Name: Manipuler le murin Glande lacrymale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Apprenez à analyser le développement de la glande lacrymale murine par culture ex vivo. Cette méthode permet d'étudier les voies de signalisation impliquées dans la morphogenèse épithéliale.

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Les auteurs tiennent à remercier le financement fourni par le programme d&#39;allocation de ressources UCSF.

Tous les travaux des animaux a été effectuée sous stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Californie, San Francisco. 1. souris embryonnaires glandes lacrymales (LG): récolte et microdissection <ol><li> Conformément aux procédures approuvées par les animaux institutionnels pour comité éthique de la recherche scientifique, euthanasier chronométré enceintes CD-1 (ou transgéniques) femelles avec la hausse inhalation de CO 2, suivie d&#39;une confirmation par dislocation cervicale aux embryons de récolte le jour embryonnaire approprié. Désigner le jour de prise vaginale découverte e0. Note: les glandes lacrymales (LGS) peut être récolté à partir de la E14 en une seule étape de bourgeon partir. Cependant, e16 (5 - 10 bourgeons) des embryons donnent les résultats les plus cohérents pour culture ex vivo. </li><li> Stériliser la ventral côté de la souris en utilisant 70% d&#39;éthanol. Pincer la peau et faire une incision sur la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux stériles; couper à travers la peau et du péritoine pour exposer la cavité abdominale. Retirer les deux cornes utérines en coupant le long de la mésomètre au sommet de chaque corne utérine et dans du PBS froid (Phosphate Buffered Saline) ou du milieu DMEM F12 supplémenté avec 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. </li><li> En utilisant des pinces (n ° 5), supprimer les embryons des sacs amniotiques et placer dans un deuxième boîte de Pétri stérile contenant du PBS froid. Attention à ne pas toucher les yeux ou la zone de la tête. </li><li> Passer embryon sur un microscope à dissection avec une base de transillumination. Si l&#39;embryon est &lt;e17, effectuez les étapes 1.5 à 1.7. Si les embryons sont&gt; e17, ces étapes peuvent être utiles mais ne sont pas indispensables, donc passez à l&#39;étape 1.8. </li><li> De trancher la tête du torse juste en dessous de la mandibule inférieure (étape 1, figure 2) usinga scalpel stérile (lame # 10). Tournez la tête de sorte que la mandibule est maintenant sur la plaque de dissection. Utilisez une pince à stabiliser la tête et un scalpel pour enlever environ ¼ de la face dorsale du cerveau (étape 2, 1 er coupe, Figure 2) - ce qui est particulièrement important une fois que le cartilage se raidit autour e15. </li><li> Orientez la tête pour que le scalpel peut percer le nez entre les yeux. Faire une coupe à travers le centre de la tête, de sorte que les yeux sont maintenant sur ​​moitiés séparées (étape 2, 2 e coupe, Figure 2). </li><li> L&#39;utilisation de deux # 5 forceps, prendre la moitié de la tête et enlever l&#39;excès de tissu (voir l&#39;étape 3, Figure 2). Veillez à orienter la tête de sorte que le LG (situé dans le coin inférieur arrière de l&#39;œil) ne soit pas perdu dans ce processus de retrait. Enlever l&#39;excès cérébrale, le cartilage et le tissu environnant nasale et sous l&#39;œil. Depuis la glande est à peine visible à ce stade, d&#39;assurer l&#39;oeil est bien orienté après l&#39;excès de tissu retrait to éviter de perdre l&#39;emplacement de la LG. </li><li> Prendre soin de la peau de la partie postérieure, coin inférieur de l&#39;oeil avec deux pinces. Retirer la peau en tirant avec précaution ouvert avec la pince pour exposer le LG. Utilisez un éclairage supplémentaire au-dessus et en dessous du tissu pour aider à visualiser le LG. Remarque: Le LG, distingue par son aspect comme un bourgeon sur un conduit dans un mésenchyme condensé sombre, doit être visible à ce stade. </li><li> Soigneusement