Name: De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 10 s
Description: Découvrez comment mesurer la loi de diffusion des lipides et protéines dans les membranes cellulaires vivantes par microscopie à fluorescence en réflexion totale interne. Cette méthode permet d'analyser la dynamique moléculaire avec un microscope commercial standard.

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Système d&#39;étalonnage de 1 <ol><li> Point Spread Fonction étalonnage (PSF) <ol><li> Diluer 10 ul de solution de 30 nm de billes fluorescentes (environ 5 pM) dans 90 ul d&#39;eau distillée, puis la solution sonication pendant 20 min. Couper un morceau de gel d&#39;agarose (3%) et le dépôt de 10 ul de la solution sur le dessus du gel carré (1 cm x 1 cm). Renverser le morceau de gel sur la vitre fond d&#39;un plat de 2 cm de Pétri et presser la baisse sur la vitre. </li><li> Tournez sur la configuration d&#39;acquisition, mettre l&#39;échantillon dans le support, définition de l&#39;exposition de l&#39;appareil photo et EMgain (100 ms et 1000 sont de bons paramètres, mais d&#39;optimiser en fonction du système) et attendent l&#39;appareil refroidir. </li><li> Réglez l&#39;exposition de la caméra à 100 ms, caméra EMgain à 1000, le mode d&#39;acquisition à l&#39;image de transfert, 100 répétitions et l&#39;enregistrement automatique de réglage. </li><li> Utilisation de l&#39;oculaire et l&#39;orientation de la lumière transmise à la frontière du gel et ensuite passer l&#39;objectif au centre du gel, la mise au point et start la procédure d&#39;alignement laser (à LAS AF, sélectionnez &quot;configuration de la FRBR» et suivez la procédure d&#39;alignement automatique). </li><li> Trouver un champ de vision avec des taches simples isolées, précisément l&#39;accent sur la place lumineuse (qui représente généralement perles total) comme référence, l&#39;acquisition de 100 images et répétez l&#39;étape 5-6 fois dans le but d&#39;acquérir plusieurs taches simples. </li><li> Importez la série acquise à un programme de traitement de données et la moyenne de la pile dans le temps (figure 1A) et sélectionnez une seule bille isolé. Prenez soin de choisir les plus petits pour éviter des agrégats de particules. </li><li> Monter la distribution sélectionnée d&#39;intensité (un exemple de profil unique de perles est présenté dans la figure 1B) avec une fonction gaussienne en utilisant la commande &quot;gaussfit&quot; (dans les outils ICS-Matlab dans les matériaux en Matlab). Vérifiez la qualité de l&#39;ajustement en inspectant les résidus obtenus (un exemple de profil gaussien équipée avec les résidus correspondants est présenté in Figure 1B). </li></ol></li><li> l&#39;étalonnage de l&#39;appareil photo <ol><li> Allumez l&#39;appareil photo et attendez que l&#39;appareil refroidisse. Réglez cadre de l&#39;acquisition de la caméra, (c&#39;est à dire, pour l&#39;appareil utilisé, nous mettons l&#39;exposition à 0,5 ms, caméra EMgain à 1000, le mode d&#39;acquisition en mode courte, la taille de la ROI de 32 x 128, 10 000 répétitions) et lancer l&#39;acquisition de l&#39;arrière-plan de la caméra signaux. </li><li> Importation acquis série de trames à un programme de traitement de données. Calculer et contrôler l&#39;intensité moyenne de chaque pixel afin de vérifier que le fond de l&#39;appareil est sensiblement plane dans la région sélectionnée de la puce. En mode courte, enlever la première et les dernières lignes horizontales (3 à 10 en fonction de la taille de la ROI) pour chaque trame, car le fond de l&#39;appareil est généralement sollicité dans les lignes de bordure. </li><li> Créer