Name: Préparation dune hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Apprenez à préparer un pellet bactérien à partir d'une hémoculture positive pour l'identification rapide par MALDI-TOF et les tests de sensibilité aux antibiotiques. Cette méthode améliore la prise en charge clinique des infections.

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Nous remercions les techniciens du laboratoire de bactériologie du CHU de Lausanne pour leur aide à la mise en œuvre des techniques de laboratoire.

Ce protocole a été développé et validé en suivant les processus de recherche et développement et les règles éthiques de notre institution avant d&#39;être mis en œuvre comme un outil de routine. 1 Préparation d&#39;une culture bactérienne du sang Pellet par ammonium procédure chlorure érythrocytes-lyse <ol><li> Préparation d&#39;une hémoculture positive pour la centrifugation ultérieure. <ol><li> Stériliser le bouchon de culture de sang. Ajouter 70% d&#39;éthanol sur le bouchon de la bouteille et de le brûler. NOTE: Ne pas effectuer cette étape sous une hotte à flux laminaire. </li><li> Déplacer la bouteille à une hotte à flux laminaire. Recueillir 5 ml de la culture de sang avec une seringue de 20 G. </li><li> Ajouter 5 ml de la culture de sang dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 45 ml d&#39;eau stérile (H 2 O) et de mélanger l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Préparation d&#39;une culture de sang par lyse culot bactérien centrifugation. <ol><li> Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Remove du surnageant (qui contient principalement du H 2 O et de cellules sanguines) avec une pompe à vide de laboratoire. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 ml de chlorure d&#39;ammonium artisanale solution (0,15 M de NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3) de lyse. Décomposer le culot par grattage et au vortex et centrifuger le tube de l&#39;échantillon à 140 xg pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant qui contient principalement les globules rouges débris. <ol><li> Si la pastille est restée hémorragique, remettre en suspension le culot dans 2 ml d&#39;eau stérile distillée et 2 0 en outre à lyser les globules rouges résiduels et laver le culot. Centrifuger l&#39;échantillon à 140 g pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. </li></ol></li><li> Remettre en suspension le culot dans 200 pl de H 2 O </li></ol></li><li> Subculture de culture de sang sur divers milieux de gélose sélective et non sélective. <ol><li> Prélever 1 ml de la culture de sang avec une seringue de 20 G. </li><li> Inoculer une goutte de culture de sang into quatre quadrants sur gélose au sang, une gélose au chocolat, de l&#39;agar agar et Schaedler McConkey. </li><li> Incuber à 37 ° C, la gélose au sang et des plaques d&#39;agar au chocolat dans une atmosphère de CO2 à 5%, la gélose de McConkey dans une atmosphère normale, et la plaque de gélose Schaedler dans des conditions anaérobies. </li><li> Suivez la croissance bactérienne sur les différents médias. </li><li> Vérifier la pureté bactérienne. </li></ol></li></ol> 2 Identification par MALDI-TOF MS <ol><li> L&#39;identification directe à partir du culot de sang. <ol><li> Transfert 1 pl de la pastille de sang sur une plaque cible MALDI et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C. </li><li> Superposer l&#39;échantillon avec de l&#39;acide formique 1 ul de 70% et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C. </li><li> Superposer l&#39;échantillon avec 1 pl de matrice MALDI et laisser sécher sur une plate-forme C 42 ° chauffage (solution de α-cyano-4-hydroxycinnamique dans 50% d&#39;acétonitrile-2.5% d&#39;acide trifluoroacétique saturé). </li><li> Passez à la MALDI-TOF MS avec un système MALDI-TOF MS comme décrit par les fabricants. </li><li> Si le score d&#39;identification est valide au niveau de l&#39;espèce (par exemple, avec un score &lt;2), effectuer une extraction de protéines de l&#39;échantillon de granulés dans le sang. </li></ol></li><li> Identification de la protéine après extraction du culot de la culture de sang. <ol><li> Mélanger 20 ul de la pastille avec 1 ml d&#39;éthanol à 70% et centrifugation à 13 000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 25 ul d&#39;acide formique à 70% et 25 ul de 100% d&#39;acétonitrile à la pastille. Vortex vigoureusement pour remettre en suspension les culots. Remettre en suspension granulés difficiles en les décomposant avec des embouts de pipette avant vortex. