neuronale dans la santé et la...

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Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

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photostimulation et enregistrements de neurones dans des tranches d’hippocampe de souris

Cette vidéo montre la procédure de mise en place d’une tranche de cerveau dans une chambre d’immersion pour enregistrer l’activité synaptique. Le processus consiste à fixer la tranche sur du papier lentille, à maintenir un flux continu de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) pour assurer la viabilité neuronale et à positionner avec précision les électrodes de stimulation et d’enregistrement par rapport à une région cérébrale d’intérêt spécifique. Cette configuration permet un suivi...

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Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

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Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

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Préparation de tranches aiguës de l’hippocampe dorsal pour l’enregistrement des cellules entières et la reconstruction neuronale dans le gyrus bosselé de souris adultes

Apprenez les enregistrements pairés en patch clamp sur des coupes d'hippocampe organotypiques pour étudier les circuits synaptiques minimaux. Cette méthode permet d'isoler l'activité synaptique entre deux neurones connectés.

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