un histogramme des valeurs (également défini de niveau numérique, DL) dans les images acquises pile (en utilisant la commande &#39;hist&#39; dans Matlab) et tracer le logarithmede la fréquence résultant (en utilisant la commande semilogy dans Matlab). Un exemple de la distribution de DL caméra arrière-plan est présenté à la figure 2. REMARQUE: Si l&#39;appareil fonctionne bien, l&#39;intrigue se montrer un pic approximativement gaussienne (un profil parabolique en échelle logarithmique) représentant la distribution des valeurs associées à photon zéro suivie d&#39;une décroissance exponentielle (une droite de pente négative en échelle logarithmique ) qui représente la distribution des valeurs associées à une photon (figure 2). En particulier, le centre et la variance de la fonction gaussienne représente le décalage de la caméra et de l&#39;erreur, respectivement, tandis que la constante de décroissance exponentielle de la pièce représente une estimation de la DL attribuée par l&#39;appareil à chaque photon unique. Dans Matlab utiliser la section &quot;CalibrateCamera&quot; de l&#39;écriture dans les matériaux de support. </li><li> Répétez l&#39;opération pour tous les appareil photo sélectionnée EMGain et Gain. </li></ol></li></ol> 2. étiquetésPréparation cellulaire <ol><li> Pour préparer les liposomes de lipides nécessaires pour l&#39;incorporation 36, dissoudre séparément une mg de DOPE (1,2-sn dioleoyl- -glycéro-3-phosphoéthanolamine), 1 mg de DOTAP (1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane), et 1 mg de PPE-ATTO488 dans 1 ml de chloroforme. Mélanger 0,5 ml de solution à filer, de 0,5 ml de solution DOTAP, et 25 ul de solution PPE-ATTO488 et sèche sous vide pendant 24 h. Ajouter 0,5 ml de tampon HEPES 20 mM, vortex pendant 15 min et soniquer pendant 15 min à 40 ° C. </li><li> Pour préparer la cellule, laver 3 fois avec du PBS un plat de p100 de confluence CHO-K1 (ovaire de hamster chinois), ajouter 1 ml de trypsine et de stocker dans un incubateur pendant 5 min. Suspension de cellules individuelles d&#39;addition de 9 ml de milieu DMEM / F12 supplémenté avec 10% de FBS et ensemencer 150 ul de solution de cellules dans une boîte de Pétri contenant 800 ul du même milieu. </li><li> Conserver dans un incubateur pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Pour l&#39;incorporation des lipides, remplacez milieu cellulaire avec 500ul de milieu sans sérum; après 30 minutes, ajouter 2 ul de solution de liposomes; après 15 minutes de lavage avec PSB et ajouter un nouveau milieu DMEM / F12 pour l&#39;imagerie. </li><li> Pour la transfection, les cellules transfecter selon le protocole Lipofectamine (instructions du fabricant) à l&#39;aide TfR-GFP plasmide et magasin de 24 heures dans l&#39;incubateur avant l&#39;imagerie. </li></ol> 3 Acquisition de données <ol><li> préparation de l&#39;installation <ol><li> Afin de thermostat microscope, 24 heures avant l&#39;expérience allumer l&#39;incubateur. </li><li> Pour appliquer l&#39;heure d&#39;acquisition le plus rapide possible, le travail en mode capteur recadrée (voir introduction) et utiliser un premier appareil d&#39;imagerie (appareil photo 1) et deuxième caméra pour sélectionner la cellule (l&#39;appareil photo 2). Un schéma de la configuration d&#39;installation est présentée dans la figure complémentaire S1. Ensuite, pour aligner le tour de deux caméras sur le microscope et attendre que les caméras se refroidir. </li><li> Situé sur les deux appareils les paramètres pour l&#39;imagerie lumière transmise (c.