Manipuler le murin Glande lacrymale

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser le développement des glandes lacrymales en utilisant une approche ex vivo pour la manipulation et l’analyse des événements de signalisation au cours du développement des glandes. Ceci est réalisé en disséquant d’abord les glandes lacrymales des embryons du jour 16. Dans un deuxième temps, les glandes sont placées sur des filtres, flottant en culture, un milieu contenant des inhibiteurs de petites molécules ou des facteurs de croissance qui modifient le développement des glandes lacrymales.

Après 24 heures, les glandes sont fixées et immuno-colorées pour les protéines de développement d’intérêt. En fin de compte, les changements dans l’expression des protéines au cours du développement ex vivo des glandes lacrymales peuvent être analysés par microscopie immunofluorescente. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement des glandes lacrymales.

Par exemple, quels sont les mécanismes de signalisation qui définissent la glande lacrymale ? La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la glande lacrymale est difficile à reconnaître au cours du développement embryonnaire précoce sans un guidage visuel et une pratique pour la localiser. Pour récolter la glande lacrymale d’une souris embryonnaire, utilisez de l’éthanol à 70 % pour stériliser la face ventrale d’une souris embryonnaire, 14 à 16 souris enceintes.

Ensuite, pincez la peau et coupez la peau le long de la ligne médiane de l’animal pour exposer le péritoine, coupez à travers le péritoine pour exposer la cavité abdominale et le myomètre et retirez les deux cornes du myomètre et placez-le dans du PBS froid. Ensuite, utilisez la pince numéro cinq pour transférer les embryons des sacs amniotiques dans une deuxième boîte de Pétri stérile contenant du PBS froid en prenant soin de ne pas toucher les yeux ou la tête. Après avoir séparé la tête du torse, juste en dessous de la mandibule inférieure, tournez la tête de sorte que la mandibule soit maintenant sur la plaque de dissection.

Ensuite, utilisez une pince pour stabiliser la tête et un scalpel pour retirer environ un quart de la face dorsale du cerveau, orientez la tête de manière à ce que le scalpel puisse percer le nez entre les yeux, puis faites une coupe au centre de la tête de sorte que les yeux soient maintenant sur des moitiés séparées. Ensuite, à l’aide de l’éclairage ci-dessus et dessous, saisissez la peau du coin inférieur postérieur de l’œil et ouvrez soigneusement la peau avec la pince pour exposer la glande lacrymale, qui devrait apparaître comme un bourgeon sur un canal à l’intérieur d’un mésenchyme condensé plus foncé. Disséquez soigneusement la glande lacrymale et le mésenchyme associé loin des tissus environnants, en prenant soin de ne pas saisir la glande lacrymale ou son canal associé.

Ensuite, une fois que la glande lacrymale est libérée du tissu environnant, saisissez doucement l’épithélium entourant l’œil à la base du canal de la glande lacrymale et retirez toute la glande. Prenez soin de préserver le Meen chi entourant l’épithélium, qui peut être observé comme un tissu condensé dans lequel l’épithélium s’invagine. Ensuite, cultivez quatre à cinq glandes lacrymales à l’aide d’un filtre dans une boîte de Pétri contenant un milieu de culture et les petites molécules inhibitrices ou facteurs de croissance d’intérêt pendant 24 heures pour récolter la glande lacrymale d’une souris postnatale ou adulte, vaporisez d’abord le contour des yeux avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, posez l’animal sur le côté latéral vers le haut sous un microscope à dissection avec un éclairage par le haut. Ensuite, utilisez de petits ciseaux de dissection pour faire une incision dans l’épiderme latéralement à partir de l’endroit où la glande lacrymale devrait être située. Ouvrez ensuite l’épiderme vers l’oreille pour exposer la glande lacrymale, qui chez la souris postnatale et adulte est bordée par l’artère carotide, le muscle maculé et le derme Détachez doucement la glande lacrymale du tissu environnant avec la pince, puis une fois que la glande lacrymale est libérée de l’emprise tissulaire environnante, où le canal et l’épithélium entourant l’œil se connectent et retirez soigneusement la glande.

Enfin, fixez les glandes lacrymales avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes avant l’immuno-marquage. Pour les protéines développementales d’intérêt, la glande lacrymale se développe par le processus de morphogenèse de la ramification épithéliale. Ces images en fond clair de glandes lacrymales embryonnaires, disséquées aux jours embryonnaires 14, 15, 16, 17 et au deuxième jour postnatal, illustrent ce processus.

Notez que lorsque la taille de l’épithélium augmente, la quantité de mésenchyme diminue, comme illustré sur ces images. Les glandes lacrymales se développent dans des conditions de culture in vivo de la même manière qu’à l’intérieur des cultures de glandes in vivo, et les glandes lacrymales fraîchement disséquées peuvent être fixées pour une analyse immunofluorescente. Par exemple, sur cette image, la coloration des nerfs de l’épithélium et des vaisseaux sanguins.

Chez un embryonnaire, une glande lacrymale 16 d’un CD de type sauvage un embryon peut être observé l’expression de la GFP dans la glande lacrymale par des souris PAC postnatales ou adultes six souris CRE facilite une identification et une dissection rapides de la glande lacrymale de ces animaux transgéniques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du développement des glandes lacrymales, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le dysfonctionnement des glandes lacrymales dû à une maladie auto-immune ou un traitement par irradiation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de localiser et d’isoler la glande lacrymale murine pour l’analyse de la culture ex vivo.