commencent à disséquer le LG et le mésenchyme associé (voir illustration et images) à l&#39;écart du tissu environnant en utilisant une pince, en faisant attention de ne pas attraper le LG ou sa conduite associée. Une fois que la glande est libre du tissu environnant, retirez délicatement la totalité de la glande en saisissant l&#39;épithélium entourant l&#39;œil à la base du conduit LG. Prenez soin de préserver le mésenchyme entourant l&#39;épithélium, qui peut être observé comme un mésenchyme condensé dans lequel les invagine de l&#39;épithélium. NOTE: Certains élimination supplémentaire de tissue (des petits fragments d&#39;os, des muscles et du tissu conjonctif) peuvent être nécessaires pour éviter les facteurs / croissance signalisation de tissus voisins. </li><li> Pour la culture, la récolte 4 - 5 glandes et mésenchyme associé par plaque (GL sont déposées immédiatement sur dissection); recueillir un minimum de 14 glandes par 100 pi de tampon de lyse ARN pour RT-PCR 6. </li></ol> 2. Préparer les boîtes pour culture ex vivo Cette procédure est basée sur celle utilisée pour le développement des glandes salivaires 7,8. <ol><li> Ajouter 200 ul de milieu DMEM F12 (supplémenté avec 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine), des milieux de culture avec 50 ug / ml d&#39;acide ascorbique et de 50 pg / ml de holo-transferrine à une 50 mm plat à fond de verre de diamètre de microtitration 7. Remarque: DMEM F12 a été choisi comme nous l&#39;avons déjà constaté à maximiser la morphogenèse de la glande salivaire embryonnaire. </li><li> Flotter un 13 mm polycarbfiltre à membrane Onate avec 0,1 um pores sur le dessus de médias. </li><li> Étape facultative: Diluer 3-D laminine 1: 1 avec du DMEM / F12 pour obtenir une concentration finale de 3 mg / ml (utiliser 200 pi pipette pour mélanger doucement; centrifugeuse pendant 1 min si des bulles apparaissent). Ajouter 15 ul de cette dilution 3-D laminine à filtrer. Remarque: Cette dilution a été trouvée comme étant optimale pour le maintien à l&#39;état LG 3D sans compromettre la ramification épithéliale. Cependant, il est pas indispensable pour la culture de LG. </li><li> Placez 4 - 5 LG sur filtre ou dans la laminine. Culture GL ex vivo pour 24 - 48 h (figure 3) ou fixer avec 4% de PFA pendant 20 minutes pour une analyse plus approfondie par qPCR ou immunomarquage (Figure 4). Pour l&#39;analyse qPCR de tissu glandulaire embryonnaire, se il vous plaît se référer à Rebustini et al., 2011. Pour l&#39;analyse d&#39;immunofluorescence de tissus glandulaires embryonnaires se il vous plaît se référer aux citations suivantes: Hoffman et al, (2002) et Steinberg e.t al., (2005). </li></ol> 3. Souris postnatale et adultes glandes lacrymales (LG): Dissection <ol><li> Euthanasier la souris postnatale selon les normes de l&#39;éthique animale appropriée comité. Pour les petits postnatales jour 8 ou plus jeunes, euthanasier en coupant la tête avec des ciseaux stériles. Pour le jour postnatal 8 ou plus, pulvériser fourrure avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Pour localiser le LG, gisait souris latérale du côté sous un microscope à dissection avec un éclairage par le dessus. Remarque: Le LG post-natal et adulte sont bordés par l&#39;artère carotide, le muscle masséter et le derme (voir Figure 5). </li><li> L&#39;utilisation de petits ciseaux de dissection, faire petite incision dans l&#39;épiderme latéralement d&#39;où doit être situé le LG. </li><li> En utilisant des pinces, ouvrez le épiderme vers l&#39;oreille pour exposer la LG. </li><li> Utilisez une pince pour desserrer doucement LG du tissu environnant. </li><li> Une fois que le LG est libéré du tissu environnant, retirez délicatement le LG par le conduit,par pincement où le conduit et l&#39;épithélium entourant l&#39;oeil connecter (figure 1). </li><li> Placez GL dans l&#39;ARN tampon de lyse pour la RT-PCR, ou fixer avec 4% de PFA pendant 20 min pour immunomarquage. </li></ol>