-à- </em&gt; 20 ms pour le temps d&#39;exposition, 1 pour EM Gain) et mettre le microscope en mode fond clair. </li><li> Mettre les échantillons dans le support et mise au point avec l&#39;oculaire, envoyer la lumière à la caméra 1 et poussez doucement les fentes permettant la lumière que sur le retour sur investissement utilisés pour l&#39;imagerie cellulaire (ici un retour sur investissement de 32 x 32 pixels). </li><li> Déplacer une cellule dans la région sélectionnée et envoyer la lumière à la caméra 2, puis dessinez un retour sur investissement dans le logiciel Camera Control 2 afin d&#39;avoir une référence. </li></ol></li><li> Imaging (figure 3A) <ol><li> Tout d&#39;abord, aligner le laser de la FRBR selon la procédure de votre configuration. Dans notre configuration, sélectionnez le &#39;setup FRBR »et lancez la procédure d&#39;alignement automatique. Lorsque le laser est aligné mis 70 nm de profondeur de pénétration (environ 70 °). </li><li> Réglez le temps d&#39;exposition à 70 ms et EMGain à 100 à la fois sur les caméras 1 et 2; Ensuite, sélectionnez une cellule en utilisant la caméra 1, puis envoyer la lumière sur la caméra 2 et mise au point précise de la membrane cellulaire. Réglez l&#39;exposition minimale sur camera 2, 1000 EMGain, mode du capteur courte, 10 5 répétitions et définir l&#39;enregistrement automatique comme les fichiers FITS (Flexible Image Transport System, un format qui peut être facilement géré). </li><li> Lancer l&#39;acquisition d&#39;enregistrer la série d&#39;images. Relâchez le gain et le mode recadrée pour permettre la stabilisation de la température avant d&#39;acquérir une nouvelle cellule, puis répétez les deux dernières étapes pour acquérir 8-10 cellules. </li></ol></li></ol> 4 Calcul du déplacement quadratique moyen de l&#39;imagerie (i MSD) NOTE: Le protocole suivant peut être appliqué directement aux données brutes. Dans le même temps, l&#39;ensemble du protocole est valide pour l&#39;acquisition de données simulées à la fois dans Matlab et dans SimFCS. Le lien vers les tutoriels correspondant peut être trouvé dans la section &quot;Matériaux de. <ol><li> Calcul par Matlab <ol><li> Importez la série acquise à Matlab en utilisant un script de ImportImageSeries. Calculer l&#39;intensité moyenne de chaque image dans le temps en utilisant la command moyenne sur les deux premières dimensions et utiliser parcelle pour voir le vecteur résultant. </li><li> Si plus de 10% de photoblanchiment est présent, jeter la série ou supprimer la première partie d&#39;entre eux. Si elle est inférieure, essayer de corriger l&#39;effet sur ​​la fonction de corrélation en soustrayant à chaque image son intensité moyenne, comme le montre avant 37. </li><li> Calculer l&#39;intensité moyenne de chaque pixel en utilisant le moyen pour la troisième dimension et de voir l&#39;image résultante. Remarque: Une attention particulière est nécessaire afin d&#39;éviter des corrélations artefacts. En fait, comme le montre déjà des techniques semblables 38, les bordures de cellules ainsi que sur des vésicules de discussion pourrait introduire une forte corrélation. Si l&#39;inspection de l&#39;image moyenne révèle les bordures de cellules ou de vésicules de discussion, essayer d&#39;exclure la région participait pas jeter l&#39;acquisition. Pour corriger l&#39;effet de cette structures immobiles soustraire l&#39;intensité temporelle moyenne de chaque pixel 39. </li><li> Calculer til corrélation spatio-temporelle (G (ξ, χ, τ)) en utilisant la fonction CalculateSTICScorrfunc. Retirer G (ξ, χ, 0), car la corrélation à cause du bruit de coup de feu en régime de faible lumière domine G (0,0,0); la corrélation en raison de la