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 2 min à température ambiante. Transfert 1 pi du surnageant (qui contiennent des protéines extraites) sur une plaque cible MALDI et laisser sécher sur une plate-forme de chauffage à 42 ° C. Procédez comme décrit dans le paragraphe 2.1.2. </li></ol></li></ol> 3. bactérienne Identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques avec un système automatisé microbienne <ol><li> Préparation d&#39;une suspension bactérienne d&#39;identification bactérienne et AST avec un système automatisé microbienne. <ol><li> Préparer un tube en matière plastique contenant 3 ml de solution stérile de NaCl à 0,45% compatible avec le système automatisé microbienne. </li><li> Ajouter une quantité suffisante de la culture de culot de sang dans la solution de NaCl à 0,45% pour obtenir une suspension bactérienne correspondant à une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8. Mesure de la turbidité en utilisant un appareil à densitomètre. NOTE: Le volume du culot bactérien de la culture de sang varie de 50 à 200 pl pour obtenir une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8. </li></ol></li><li> Inoculer les bactéries Gram-positif (GP) ou Gram-négatif (GN) cartes automatisés d&#39;identification et les cartes AST automatisés pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens des Cocci Gram-positives et Gram-négatives bactéries comme décrit par le fabricant. REMARQUE: identification avec GP ou cartes GN n&#39;est pas appliquée si MALDI-TOF MS valeur du score d&#39;identification est&gt; 2. Vérifier la pureté de la suspension bactérienne par repiquage la suspension bactérienne sur gélose au sang (GP et GN) et la gélose Mac Conkey (GN) plaques. </li></ol> 4 essais de sensibilité aux antibiotiques par disque Diffusion Assay Le test de diffusion sur disque est décrit par le Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens (EUCAST, Version 3.0, Avril 2013, www.eucast.org). <ol><li> Préparation d&#39;une suspension bactérienne à effectuer des tests de sensibilité aux antimicrobiens par un essai de diffusion de disques. <ol><li> Préparer un tube en verre contenant 3 ml de solution stérile de NaCl à 0,9%. </li><li> Ajouter une quantité suffisante de la culture de culot de sang dans la solution de NaCl à 0,9% pour obtenir une suspension bactérienne correspondant à une turbidité de 0,5 McFarland. Mesure de la turbidité en utilisant un appareil à densitomètre. REMARQUE: Le volume de la culture de sangculot bactérien varie de 50 à 200 pl pour obtenir une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8. </li><li> Vortex la suspension bactérienne. </li></ol></li><li> L&#39;inoculation de la suspension bactérienne sur de la gélose de Mueller-Hinton (MH) ou Mueller-Hinton agar agar organismes-fastidieuse (MHF) (MH supplémenté avec 5% de sang de cheval défibriné et 20 mg / L de β-nicotinamide adénine dinucléotide). <ol><li> Trempez un coton-tige stérile dans la suspension bactérienne et retirez délicatement l&#39;excès de liquide en tournant la tige sur la paroi interne du tube de verre. </li><li> Etaler la suspension bactérienne de façon égale sur toute la surface de la plaque de gélose MH / MHF par écouvillonnage ou dans trois directions à l&#39;aide d&#39;un rotateur de plaque automatisé. </li></ol></li><li> Application des disques antimicrobiens sur des plaques de gélose ensemencées. <ol><li> Appliquer près les disques sur la surface des plaques de gélose ensemencées séchées manuellement ou à l&#39;aide d&#39;un distributeur de sensibilité sur disque. </li><li> Incuber la plaque à la tempe appropriérature et de l&#39;atmosphère, comme décrit dans la méthode de diffusion EUCAST disque de test de sensibilité aux antimicrobiens (Version 3.0, Avril 2013, www.eucast.org). </li></ol></li></ol> 5. automatisé PCR à base de test de diagnostic pour la détection de SARM <ol><li> Utilisation d&#39;une micro-pipette, transférer 50 pi de la pastille de culture de sang dans le flacon de réactif d&#39;échantillon fourni avec le kit SARM automatisé de test de diagnostic basé sur la PCR et vortex pendant 20 s. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une micropipette de 1 ml, distribuer l&#39;échantillon dans l&#39;orifice d&#39;échantillon de la cartouche. Insérez la cartouche dans le système PCR automatisé et commencer le dosage comme décrit par le fabricant. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Par rapport aux approches diagnostiques d&#39;hémoculture positifs classiques, l&#39;acquisition rapide d&#39;un culot bactérien en utilisant le chlorure lyse approche de centrifugation d&#39;ammonium réduire le temps de signaler l&#39;identification de 16 à 24 heures et le temps de signaler AST de 24 à 48 h (figures 1 et 3). Introduction rapide d&#39;une antibiothérapie appropriée est essentielle pour améliorer les résultats des patients souffrant d&#39;infections de la cir...