<ol><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Current+allergy+and+asthma+reports%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).</li>
<li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).</li>
<li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes%3A+relevance+in+dry+eye+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li>
<li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).</li>
<li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development%3A+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li>
<li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnox%2C+SM+%22Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%22">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis</a>. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).</li>
<li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).</li>
<li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10%2FFGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11(2005).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494(2013).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à divulguer.

La polyvalence de la culture et de manipuler le LG ex vivo apporte des avantages significatifs pour l&#39;étude de son développement. Cela inclut la vitesse à laquelle le chercheur est en mesure de tester les hypothèses et la multitude de perturbations qui peuvent être effectuées pour évaluer comment épithéliale, neuronale, les cellules endothéliales et mesencyhmal interagissent pour former l&#39;organe. Cependant, il ya un certain nombre de réserves lors de l&#39;utilisation de ce modèle. Tout d&#39;abord, en ...

La glande lacrymale (LG) est responsable de la sécrétion aqueuse déchirure critique pour l&#39;acuité visuelle et de la santé, la maintenance et la protection des cellules de la surface oculaire. Résultats de la dysfonction LG dans l&#39;un des troubles oculaires les plus fréquentes et invalidantes: Eye Disease aqueuse déficient à sec, qui se caractérise par une irritation oculaire, sensibilité à la lumière et diminution de la vision 1. Chez l&#39;homme le LG réside dans l&#39;orbite au-dessus de l&#39;extrémité latérale de l&#39;œil, où 3-5 excréteurs larmes de dépôt de conduits sur la surface oculaire. La souris possède trois paires de glandes majeures oculaires, le plus étudié de qui est la glande lacrymale (LG) situé antérieure et ventrale de l&#39;oreille (exorbital) avec des larmes qui voyagent à l&#39;œil par un seul canal excréteur. Semblable à d&#39;autres organes glandulaires, le LG développe à travers le processus de morphogenèse épithéliale ramification dans laquelle un seul bourgeon épithélial dans un mésenchyme condensé subit de multiples tours de bourgeon et la formation de conduit à desm un réseau interconnecté complexe d&#39;acini et canaux de sécrétion (Figure 1) 2. Au cours du développement de l&#39;épithélium se vascularise ainsi que fortement innervée par les nerfs parasympathique du ganglion ptérygo et dans une moindre mesure par les nerfs sympathiques du ganglion cervical supérieur 3. Les interactions entre les cellules de chacun de ces types à-dire les cellules neuronales, cellules épithéliales, endothéliales et mésenchymateuses, sont essentiels pour la fonction et la maintenance du tissu adulte. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents de coordination du développement et de la régénération LG ainsi que la façon de type inter-cellule communication guide ces processus reste incertaine. L&#39;avènement de la embryonnaires ex vivo des techniques de culture a permis l&#39;identification de voies de développement et de régénération dans plusieurs organes de branchement 4. La mise en culture ex vivo permet au chercheur la possibilité de manipuler l&#39;organe (moiméca-, génétique ou chimique) dans des conditions définies, ainsi que pour la caractérisation des interactions de développement d&#39;organes et cellule-cellule en temps réel. Le LG exorbital de la souris est prête très bien à cette technique et des études récentes ont défini les systèmes qui régissent son développement 2,5 signalisation. Cependant, en dépit de la nécessité de comprendre les signaux moléculaires qui sous-tendent le développement et la régénération LG, il reste actuellement étudié, probablement en raison des difficultés techniques pour isoler l&#39;organe. Dans cet article, nous décrivons comment isoler et effectuer culture ex vivo de l&#39;embryon murin LG pour définir des programmes de développement.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 sans HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>P0781</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’albumine à partir de sérum bovin</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 16 %</td><td>Solution 15710</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>Dilué à 4 % dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Phosphate Tamponné Saline 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate 1x</td><td></td><td></td><td>Préparée à partir de 10x stock</td></tr><tr><td>d’holo-transferrine bovine</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp ; mg/ml de solution mère dans l’eau. Congeler les aliquotes à usage unique à -20&nbsp ; &deg ;C. Ajouter au milieu DMEM/F12 jusqu’à une concentration finale de 50&nbsp ; &mu ; g/ml.</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique (Vitamine C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp ; mg/ml de solution mère dans l’eau. Congeler les aliquotes à usage unique à -20&nbsp ; &deg ;C. Ajouter au milieu DMEM/F12 jusqu’à une concentration finale de 50&nbsp ; &mu ; g/ml.</td></tr><tr><td>Des boîtes traitées pour la culture tissulaire BioLite 100 mm</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>Des plaques non traitées pour la culture tissulaire peuvent également être utilisées.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope avec éclairage sous-platine</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>Tout microscope stéréo de dissection doté d’une base de lumière transmise peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Base d’éclairage de sous-platine pour stéréomicroscope</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Faucon 35&nbsp ; mm Boîtes traitées pour la culture tissulaire</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>Des plaques non traitées pour la culture tissulaire peuvent également être utilisées.</td></tr><tr><td>Antennes à fond en verre non revêtu de 50 mm</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence à grand champ</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss N’importe</td><td>quel microscope à fluorescence (microscope vertical, inversé ou stéréo à dissection) peut être utilisé pour surveiller l’expression de la GFP à faible grossissement avec un appareil photo numérique connecté.</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>La microscopie confocale est nécessaire pour voir en détail les structures cellulaires. N’importe quel microscope confocal peut être utilisé.</td></tr><tr><td>SWISS Pince microfine, #5 (11.2&nbsp ; cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Des pointes fines sont nécessaires pour éliminer le mésenchyme de l’épithélium. Des aiguilles en tungstène peuvent également être utilisées.</td></tr><tr><td>Pince à pointe standard Dumont, #5 (11&nbsp ; cm)</td><td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (États-Unis), Inc.</td><td>Idéal pour récolter les glandes des embryons.</td></tr><tr><td>Poignées de couteau chirurgical en plastique réutilisables, style n° 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Lames chirurgicales stériles en acier inoxydable, n° 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement de l’ARN total RNAqueous-Micro</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml stock dilué 1:1 avec DMEM/F12</td></tr><tr><td>Enceinte temporisée Crl :CD1(ICR) </td><td></td> souris <td>Charles River Labs Les embryons</td><td>sont récoltés le jour 14 (le jour de la découverte de la motte étant le jour 0).</td></tr><tr><td>Membranes hydrophiles gravées par des traces nucléopores de 0,1 po &mu ; m taille des pores, 13&nbsp ; mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Souris chronométrées enceintes Pax6-Cre, GFP Tg</td><td>(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Souris facultatives pour apprendre à localiser le LG.</td></tr></tbody></table>