détection domine le G (± 1,0,0), et le mouvement des particules au cours de la durée d&#39;exposition peut se déformer G (ξ, χ, τ) pour τ = 0 en augmentant la taille mesurée (cet effet disparaît pour τ &gt; 0) 34. </li><li> Moyenne G (ξ, χ, τ&gt; 0) en utilisant un temps-bin logarithmique pour réduire le bruit en utilisant la fonction &quot;LogBinStack&quot; dans le soutien matériel et puis poser le G résultant (ξ, χ, τ) en utilisant la fonction &quot;gaussfit&quot; de les outils ICS-Matlab dans les matériaux à récupérer le i MSD (la deuxième colonne du tableau qui en résulte). </li><li> Tracer la σ obtenu de la taille (de τ) 2 (i MSD) en fonction du temps. Si les données sont trop bruyants, essayez d&#39;augmenter le nombre de acquLes cadres IRED, augmenter la puissance du laser, en moyenne, plus G (ξ, χ, τ) en même temps. </li></ol></li><li> Calcul par SimFCS <ol><li> Ouvrez les fichiers acquis avec ImageJ utilisant BIOFORMAT importateur plugin et sauver série acquis que la séquence Tiff. </li><li> Ouvrir outil SimFCS et sélectionnez la RICS et sélectionnez Fichier&gt; Importer des images multiples (supplémentaire Figure S2). </li><li> Sélectionnez Fit, insérer les paramètres d&#39;acquisition correctes et fermer la fenêtre en forme (supplémentaire Figure S3). </li><li> Sélectionnez Affichage&gt; Intensité Moyenne&gt; CH1 et vérifier la présence de photoblanchiment (complémentaire figure S4). </li><li> Si plus de 10% de photoblanchiment est présent jeter la série ou si il est possible charge à nouveau la séquence d&#39;images de retirer la première partie de la série. </li><li> Si le blanchiment est inférieur à 10% sélectionnez Outils&gt; i MSD&gt; Paramétrer, vérifie &#39;utilisation moyenne mobile », situé dans le panneau de ROI sur la gauche uneombre de cadre à l&#39;attention payer moyenne mobile que le temps correspondant est plus élevé que le temps caractéristique de diffusion (pour particules se déplaçant à 1 pm 2 sec -1 un temps de 10 sec est une bonne moyenne mobile) </li><li> Sélectionnez Outils&gt; DSGI&gt; Calculer i MSD (figure complémentaire S5) et en forme et exporter le i MSD de la bloc-notes (Figure supplémentaire S6). </li></ol></li></ol> 5 Calcul de la loi Diffusion de la i MSD <ol><li> Montez les quelques premiers points d&#39;extrapoler l&#39;interception (σ 0 2) (5 points sont généralement suffisant, mais plusieurs points peuvent être installés s&#39;ils présentent un comportement linéaire) et de comparer cette valeur avec le PSF mesurée précédemment 2. Si elles sont comparables, la dynamique des fluorophores isolés sont respectées. En revanche, si σ 0 2 2 &gt;&gt; PSF tenter d&#39;acquérir plus rapidement pour s&#39;assurer quedynamique pas cachés sont présents 34. </li><li> Calculer la diffusivité apparente (app D) et le déplacement moyen (R) en utilisant les équations 3 et 4 (voir Introduction). </li><li> Terrain application en fonction de R pour obtenir un droit de diffusion comparable à ce qui est mesuré avec une tache variation en fonction FCS 12 (figure 3D) D. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Suivi de particules unique (SPT) représente l&#39;une des stratégies les plus courantes pour étudier la dynamique moléculaire et il a le grand avantage de mesurer les trajectoires des particules. Cela permet à son tour le comportement de palpage de même quelques particules marquées dans un système complexe. Toutefois, pour atteindre cet avantage SPT a généralement besoin d&#39;une faible densité de la sonde et des étiquettes très brillantes. En particulier, pour obtenir haute résolution temporelle (plage de microseconde...