Les bactériémies et septicémie chez les patients hospitalisés sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Ainsi, la mortalité liée à la circulation sanguine infections est observée chez environ 14% à 37% des patients hospitalisés et peut augmenter de 35% en unités de soins intensifs des patients 1-3. L&#39;identification rapide de l&#39;agent infectieux est essentiel pour guider le traitement optimal des antimicrobiens et à accroître le succès de la thérapie antimicrobienne 4,5. L&#39;analyse rapide de la coloration de Gram de hémoculture positive a déjà un impact significatif sur l&#39;adaptation de la thérapie antimicrobienne 6,7 mais l&#39;identification précise de l&#39;agent infectieux est nécessaire pour fournir le traitement antibiotique le mieux adapté aux patients. Par exemple, les différents régimes de traitement antibiotique doivent être mis en œuvre suivant une bactériémie avec les entérocoques et les streptocoques qui sont difficiles à distinguer par la coloration de Gram. De même, l&#39;identification à l&#39;espèce Level est nécessaire pour détecter les entérobactéries Gram négatif ampC codant pour un gène chromosomique qui confère une résistance accrue aux β-lactames 8. Avec une hémoculture positive, l&#39;approche diagnostique classique consiste à repiquer l&#39;agent infectieux sur différentes plaques d&#39;agar, qui nécessite plusieurs heures d&#39;incubation supplémentaire identification préalable avec diverses approches, y compris des tests biochimiques, la croissance sur différents milieux sélectifs et les systèmes d&#39;identification microbienne automatisés. Le temps les résultats d&#39;une approche diagnostique classique est d&#39;environ 1 à 3 jours. L&#39;émergence de la technologie désorption laser assistée par matrice / ionisation temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF) pour l&#39;identification rapide des micro-organismes a fourni un nouvel outil pour identifier rapidement les micro-organismes de colonies cultivées sur des plaques d&#39;agar-agar, mais aussi directement à partir de sang positif cultures (Figure 1) 9-12. Thl&#39;utilisation de l&#39;e de MALDI-TOF d&#39;identifier un agent infectieux à partir d&#39;hémocultures a considérablement réduit le temps aux résultats de quelques minutes au lieu des heures et des jours requis par les méthodes traditionnelles. Comme on le verra par Croxatto et al. 13, l&#39;efficacité de l&#39;identification MALDI-TOF repose sur différents paramètres, y compris la pureté et la quantité du micro-organisme. Ces deux critères sont facilement obtenus à partir des colonies distinctes cultivées sur des plaques d&#39;agar mais nécessaire un traitement pré-analytique pour l&#39;enrichissement bactérienne et purification à partir d&#39;échantillons complexes tels que la culture de sang, qui contiennent plusieurs composants cellulaires et des protéines qui peuvent interférer avec identification MALDI-TOF. Les méthodes d&#39;isolement de divers micro-organismes de culture de sang ont été utilisés dans un certain nombre d&#39;études, y compris la saponine ou une autre méthode de détergents doux pour l&#39;extraction bactérienne 9,14, méthode de séparation de sérum 10, la lyse des méthodes de centrifugation 12 </shaut&gt; et solutions commercialement tels que le kit de sepsityper. Notre laboratoire de diagnostic bactériologique a mis au point un sang-culture simple préparation de culot bactérien à base de chlorure d&#39;ammonium érythrocytes-lyse qui permettent une identification rapide de bactéries et de levures par MALDI-TOF et des systèmes d&#39;identification automatisés (figure 2) 15. Cette préparation de pastilles hémoculture également fournir un échantillon pour d&#39;autres applications directes en aval tels que la coloration de Gram, tests de diagnostic basés sur la PCR automatisées telles que POCT-PCR pour la détection rapide de résistant à la méthicilline Staphylococcus aureus (SARM) et les tests de sensibilité aux antibiotiques des Les systèmes automatisés d&#39;AST et / ou par des essais de diffusion de disque sur plaques d&#39;agar-agar (figure 3). Dans ce travail, nous décrivons les différentes étapes de la préparation du culot bactérien sang-culture, comme expliqué par Prod&#39;hom et al. 15 (figure 4). Nous allons également déscribe les protocoles pour trois des principales applications qui peuvent être exécutées sur le culot de la culture de sang: Identification par MALDI-TOF 15, l&#39;identification (ID) et les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) avec les systèmes automatisés 16 pour les entérobactéries et les staphylocoques et PCR automatisé test diagnostique pour la détection du SARM 17.

