La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

L’objectif global de cette procédure est de transfecter de manière fiable des macrophages THP 1 humains avec une viabilité cellulaire élevée et sans activation cellulaire. Ceci est accompli en pré-différenciant d’abord les monocytes de THP un pendant 48 heures. La deuxième étape de la procédure consiste à détacher les macrophages prématurés de TP un.

La troisième étape consiste à transfecter les cellules avec de l’ARNi ou de l’ADN plasmidique, en utilisant la technologie des facteurs nucléotiques de lonza. Les dernières étapes consistent à réensemencer et à différencier davantage les cellules. En fin de compte, l’inactivation ou la surexpression réussie d’un gène peut être mise en évidence par PCR quantitative en temps réel, Western blot back, etc.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres approches de transfection telles que la lipofection, est que nous pouvons atteindre une efficacité de transfection élevée avec une viabilité cellulaire élevée, et que nous n’modifions pas la fonction et le comportement des microphages. Malheureusement, cette technique n’est pas adaptée aux applications à haute puissance car aucun transfet plus intense ne peut être effectué à la fois pour ce protocole. Avoir cultivé des cellules THP un dans RPMI 1640 avec 10 % de FCS et avec 1 % de glutamine streptococcique Pen 24 heures avant la transfection, diviser les cellules et leur fournir un milieu frais.

Le lendemain. Pré-différenciez les cellules en ensemenceant 10 à 15 millions de cellules dans un flacon tissulaire de 75 centimètres carrés avec les ajouts suivants au milieu RPMI supplémenté, 1 % d’acides aminés non essentiels, 1 % de pyruvate de sodium, 10 nanogrammes par millilitre, PMA et 50 micromolaires de bêta-mercaptoéthanol après 48 heures, aspirez le milieu et remplacez-le par six millilitres d’Accutane. L’un d’eux s’est réchauffé à 37 degrés Celsius pour détacher les cellules.

Incuber pendant 30 minutes pendant l’incubation. Préparez suffisamment de milieu de transfection et de milieu de culture pour le soin de l’affection postnucléotidique des cellules. Après 30 minutes, vérifiez que les cellules sont détachées et regardez autour de vous.

Si certaines cellules sont encore attachées, pompez doucement le ballon à l’aide d’une micro-pipette ou agitez-les simplement. N’utilisez pas de grattoir. Transférez la suspension dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-les pendant cinq minutes à 300 G et à température ambiante, retirez le surnageant par aspiration et remettez en suspension la pastille cellulaire.

Dans un millilitre de RPMI, préchauffé à 37 degrés Celsius, comptez les cellules et faites des aliquotes de tubes de micro-déchets contenant de deux à deux millions et demi de cellules pour une transfection immédiate. Une exécution rapide de ce protocole est essentielle. Pour éviter la perte de la fatalité cellulaire, assurez-vous d’avoir tous les matériaux préparés à l’avance Centrifugez-vous, toutes les aliquotes de transfection pendant 10 minutes à 250 GS et à température ambiante pendant qu’elles tournent, chargez tous les vétérinaires effecteurs de nucléos avec un demi-microgramme d’ADN plasmidique ou un microgramme d’ARN SI Utilisez une dilution hautement concentrée afin qu’ils occupent un volume minimal du vétérinaire.

Maintenant, aspirez le surnageant d’une seule des aliquotes cellulaires resus. Suspendre les cellules à 100 microlitres dans une solution de facteur nucléo. Ne laissez pas les cellules rester exposées à la solution pendant plus de 15 minutes.

Transférez les cellules chez le vétérinaire Q et mélangez-les en tapotant doucement. Ensuite, transfectez les cellules à l’aide du programme Y 0 0 1 sur un facteur nucléo modèle deux B. À l’aide d’une pipette jetable, déplacez les cellules électroporées dans un flacon de réaction et ajoutez immédiatement un demi-millilitre de milieu de transfection pré-averti aux cellules.

Maintenant, continuez à répéter le processus avec chaque aliquote de cellules une par une jusqu’à ce qu’elles soient toutes transfectées. Après avoir terminé l’affection du nucléo, transférez chaque transfection de cellules dans un puits d’une plaque à six puits avec 2,5 millilitres de milieu de transfection chaud. Bien mélanger chaque puits à l’aide d’une micro-pipette.

Après avoir laissé incuber toutes les plaques chargées pendant quatre heures, vérifiez l’état des cellules au microscope. Après quatre heures, la plupart des cellules doivent être collées à la plaque si nécessaire. Tout au plus.

Une autre heure d’incubation fournira suffisamment de sahe en travaillant un puits à la fois. Aspirez le milieu de transfection des cellules collées et remplacez-le par un volume égal de milieu de culture chaud. Attention à ne pas détacher les cellules lors de cette étape.

Maintenant, incubez les cellules aussi longtemps que nécessaire. Si nécessaire, remplacez le milieu toutes les 48 heures, prévoyez d’appliquer des traitements de manière à ce qu’ils se terminent lorsque l’ADN ou l’ARN transfecté est à son apogée. Lors du traitement des cellules avec des effecteurs, utilisez un milieu sans sérum sans PMA et sans bêta-mercaptoéthanol.

Attention à ne pas laisser les cellules incuber plus de 24 heures sans sérum. Le protocole a été utilisé pour transfecter, THP un macrophages avec la morphologie cellulaire IRNA a été évalué. Selon la mesure par cytométrie en flux.

Le taux d’apoptose et de nécrose dans les cellules était faible dans les cultures transfectées et témoins. Cependant, des comptages minutieux ont révélé que l’apoptose et la nécrose étaient légèrement plus élevées pour les échantillons transfectés. Cela pourrait être dû au fait que les macrophages THP one transfectés étaient plus difficiles à détacher des plaques que les cellules transfectées UNT.

Dans l’ensemble, les taux de transfection étaient supérieurs à 90 %, tels qu’analysés par cytométrie en flux. L’utilisation de la fluorescence S-I-R-N-A l’efficacité de transfection a également été confirmée par la microscopie à fluorescence. La fonctionnalité de la transfection a été mise en évidence par l’inhibition génétique de l’expression de IL 10 RB.

Une fois maîtrisé, le transfet peut être réalisé en une à une heure et demie s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que le milieu de culture a une influence considérable sur les performances. Ceci est décrit dans le protocole textuel.