À partir du modèle original "de la mosaïque fluide» par Singer et Nicolson, l'image de la membrane plasmique cellulaire a été continuellement mis à jour au cours des dernières décennies afin d'inclure le nouveau rôle de cytosquelette et de lipides domaines 1,2. Les premières observations ont été obtenues par récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) dévoilement qu'une fraction significative des protéines de la membrane est immobile 5.3. Ces études pionnières, bien que très instructif, ont souffert de la résolution relativement faible dans l'espace (microns) et de temps (en secondes) de configurations du PAF. En outre, étant une mesure de la moyenne d'ensemble, FRAP manque en donnant des informations sur le comportement de la molécule unique. Dans ce contexte, la possibilité d'étiqueter spécifiquement une molécule unique avec des balises très claires (permettant l'étude du processus de diffusion d'une molécule à la fois) a été très réussie. En particulier, en poussant l'résolution temporelle de l'approche unique de suivi de particules (SPT) à l'échelle de temps de microsecondes, Kusumi, et al. pu accéder aux fonctions inconnues de lipides et de protéines dynamique qui a grandement contribué à la reconnaissance du rôle de base de l'actine-membrane squelette dans la membrane physiologie 6 , 7. Ces résultats ont généré le soi-disant le «piquetage et de clôture» modèle, dans lequel lipides et des protéines diffusion est régie par squelette d'actine. Toutefois, afin d'avoir accès à l'énorme quantité d'informations fournies par SPT nombreuses questions expérimentales doivent être pris en compte. En particulier, la procédure de marquage est typiquement constituée par de nombreuses étapes telles que la production, la purification et l'introduction de l'espèce marquée dans le système. En outre, de grandes étiquettes, comme des boîtes quantiques ou des nanoparticules métalliques, sont souvent nécessaires pour parvenir à l'échelle de temps inférieure à la milliseconde et de la réticulation des molécules cibles par l'étiquette ne peut être évitée dans la plupart des cas. Enfin, de nombreuses trajectoiresdoivent être enregistrés pour s'adapter à des critères statistiques et de façon concomitante une faible densité de l'étiquette est nécessaire pour permettre le suivi. Par rapport à SPT, la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), surmonter un grand nombre de ces inconvénients, représente une approche très prometteuse pour étudier la dynamique moléculaire. En fait, FCS fonctionne bien également avec des étiquettes sombres et denses, ce qui permet d'étudier la dynamique des molécules de protéines étiquetées fluorescentes dans les cellules transfectées de façon transitoire. En outre, il permet d'atteindre des statistiques élevées dans un laps de temps limité. Enfin, malgré la densité «élevé» d'étiquettes FCS fournit des informations sur les molécules simples. Merci à toutes ces propriétés, FCS représente une approche très simple et a été largement appliquées à l'étude de lipides et de protéines dynamique à la fois dans des membranes modèles et dans les cellules vivantes 8-10. De nombreuses approches différentes ont été proposées pour augmenter la capacité de FCS pour révéler les détails de la diffusion moléculaire. Par exemple, il est shpropre que par l'exécution FCS sur les zones d'observation de taille différente, on peut définir un "droit de diffusion FCS" caractéristiques éclairantes cachés de mouvement moléculaire 11,12. En plus d'être varié en taille, le domaine d'intervention a également été dupliqué 13, déplacé dans l'espace le long des lignes 14-20 ou conjugués avec des caméras rapides 21,22. L'utilisation de ces corrélation «spatio-temporelle» les approches, les paramètres biologiques pertinents de plusieurs composants membranaires ont été décrits quantitativement sur les deux membranes modèles et les systèmes biologiques réels, ainsi aperçu rendement dans la membrane organisation spatiale. Cependant, dans tous les FRAP et applications FCS décrit jusqu'à présent la taille de la zone de convergence représente une limite de la résolution spatiale qui ne peut être