<table><tbody><tr><td>Aiguille de 20 g</td><td>Terumo, Louvain, Belgique</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352070</td><td>50 ml Tubes à centrifuger</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de potassium</td><td>Fluka, St. Louis, MO, États-Unis&nbsp ;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis.</td><td>F0507</td><td>Inflammable, corrosif&</td></tr><tr><td>#945 ;-Acide cyano-4-hydroxycinnamique</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp ;</td><td>70990</td><td>Toxicité aiguë</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis.</td><td>271004</td><td>Inflammable, toxicité aiguë</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis&nbsp ;</td><td>T6508</td><td>Corrosif, toxicité aiguë</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 instrument</td><td>Biom&eacute ; rieux, Marcy-l’Etoile, France</td><td>27202</td> instrument <td>de système microbien automatisé</td></tr><tr><td>Vitek 2 Carte à Gram positif (GP)</td><td>Biom&eacute ; rieux, Marcy-l’Etoile, France</td><td>21342</td><td>carte d’identification GP&nbsp ; automatisée</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-P580 carte</td><td>Biom&eacute ; rieux, Marcy-l’Etoile, France</td><td>22233</td><td>système AST microbien automatisé</td></tr><tr><td>Vitek 2 Carte Gram-négatif (GN)</td><td>Biom&eacute ; rieux, Marcy-l’Etoile, France</td><td>21341</td><td>carte d’identification GN&nbsp ; automatisée</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-N242 carte</td><td>Biom&eacute ; rieux, Marcy-l’Etoile, France</td><td>413391</td><td>système AST microbien automatisé</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, États-Unis</td><td>&nbsp ; GXMRSA-100N-10</td><td>technologie d’amplification des acides nucléiques Instrument MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td><td>GXIV-4-D</td><td>Instrument de technologie d’amplification des acides nucléiques</td></tr><tr><td>Microflex LT MALDI-TOF MS instrument</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>BDAL microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 acier cible BC</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>280799</td><td>Plaque cible MALDI</td></tr><tr><td>Densitomètre Densicheck instrument</td><td>Biom&eacute ; rieux, Marcy-l’Etoile, France</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey</td><td>agar Biolife, Milan, Italie</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>gélose Mueller-Hinton</td><td>Oxoid, Hampshire, Angleterre</td><td>CM0337</td><td>Gélose Mueller-Hinton (MH)&nbsp ;</td></tr><tr><td>gélose MHF</td><td>Biom&eacute ; rieux, Marcy-l’Etoile, France</td><td>43901</td><td>gélose agar-fastidiouse de Mueller-Hinton gélose aux organismes fastidieux (MHF)</td></tr><tr><td>BD columbia III agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, États-Unis</td><td>254071</td><td>gélose au sang</td></tr><tr><td>BD gélose au chocolat</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, États-Unis</td><td>254089</td><td>gélose au chocolat</td></tr><tr><td>BD gélose schaedler</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, États-Unis</td><td>254084</td><td>gélose Schaedler</td></tr></tbody></table>