manipuler le murin glande lacrymale

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

La glande lacrymale (LG) sécrète des larmes aqueuses nécessaires pour maintenir la structure et la fonction de la cornée, un tissu transparent essentielle pour la vision. Chez l&#39;être humain d&#39;une seule LG réside dans l&#39;orbite au-dessus de l&#39;extrémité latérale de chaque oeil délivrer larmes à la surface oculaire par l&#39;intermédiaire de 3 à 5 canaux. La souris possède trois paires de glandes majeures oculaires, le plus étudié de qui est la glande lacrymale exorbital (LG) situé antérieure et ventrale à l&#39;oreille. Semblable à d&#39;autres organes glandulaires, le LG développe à travers le processus de morphogenèse épithéliale ramification dans laquelle un seul bourgeon épithélial dans un mésenchyme condensé subit de multiples tours de bourgeon et la formation de conduite pour former un réseau interconnecté complexe de acini et canaux de sécrétion. Ce processus complexe a été bien documentée dans de nombreux autres organes épithéliaux tels que le pancréas et les glandes salivaires. Toutefois, le LG a été beaucoup moins explorée et les mécanismes de contrôle de la morphogenèse sont mal sousrésisté. Nous pensons que cette sous-représentation comme un système de modèle est une conséquence des difficultés liées à la recherche, la dissection et la culture de la LG. Ainsi, ici, nous décrivons les techniques de dissection pour la récolte embryonnaire et post-natal LG et les méthodes de culture ex vivo des tissus.

Le LG développe à travers le processus de morphogenèse épithéliale ramification. Images en fond clair de GL embryonnaires disséquées e14, e15, e16, e17, et P2 illustrent cet événement. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600"> Figure 1. Le LG développe à travers le processus de morphogenèse de ramification épithéliale. Images fond clair de GL embryonnaires fraîchement di...

La glande lacrymale (LG) est un organe de branchement qui produit les composants aqueux de larmes nécessaires pour le maintien de la vision et la santé oculaire. Nous décrivons ici murin LG dissection et ex vivo des techniques de culture de déchiffrer les voies impliquées dans le développement LG signalisation.