surmontée. Plusieurs méthodes d'imagerie de super-résolution ont été développés récemment pour contourner cette limite. Certains sont basés sur la précision de localisation, telles que la microscopie optique de reconstruction stochastique (STORM) &lt;sup&gt; 23,24, microscopie photo-activation de la localisation (PALM) 25, fluorescence PALM (FPALM) 26, et une particule suivi PALM (sptPALM) 27: la quantité relativement importante de photons nécessaires à chaque cliché, cependant, limite la résolution temporelle de ces méthodes à au moins quelques millisecondes, ce qui entrave leur applicabilité in vivo. En revanche, une alternative prometteuse pour l'imagerie de super résolution ont été ouverts en modulant spatialement l'émission de fluorescence avec des procédés d'épuisement émission stimulés (STED ou transitions réversibles saturables optique de fluorescence (RESOLFT) 28,29). Ces approches se combinent la mise en forme du volume d'observation et au-dessous de la limite de diffraction, avec la possibilité d'utiliser des microscopes à balayage rapide et des systèmes de détection. En combinaison avec l'analyse de fluctuation de fluorescence, la microscopie STED a permis de sonder directement les dynamiques spatio-temporelles à l'échelle nanométrique de lipides et de proteins dans les membranes des cellules vivantes 30,31. Les mêmes quantités physiques de base de la microscopie STED peuvent être obtenus par une spectroscopie de corrélation de l'image spatio-temporel modifié (TIQUES 32,33) procédé qui est approprié pour l'étude de la dynamique des protéines marquées par fluorescence de membrane et / ou des lipides dans les cellules vivantes et par un microscope commercial. Le protocole expérimental présenté ici se compose de quelques étapes. La première nécessite une imagerie rapide de la région d'intérêt sur la membrane. Ensuite, la pile résultante d'images est utilisée pour calculer les fonctions de corrélation spatio-temporelle moyenne. En adaptant la série de fonctions de corrélation, la «loi de diffusion» moléculaire peut être obtenu directement à partir de l'imagerie sous la forme d'une diffusivité apparente (D app) - vs tracé du déplacement -Moyenne. Cette parcelle est fortement tributaire de l'environnement exploré par les molécules et permet de reconnaître directement les modes de diffusion réelsdu lipide / protéine d'intérêt. Dans plus de détails, comme indiqué précédemment 34, la fonction d'auto-corrélation spatio-temporelle de la série d'images acquises dépend essentiellement de la dynamique des molécules en mouvement dans la série d'images recueillies (s'il vous plaît noter que le même raisonnement peut être appliqué à l'acquisition d'une ligne où seulement une dimension dans l'espace est pris en compte). En particulier, nous définissons la fonction de corrélation: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230"> (1) où <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50"> représente l'intensité de fluorescence mesurée à la position x, y et à l'instant t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8"> et <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> représente la distance dans le plan x etdirections y respectivement, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> représente le décalage dans le temps, et <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20"> représente la moyenne. Cette fonction peut être exprimée comme suit: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230"> (2) où «N» représente le nombre moyen de molécules dans la zone d'observation, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10"> représente l'opération de convolution dans l'espace, et <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50"> représente l'auto-corrélation de la taille instrumentale. Ce dernier peut être interprété comme une mesure de la façon dont les photons d'un seul émetteur sont répartis dans l'espace en raison de la configuration optique / enregistrement (ce qu'on appelle le Point Spread Function, PSF, gèneRALLYE bien approchée par une fonction gaussienne). Enfin, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50"> représente la