préparation d&#39;une hémoculture pellet pour rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Les bactériémies et septicémie sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Le succès des patients atteints de bactériémie dépend de l&#39;identification rapide de l&#39;agent infectieux pour guider le traitement antibiotique optimal. L&#39;analyse de la coloration de Gram de la culture de sang positive peut être réalisée rapidement et déjà d&#39;impact significatif sur le traitement antibiotique. Cependant, l&#39;identification précise de l&#39;agent infectieux est toujours nécessaire pour établir le traitement optimal ciblée. Nous présentons ici une préparation de culot bactérien simple et rapide à partir d&#39;une hémoculture positive qui peut être utilisé comme un échantillon de plusieurs applications essentielles en aval telles que l&#39;identification par MALDI-TOF MS, les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) par méthode de diffusion sur disque ou systèmes AST automatisés et par PCR automatisé à base de tests de diagnostic. La performance de ces systèmes d&#39;identification et AST différentes appliquées directement sur les culots bactériens d&#39;hémoculture est très similar à la performance s&#39;obtient normalement à partir des colonies isolées cultivées sur des plaques d&#39;agar-agar. Par rapport aux approches conventionnelles, l&#39;acquisition rapide d&#39;un culot bactérien réduit considérablement le temps de signaler la fois l&#39;identification et AST. Ainsi, suite à sang positivité de la culture, de l&#39;identification par MALDI-TOF peut être signalée en moins de 1 heure alors que les résultats d&#39;AST par des systèmes AST automatisés ou des essais de diffusion de disque dans les 8 à 18 heures, respectivement. De même, les résultats d&#39;un test rapide basé sur la PCR peuvent être communiqués aux cliniciens moins de 2 heures suivant le rapport d&#39;une bactériémie. Ensemble, ces résultats démontrent que la préparation rapide d&#39;un culot bactérien de la culture du sang a un impact significatif sur le temps d&#39;identification et AST redressement et donc sur le succès de patients souffrant d&#39;infections de la circulation sanguine.

Dans l'étude effectuée par Prod'hom et al. 15, culots bactériens obtenus par lyse de chlorure d'ammonium centrifugation de 122 hémoculture positive à partir de 78 patients ont été analysés par MALDI-TOF MS. Sur 122 hémoculture positive, 95 (77,9%) ont été correctement identifiés au niveau de l'espèce et un (0,8%) au niveau du genre. Les 26 (21,3%) des pastilles d'hémoculture restants n'ont donné aucune identification fiable par MALDI-TOF. Parmi ceux-ci, 21 sont des bactéries Gram positives, y compris...

Une préparation de culot bactérien rapide à partir d&#39;une culture de sang positif peut être utilisé comme échantillon pour des applications telles que l&#39;identification par MALDI-TOF, la coloration de Gram, les tests de sensibilité aux antibiotiques et le test basé sur la PCR. Les résultats peuvent être transmis rapidement aux cliniciens pour améliorer les résultats des patients souffrant d&#39;infections du courant sanguin.