Manipuler le murin Glande lacrymale

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser le développement des glandes lacrymales en utilisant une approche ex vivo pour la manipulation et l’analyse des événements de signalisation au cours du développement des glandes. Ceci est réalisé en disséquant d’abord les glandes lacrymales des embryons du jour 16. Dans un deuxième temps, les glandes sont placées sur des filtres, flottant en culture, un milieu contenant des inhibiteurs de petites molécules ou des facteurs de croissance qui modifient le développement des glandes lacrymales.Après 24 heures, les glandes sont fixées et immuno-colorées pour les protéines de développement d’intérêt. En fin de compte, les changements dans l’expression des protéines au cours du développement ex vivo des glandes lacrymales peuvent être analysés par microscopie immunofluorescente. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement des glandes lacrymales.Par exemple, quels sont les mécanismes de signalisation qui définissent la glande lacrymale ? La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la glande lacrymale est difficile à reconnaître au cours du développement embryonnaire précoce sans un guidage visuel et une pratique pour la localiser. Pour récolter la glande lacrymale d’une souris embryonnaire, utilisez de l’éthanol à 70 % pour stériliser la face ventrale d’une souris embryonnaire, 14 à 16 souris enceintes.Ensuite, pincez la peau et coupez la peau le long de la ligne médiane de l’animal pour exposer le péritoine, coupez à travers le péritoine pour exposer la cavité abdominale et le myomètre et retirez les deux cornes du myomètre et placez-le dans du PBS froid. Ensuite, utilisez la pince numéro cinq pour transférer les embryons des sacs amniotiques dans une deuxième boîte de Pétri stérile contenant du PBS froid en prenant soin de ne pas toucher les yeux ou la tête. Après avoir séparé la tête du torse, juste en dessous de la mandibule inférieure, tournez la tête de sorte que la mandibule soit maintenant sur la plaque de dissection.Ensuite, utilisez une pince pour stabiliser la tête et un scalpel pour retirer environ un quart de la face dorsale du cerveau, orientez la tête de manière à ce que le scalpel puisse percer le nez entre les yeux, puis faites une coupe au centre de la tête de sorte que les yeux soient maintenant sur des moitiés séparées. Ensuite, à l’aide de l’éclairage ci-dessus et dessous, saisissez la peau du coin inférieur postérieur de l’œil et ouvrez soigneusement la peau avec la pince pour exposer la glande lacrymale, qui devrait apparaître comme un bourgeon sur un canal à l’intérieur d’un mésenchyme condensé plus foncé. Disséquez soigneusement la glande lacrymale et le mésenchyme associé loin des tissus environnants, en prenant soin de ne pas saisir la glande lacrymale ou son canal associé.Ensuite, une fois que la glande lacrymale est libérée du tissu environnant, saisissez doucement l’épithélium entourant l’œil à la base du canal de la glande lacrymale et retirez toute la glande. Prenez soin de préserver le Meen chi entourant l’épithélium, qui peut être observé comme un tissu condensé dans lequel l’épithélium s’invagine. Ensuite, cultivez quatre à cinq glandes lacrymales à l’aide d’un filtre dans une boîte de Pétri contenant un milieu de culture et les petites molécules inhibitrices ou facteurs de croissance d’intérêt pendant 24 heures pour récolter la glande lacrymale d’une souris postnatale ou adulte, vaporisez d’abord le contour des yeux avec de l’éthanol à 70 %.Ensuite, posez l’animal sur le côté latéral vers le haut sous un microscope à dissection avec un éclairage par le haut. Ensuite, utilisez de petits ciseaux de dissection pour faire une incision dans l’épiderme latéralement à partir de l’endroit où la glande lacrymale devrait être située. Ouvrez ensuite l’épiderme vers l’oreille pour exposer la glande lacrymale, qui chez la souris postnatale et adulte est bordée par l’artère carotide, le muscle maculé et le derme Détachez doucement la glande lacrymale du tissu environnant avec la pince, puis une fois que la glande lacrymale est libérée de l’emprise tissulaire environnante, où le canal et l’épithélium entourant l’œil se connectent et retirez soigneusement la glande.Enfin, fixez les glandes lacrymales avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes avant l’immuno-marquage. Pour les protéines développementales d’intérêt, la glande lacrymale se développe par le processus de morphogenèse de la ramification épithéliale. Ces images en fond clair de glandes lacrymales embryonnaires, disséquées aux jours embryonnaires 14, 15, 16, 17 et au deuxième jour postnatal, illustrent ce processus.Notez que lorsque la taille de l’épithélium augmente, la quantité de mésenchyme diminue, comme illustré sur ces images. Les glandes lacrymales se développent dans des conditions de culture in vivo de la même manière qu’à l’intérieur des cultures de glandes in vivo, et les glandes lacrymales fraîchement disséquées peuvent être fixées pour une analyse immunofluorescente. Par exemple, sur cette image, la coloration des nerfs de l’épithélium et des vaisseaux sanguins.Chez un embryonnaire, une glande lacrymale 16 d’un CD de type sauvage un embryon peut être observé l’expression de la GFP dans la glande lacrymale par des souris PAC postnatales ou adultes six souris CRE facilite une identification et une dissection rapides de la glande lacrymale de ces animaux transgéniques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du développement des glandes lacrymales, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le dysfonctionnement des glandes lacrymales dû à une maladie auto-immune ou un traitement par irradiation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de localiser et d’isoler la glande lacrymale murine pour l’analyse de la culture ex vivo.