probabilité de trouver une particule à une distance <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10"> et <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> après un temps de retard <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> . Si l'on considère une dynamique de diffusion, dans laquelle les particules se déplacent au hasard dans toutes les directions et les flux nets ne sont pas présents, cette fonction est également bien approchée par une fonction gaussienne où la variance peut être identifié comme le déplacement quadratique moyen (MSD) de la particule en mouvement . Ainsi, la taille de la fonction de corrélation (également désigné en tant que <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30"> ), Peut être définie comme la somme des TMS de particules et la taille instrumental et peut être mesurée par un ajustement gaussiention de la fonction de corrélation pour chaque temps de retard. Le TMS i mesurée peut être utilisée pour calculer une diffusivité apparente des molécules qui se déplacent <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40"> et un moyen de déplacement <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40"> en tant que: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170"> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170"> (4) Quelques considérations sur le dispositif expérimental utilisé peut guider le lecteur à travers les sections suivantes. Pour exciter sélectivement les fluorophores sur la membrane basale des cellules, nous allons utiliser un éclairage réflexion totale interne (TIR) ​​vivant, en utilisant une fluorescence TIR commerciale (FRBR) microscope (détails peuvent être trouvés dans la section matériel). En outre, afin de recueillir èmee fluorescence, nous allons utiliser un objectif de grossissement (100X NA 1,47, ouverture numérique élevée est nécessaire pour la FRBR éclairage) et une caméra EMCCD (taille physique du pixel sur la puce um 16). Pour atteindre une taille de pixel de 100 nm, nous appliquons une lentille de grossissement supplémentaire de 1.6X. Comme nous le verrons, une résolution temporelle inférieure à 1 ms serait nécessaire pour décrire correctement la dynamique des lipides membranaires rapides en dessous de 100 nm. Afin d'atteindre cette résolution temporelle nous devons sélectionner une région d'intérêt (ROI) plus petit que l'ensemble puce de l'appareil photo (512 x 512). De cette façon, la caméra va lire un nombre réduit de lignes de plus en plus la résolution temporelle. Toutefois, dans ce régime de lecture du temps de trame serait limitée par le temps nécessaire pour transférer les charges de l'exposition à la puce de lecture sur l'appareil et est généralement de l'ordre de 512 millisecondes pour x 512 pixels EMCCD. Pour battre cette limite, une technologie émergente permet le déplacement des ROI lignes seulement au lieu de toute la trame, wvec une réduction effective pratique de la taille de la puce exposée (appelé mode du capteur recadrée dans notre EMCCD). Pour cette configuration, pour être efficace, la puce à l'extérieur de la région d'intérêt doit être couverte par un couple de fentes montées dans le chemin optique. Merci pour cette configuration une résolution de temps d'arrêt à 10 -4 secondes peut être obtenue. S'il vous plaît noter, cependant, que cette approche peut être couplé avec différents montages expérimentaux, comme expliqué dans la section «discussion». Démonstration de la méthode sera fourni dans les cellules vivantes, en utilisant à la fois un ATTO488 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn--glycéro 3-phosphoéthanolamine (ATTO488-EPI) et un variant de la GFP-marqué de récepteur de la transferrine (GFP TfR). Dans le cas de ATTO488 EPI cette approche peut réussir à récupérer une application presque constante de D en fonction de déplacement moyenne indiquant une diffusion pour la plupart gratuites, comme indiqué précédemment 30,35. En revanche, l'ISF-GFP montre une diminution D 6. En outre, dans ce dernier cas, il est possible de quantifier la constante de diffusion locale et la région de confinement moyenne sur plusieurs microns sur le plan de la membrane.