Préparation d&#39;une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

L’objectif global de cette procédure est de préparer une pastille bactérienne à partir d’une hémoculture positive qui peut être utilisée comme échantillon pour diverses applications. Ceci est accompli en mélangeant d’abord une hémoculture positive avec de l’eau stérile après la centrifugation. La pastille est remise en suspension dans du chlorure d’ammonium pour époux les globules rouges après un deuxième cycle de centrifugation.Le granulé est remis en suspension dans l’eau. La dernière étape consiste à utiliser la pastille obtenue pour l’identification bactérienne par désorption laser assistée par ionisation, temps de vol, coloration de Gram, test de sensibilité aux antibiotiques et/ou tests PCR. Les résultats obtenus peuvent être rapidement communiqués aux cliniciens afin d’améliorer l’issue des patients souffrant d’infections du sang.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la sous-culture bactérienne d’hémocultures positives est de réduire l’identification bactérienne d’environ six à 24 heures et de réduire le délai d’apparition des résultats de résistance aux antibiotiques d’environ 24 heures. Cette méthode peut aider à adapter rapidement le traitement antibiotique et à améliorer le pronostic des patients souffrant d’infections sanguines. Bien que cette méthode puisse être appliquée à des méthodes d’identification de routine telles que l’OV et aux approches conventionnelles de test de durabilité antimicrobienne, elle peut également être appliquée à de nouvelles technologies visant à l’ification des facteurs VUL et/ou des mécanismes de résistance tels que les activités ESBL et CARBAPENEMASE.La démonstration visuelle de cette méthode est importante car la préparation bactérienne du PAL est cruciale afin d’obtenir suffisamment de matériel microbien pour les applications en aval, la démonstration de la procédure sera assurée par Christian Durel, Maria Cortesi, Maria ti et Kim Giza, qui sont tous des techniciens de laboratoire de mon laboratoire. Stérilisez le capuchon de l’hémoculture en ajoutant 70 % d’éthanol sur le bouchon du flacon et en le brûlant. Déplacez ensuite la bouteille dans une hotte à flux laminaire.Prélever cinq millilitres d’hémoculture à l’aide d’une seringue aiguille de calibre 20. Ensuite, ajoutez les cinq millilitres d’hémoculture dans un tube à centrifuger de 50 millilitres contenant 45 millilitres d’eau stérile et mélangez l’échantillon. Centrifugez l’échantillon à 1000 G pendant 10 minutes.À température ambiante, retirer le surnageant à l’aide d’une pompe à vide de laboratoire. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un millilitre de chlorure d’ammonium fait maison. Solution de lyse.Décomposez la pastille en grattant et en tourbillonnant avant la centrifusion de l’échantillon à 140 g pendant 10 minutes À température ambiante après centrifugation, jetez le surnageant, qui contient principalement des débris de globules rouges. Si la pastille est restée hémorragique, suspendez la pastille dans deux millilitres d’eau stérile et distillée pour provoquer d’autres poux de globules rouges résiduels et pour laver la pastille après avoir centrifugé l’échantillon comme auparavant, jetez le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres d’eau et faites un vortex dans le tube pour une identification directe de la pastille de sang. Tout d’abord, transférez un microlitre de granulés sur une plaque cible MALDI et laissez-le sécher sur une plate-forme chauffante à 42 degrés Celsius.Superposez l’échantillon avec un microlitre d’acide formique à 70 % et laissez-le sécher sur la plate-forme chauffante. Ensuite, superposez l’échantillon avec un microlitre de Maldi Matrixx et laissez sécher à nouveau sur la plate-forme de chauffage. Passez à l’analyse maldi TOF MS à l’aide d’un système MALDI TOF MS tel que décrit par les fabricants.Si le score d’identification n’est pas valide au niveau de l’espèce, effectuez une extraction protéique de l’échantillon de pastille de sang en mélangeant d’abord 20 microlitres de pastille avec un millilitre d’éthanol à 70 %. