Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

L’objectif global de cette procédure est d’analyser le comportement migratoire des cellules dans l’environnement tridimensionnel. Tout d’abord, intégrez les cellules d’intérêt dans un réseau de collagène tridimensionnel. Ensuite, enregistrez le mouvement des cellules par microscopie vidéo en accéléré, délimitez les paramètres de migration par suivi de cellule assisté par ordinateur et analysez les données de suivi de cellule à l’aide d’un tableur de calcul.

En fin de compte, cette méthode peut être utilisée pour étudier quels facteurs et voies de transduction du signal régulent la migration des cellules cancéreuses ou des cellules normales comme les leucocytes, les lymphocytes et les cellules souches dans le contexte du cancer. Ainsi, la connaissance de la migration cellulaire, des facteurs modulateurs et des voies de transmission du signal associées pourrait être utile pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à entraver la migration des cellules tumorales et la propagation métastatique. Pour les chambres de migration, brossez rapidement deux couches de cire de paraffine fondue, mélange de vaseline au milieu d’une lame de verre, ajoutez un couvercle, glissez et scellez avec deux couches de cire de paraffine, mélange de vaseline.

Placez ensuite les chambres de migration en position verticale dans un rack vers des tubes de réaction de 1,5 millilitre. Ajouter 20 microlitres de suspension cellulaire pour la suspension de collagène. Mélangez soigneusement 50 microlitres de 10 XMEM et 27 microlitres de solution de bicarbonate de sodium à 7,5 %.

Ajoutez ensuite 375 microlitres de suspension de collagène liquide et mélangez soigneusement pour obtenir une couleur violet clair indiquant un pH de 7,5. Ajoutez maintenant 100 microlitres de la suspension finale de collagène à 50 microlitres de suspension cellulaire et mélangez soigneusement tout en notant l’initiation de la fibre de collagène. Polymérisation. À pH 7,5, transférez le mélange dans les chambres de migration.

Tapotez doucement la chambre de migration pour répartir uniformément le mélange de cellules de suspension de collagène au fond de la chambre de la chaîne de migration. Placez les chambres de migration en position verticale dans un rack et incubez pendant 30 minutes. Lorsque le réseau de collagène polymérisé est légèrement trouble, mais toujours de couleur violet clair, remplissez les chambres de migration avec le milieu approprié et scellez la chambre de migration avec de la cire de paraffine.

Mélange de vaseline. Réglez le chauffage de la platine du microscope à 37 degrés Celsius à l’aide d’un grossissement de 10 x sur la chambre de migration. Concentrez-vous sur environ 50 cellules ou plus dans le champ de vision.

Enregistrez la migration cellulaire en mode accéléré à l’aide d’un logiciel de vidéosurveillance multi-caméras. Enregistrez les vidéos de migration de cellules dans un format de fichier approprié. Reliez les fichiers vidéo de migration cellulaire à une base de données contenant des informations complémentaires telles que le type de cellule et les conditions expérimentales.

Ensuite, analysez les films de migration cellulaire à l’aide d’une application logicielle de suivi de cellules appropriée pour une analyse impartiale. Sélectionnez au hasard les cellules à analyser sans savoir si les cellules sont actives en migration au total, déterminez environ 60 coordonnées XY par cellule dans une expérience typique de migration cellulaire. En cas de division cellulaire, choisissez au hasard une cellule fille à suivre dans le suivi.

Analysez les données de suivi des cellules à l’aide d’une application logicielle appropriée, comme un tableur, pour calculer la distance totale à laquelle une cellule a migré. Multipliez la somme des valeurs numériques des pixels par un facteur de correction pour la conversion en microns. Définissez les cellules qui ont migré moins de 25 microns en tant que cellules immobiles et remplacez les valeurs numériques par une virgule.

Ensuite, calculez l’activité locomotrice en pourcentage des cellules de la population de cellules suivies qui se sont déplacées entre deux points temporels. Calculez également le temps de mouvement actif en pourcentage du temps total de migration d’une cellule par rapport à la période de la période d’observation. Calculez ensuite la signification statistique à l’aide du test U de l’homme Whitney et affichez les données de migration cellulaire.

Un fichier de données de suivi de cellule classique ressemble à une table où chaque colonne représente une cellule suivie. Les rangées contiennent les informations de position sur le mouvement des cellules. Au fil du temps, le comportement locomoteur des cellules peut être caractérisé par l’activité locomotrice moyenne de la population cellulaire analysée ainsi que par le temps de mouvement actif.

Cet exemple montre les activités migratoires de 120 cellules à partir de quatre expériences indépendantes. Chaque losange indique qu’une cellule s’est déplacée entre au moins deux points temporels. Les lignes grises différencient les cellules en mouvement et les cellules immobiles.

Le paramètre de l’activité de la locomotive peut être affiché sous la forme d’un diagramme XY ou d’une boîte à moustaches. Pour visualiser la dynamique de la population cellulaire analysée, un histogramme montre effectivement le temps d’activité de ces mêmes cellules. Cette analyse du comportement migratoire des lignées cellulaires de cancer du sein MDA HER2 et M-D-A-N-E-O indique que les deux lignées cellulaires présentaient une activité locomotrice spontanée similaire.

Le paramètre temps d’activité a révélé un nombre légèrement plus élevé de cellules M-D-A-H-E-R se déplaçant spontanément par rapport aux cellules cancéreuses du sein M-D-A-N-O. La stimulation avec 100 nanogrammes par millilitre d’EGF a entraîné une augmentation significative de l’activité migratoire de MDA HER2, mesurée par le nombre de cellules en mouvement et le temps de mouvement actif. Il est intéressant de noter que les cellules M-D-A-N-E-O ont migré en réponse à la stimulation de l’EGF et ont montré un traitement actif dans le temps décalé avec l’inhibiteur de la phospholipase c gamma one uc 3 1 22 a réduit à la fois la migration spontanée et induite par l’EGF de M-D-E-E-R two et MDAN.

Cellules EEO. L’analyse du paramètre de temps actif a révélé que le traitement des cellules MDAN EEO avec deux micromolaires de U 7 3 1 2 2 a entraîné une diminution marquée de l’activité locomotrice, principalement attribuée à une augmentation du nombre de cellules immobiles. Une fois maîtrisé, la migration des lymphocytes et des leucocytes en un collagène tridimensionnel peut être enregistrée en deux heures environ, où les cellules tumorales sont enregistrées pendant la nuit.