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JoVE Journal

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Cette vidéo décrit l’intervention chirurgicale visant à enlever les deux parties : palpébrale et orbitaire de la glande lacrymale supérieure d’un lapin afin de créer un modèle de sécheresse oculaire. Ce modèle de lapin convient aux études de l’homéostasie de la surface oculaire, de la physiopathologie et des thérapies oculaires.

Élimination de la glande lacrymale supérieure : une technique chirurgicale pour enlever les parties palpébrale et orbitale de la glande lacrymale supérieure du modèle de lapin

Dans cette vidéo, nous décrivons une intervention chirurgicale visant à retirer la grande glande lacrymale inférieure d’un modèle de lapin afin d’étudier l’effet sur la production de larmes chez l’animal.

Ablation de la glande lacrymale inférieure d’un modèle de lapin : une intervention chirurgicale pour retirer la plus grande glande lacrymale inférieure de l’orbite de l’œil de lapin

Cette vidéo décrit la procédure d’induction de la sécheresse oculaire dans un modèle de lapin par une injection de Concanavalin A dans le lobe orbitaire de la glande lacrymale supérieure. Le modèle développé est utile pour étudier l’efficacité de divers médicaments dans le traitement de la sécheresse oculaire.

Réalisation d’une injection dans le lobe orbitaire de la glande lacrymale supérieure : une technique pour induire la sécheresse oculaire dans un modèle de lapin

La glande lacrymale (LG) a deux types de cellules exprimant l’actine du muscle lisse α (αSMA): les cellules myoépithéliales (CEM) et les périoctets. Les CEM sont d’origine ectodermique, trouvées dans de nombreux tissus glandulaires, tandis que les périoctets sont des cellules musculaires lisses vasculaires d’origine endodermique. Ce protocole isole les CEM et les périoctets des LGs murins.

Isolement des cellules myoépithéliales des glandes murines lacrimal et sous-mandibulaires adultes

Cet article décrit le développement d'une méthode pour induire la maladie sèche ou chronique d'oeil aigu dans des lapins en injectant le concanavalin A à toutes les parties du système lacrimal orbital de glande. Cette méthode, supérieure à celles déjà signalées, génère un modèle reproductible et stable d'œil sec adapté à l'étude d'agents pharmacologiques.

Un modèle de lapin de la maladie sèche aqueuse-déficiente d'oeil induite par concanavalin une injection dans les glandes lacrimal : application aux études d'efficacité de drogue

Une nouvelle approche est présentée pour induire la maladie chronique sèche d'oeil dans des lapins en enlevant chirurgicalement toutes les glandes lacrimal orbitales. Cette méthode, distincte de ceux précédemment rapportés, produit un modèle stable et reproductible de l'oeil sec déficient aqueous bien adapté pour étudier la physiologie et la pathophysiologie de lare et les thérapeutiques oculaires.

Établissement d'un modèle d'oeil sec grave utilisant la Dacryoadenectomy complète dans des lapins

La méthode de culture tridimensionnelle sans sérum pour les cellules souches de la glande lacrymale adulte (LG) est bien établie pour l’induction de la formation d’organoïdes LG et la différenciation en cellules acineuses ou canalaires.

Système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale

Ce protocole décrit comment établir, maintenir, modifier génétiquement, différencier, caractériser fonctionnellement et transplanter des organoïdes des glandes lacrymales dérivés de tissus primaires de souris et humains.

Établissement, entretien, différenciation, manipulation génétique et transplantation d’organoïdes lacrymaux et humains

Ici, nous établissons un modèle de dysfonctionnement des glandes lacrymales chez le rat pour fournir une base pour l’étude de la sécheresse oculaire carencée en eau.

Un modèle de rat de sécheresse oculaire avec un dysfonctionnement de la glande lacrymale induit par la scopolamine

Ici, nous présentons une méthode pour établir un modèle murin de sécheresse oculaire aqueuse-déficiente en excisant les glandes lacrymales extra-orbitaires et infraorbitaires et évaluons les changements de la surface oculaire dans la sécheresse oculaire par carence aqueuse.

Etablissement d’un modèle murin de sécheresse oculaire par carence aqueuse

Apprenez à analyser le développement de la glande lacrymale murine par culture ex vivo. Cette méthode permet d'étudier les voies de signalisation impliquées dans la morphogenèse épithéliale.

Manipuler le murin Glande lacrymale

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