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13 000 G pendant deux minutes à température ambiante, jetez le surnageant et ajoutez 25 microlitres d’acide formique à 70 % et 25 microlitres de nitrile à 100 % acéto au vortex de granulés pour remettre en suspension le granulé après la centrifugation à 13 000 G pendant deux minutes. À température ambiante, transférez un microlitre de surnageant sur une plaque cible MALDI et laissez-le sécher sur une plate-forme chauffante à 42 degrés Celsius.Pour effectuer l’identification bactérienne et le test de sensibilité aux antibiotiques ou un test ST d’abord, préparez un tube en plastique contenant trois millilitres de solution stérile de chlorure de sodium à 0,45 % compatible avec le système microbien automatisé. Ajouter un volume suffisant de pastille d’hémoculture à la solution et au vortex pour obtenir une suspension bactérienne correspondant à une turbidité McFarland de 0,6 à 0,8 mesurée à l’aide d’un densitomètre. Ensuite, inoculez les cartes Gram positif ou Gram négatif automatisées pour l’identification.Inoculez également les cartes automatisées a ST pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens des cocci à Gram positif et des bactéries à Gram négatif, comme décrit par le fabricant. Effectuer des tests de sensibilité aux antimicrobiens par dosage de diffusion sur disque. Préparez d’abord un tube de verre contenant trois millilitres de solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 %.Ajouter ensuite un volume suffisant de pastille d’hémoculture à la solution pour obtenir une suspension bactérienne correspondant à une turbidité McFarland de 0,5 mesurée par un appareil densitomètre. Vortex la suspension bactérienne pour inoculer la suspension bactérienne. Tout d’abord, trempez un coton-tige stérile dans la suspension bactérienne et retirez délicatement l’excès de liquide en tournant l’écouvillon sur la paroi intérieure du tube de verre.Ensuite, répartissez uniformément la suspension bactérienne sur toute la surface de Mueller. Astuce et tarière ou Astuce de Mueller et tarière pour les organismes exigeants par écouvillonnage dans trois directions ou à l’aide d’un rotateur de plaque automatisé pour l’application de disques antimicrobiens sur des plaques de tarière inoculées. Tout d’abord, appliquez étroitement les disques sur la surface des plaques de vis inoculées séchées manuellement ou à l’aide d’un distributeur de disques de sensibilité.Ensuite, incubez la plaque à la température et à l’atmosphère appropriées, comme décrit dans la méthode de diffusion du disque du comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens pour effectuer le test de diagnostic automatisé basé sur la PCR. Tout d’abord, à l’aide d’une micro-pipette, transférez 50 microlitres de pastille d’hémoculture dans le flacon de réactif d’échantillon fourni avec le kit de test de diagnostic automatisé basé sur la PCR MSA. Ensuite, faites tourbillonner le flacon pendant 20 secondes à l’aide d’une micro-pipette d’un millilitre.Distribuez l’échantillon dans l’orifice de l’échantillon de la cartouche. Insérez la cartouche dans le système PCR automatisé et démarrez le test comme décrit par le fabricant dans le laboratoire de Lausanne. Le résultat est directement validé et transmis aux cliniciens grâce à la connectivité du système PCR automatisé utilisé avec un système d’interface de laboratoire ou LIS.Si le résultat n’est pas valide, nous recommandons de répéter le test après dilution décuplé de la pastille bactérienne. Comme cela est souvent dû aux inhibiteurs de la PCR, l’hémolyse au chlorure d’ammonium a produit une pastille d’hémoculture de très haute qualité avec peu de débris érythrocytaires par rapport au témoin négatif sans chlorure d’ammonium. La coloration de Gram d’une hémoculture positive d’Escher Coli Coagulase, d’un staphylocoque capita négatif et d’un streptocoque disque EA a été réalisée avant et après la préparation de l’hémoculture.La préparation du granulé bactérien à l’aide de cette approche permet de concentrer le micro-organisme d’environ 100 à 1000 fois. Dans l’ensemble, il existe plusieurs applications en aval qui peuvent être réalisées à partir de la pastille d’hémoculture, qui bénéficient toutes d’un temps réduit pour obtenir des résultats sans sensibilité et spécificité réduites par rapport aux tests effectués sur des colonies isolées. Une fois le pâté maîtrisé, la préparation peut se faire en 30 minutes environ si elle est correctement réalisée.N’oubliez pas que le travail avec une hémoculture peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail avec des gants et sous une cagoule doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Un protocole rapide pour l'identification directe de Enterococcus faecalis et Enterococcus autre d'une hémoculture positive en utilisant un acide nucléique peptidique fluorescentes test d'hybridation in situ (FISH ANP).

Une procédure de 1,5 heure pour l&#39;identification des Enterococcus Espèces directement à partir d&#39;hémocultures

La conception d'un système de flux de travail d'une journée simple pour le diagnostique des pathogènes bactériens permet la reconnaissance rapide des infections du sang. L'inclusion de huit cliniquement pertinentes cibles bactériennes et leurs profils de résistance aux antibiotiques offre au clinicien un premier aperçu sur le même jour, ce qui peut conduire à un traitement plus adéquat.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche pour générer des sondes DNAzyme fluorogènes qui peuvent être appliqués à mettre en place un simple, «mix-and-lire" immunofluorescence pour la détection bactérienne. Ces sondes d'ADN spécifiques catalyser le clivage d'un chromophore de modification d'ADN-ARN substrat chimérique en présence d'un mélange brut extracellulaire (LEC) produite par une bactérie spécifique, traduisant ainsi la détection de bactéries dans la génération du signal de...

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Source : Koeth, L. M., et. al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In  Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobi. J. Vis. Exp. (2015).Cette vidéo montre la méthode de microdilution en bouillon pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un antibiotique lipoglycopeptide contre les bactéries à Gram positif. Il couvre l’isolement des colonies bactériennes, la dilution, l’inoculation de puits de microplaques avec des concentrations variables...

Méthode de microdilution en bouillon pour l’antibiogramme de bactéries à Gram positif

L'application de laser désorption / ionisation de temps assistée par matrice de vol (MALDI-TOF), la spectrométrie de masse (MS) directement à un bouillon de culture de sang accélère l'identification de bactéries. La méthode présentée est une méthode rapide et fiable pour l'identification des bactéries à Gram négatif directement à partir de bouillon de culture de sang.

Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l&#39;aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

Test de synergie antimicrobiens est utilisée pour évaluer l’effet de deux ou plusieurs antibiotiques utilisés en combinaison et est généralement effectuée par l’une des deux méthodes : le tableau de damier ou l’analyse temps-détruisent. Nous présentons ici une automatisée, technique de jet d’encre imprimante-assisted damier tableau synergie et une étude classique temps-détruisent synergie.

Synergie antimicrobienne essais par le jet d’encre imprimante-assisted damier automatisé Array et la méthode de temps-détruisent manuelle

Les antibiotiques étiquetés fluorescents sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour étudier de multiples aspects de la résistance aux antimicrobiens. Cet article décrit la préparation des antibiotiques fluorescents marqués et leur application à l’étude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Les sondes peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de résistance bactérienne (p. ex., efflux) par spectrophotométrie, cytométrie du débit et microscopie.

Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Ce protocole présente un test rapide de sensibilité aux antimicrobiens (AST) en 2,5 heures par imagerie de diffusion Raman stimulée par une cellule unique du métabolisme D2O. Cette méthode s’applique aux bactéries dans l’urine ou l’environnement sanguin total, ce qui est transformateur pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et l’identification de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir de l’eau et la caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques (ARG). L’utilisation de techniques basées sur la culture et non basées sur la culture (analyse métagénomique) fournit des informations complètes sur la diversité bactérienne totale et le pool total de différents ARG présents dans les eaux douces de Mumbai, en Inde.

Isolement et identification de bactéries résistantes aux antibiotiques d’origine hydrique et caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques

EUCAST a développé un protocole de test direct de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour les hémocultures automatisées. Cependant, sa dépendance à l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse peut être évitée en utilisant un protocole de préparation directe de l’inoculum dans un système automatisé d’identification microbienne. Cette approche permet de fournir des rapports AST dans les 24 heures suivant le prélèvement de l’échantillon.

Identification microbienne directe à l’aide d’un système automatisé d’identification microbienne pour faciliter la méthode RAST d’EUCAST sans spectrométrie de masse

Apprenez à préparer un pellet bactérien à partir d'une hémoculture positive pour l'identification rapide par MALDI-TOF et les tests de sensibilité aux antibiotiques. Cette méthode améliore la prise en charge clinique des infections.

Préparation d'une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

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