<table><tbody><tr><td>iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Solis</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488 labellisé PPE</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-151</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>850725</tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>100x Pénicilline-Streptomycine-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-106&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>SimFCS 3.0</td><td>Globals Software</td><td></td><td>le logiciel peut être téléchargé ici :</td></tr> <tr><td>http://www.lfd.uci.edu/globals/ DMI6000 avec module TIRF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Lipofectamine</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>C-terminal GFP étiqueté Récepteur de la tranferrine</td><td>OriGene</td><td>RG200980</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>528730</td><td></td></tr><tr><td>Perles de latex, jaune-vert fluorescent, 30 nm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5155</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeurs à ultrasons SONICA</td><td>SOLTEC</td><td>ETH S3</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Importateur Bio-Format pour Matlab</td><td></td><td></td><td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td></tr> <tr><td>ICS-MatLab Tools</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td></tr><tr><td>Tutoriel Simulation par Matlab https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tutoriel</td><td></td><td></td> <td>Simulation par SimFCShttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td></tr></tbody></table>

de fluorescence imaging rapide à moléculaire loi diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Il est devenu de plus en plus évident que la distribution spatiale et le mouvement des composants de la membrane comme les lipides et les protéines sont des facteurs clés dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires. Toutefois, en raison de la dynamique rapide et les petites structures impliquées, une résolution spatio-temporelle très élevée est nécessaire pour rattraper le comportement réel de molécules. Ici, nous présentons le protocole expérimental pour l&#39;étude de la dynamique des protéines et des lipides du plasma membrane marquées par fluorescence dans des cellules vivantes avec une résolution spatio-temporelle élevée. En particulier, cette approche n&#39;a pas besoin de suivre chaque molécule, mais il calcule le comportement de la population en utilisant les molécules d&#39;une région donnée de la membrane. Le point de départ est une imagerie rapide d&#39;une région donnée sur la membrane. Ensuite, une fonction spatio-temporelle complète autocorrélation est calculée en corrélation des images acquises à l&#39;augmentation des retards de temps, par exemple tous les 2, 3, n répétitions. Il est possible de démontrer que la largeurdu pic de la fonction d&#39;autocorrélation spatiale augmente en augmentant le temps de retard en fonction du mouvement des particules par diffusion. Par conséquent, le montage de la série de fonctions d&#39;auto-corrélation permet d&#39;extraire la protéine réelle signifie déplacement quadratique de l&#39;imagerie (DSGI), présenté ici sous la forme de la diffusivité apparente vs déplacement moyen. Cela donne une vision quantitative de la dynamique moyenne des molécules simples avec une précision nanométrique. En utilisant une variante de la GFP étiqueté du récepteur de la transferrine (TfR) et un ATTO488 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn -glycéro-3-phosphoéthanolamine (PPE), il est possible d&#39;observer la régulation spatio-temporelle des protéines et des lipides diffusion sur régions membranaires um de taille dans la gamme micro-à-milli-seconde fois.

Afin de calibrer la taille instrumental, l'image d'un seul nano-billes fluorescentes peut être mesurée comme décrit dans le protocole de l'étape 1.1. Une image de fluorescence typique de ces billes est présenté sur la figure 1. L'installation de distribution d'intensité d'une fonction gaussienne 2D redonne bonne résidus et permet de mesurer la taille instrumental à 270 nm. Cette valeur est en bon accord avec la limite de diffraction attendue estimée par l'équation de Rayleigh. Cet étalonnage n'est pas n...

La distribution spatiale et la dynamique temporelle des protéines et des lipides de la membrane plasmique sont un sujet brûlant en biologie. Ici, cette question est abordée par une analyse de fluctuation d’image spatio-temporelle qui fournit conceptuellement les mêmes quantités physiques de suivi de particules uniques, mais elle utilise de petits marqueurs moléculaires et des configurations de microscopie standard.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Pour ce faire, l’objectif global de cette procédure est de mesurer la loi de diffusion des lipides et des protéines dans les membranes cellulaires vivantes. Tout d’abord, la fonction d’étalement du point du microscope est calibrée par l’imagerie de billes fluorescentes nanoscopiques. Ensuite, des vecteurs à base de liposomes, y compris une molécule d’intérêt marquée par fluorescence, sont préparés et introduits dans des cellules vivantes soit par transfection, soit par incorporation directe.L’imagerie rapide de la membrane plasmique des cellules vivantes est réalisée par microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. Enfin, la fonction de corrélation est calculée et la loi de diffusion moléculaire est extraite par ajustement gaussien. Les données résultantes.Identifier le mode de mouvement du lipide ou de la protéine étudié. Le principal avantage de cette technique par rapport à l’approche conventionnelle de récupération de fluorescence après photoblanchiment ou à la spectroscopie classique de corrélation de fluorescence en un seul point est qu’elle permet de mesurer la loi de diffusion moléculaire. Nous connaissons une connaissance prioritaire du système.Également contraire aux méthodologies classiques de suivi des particules uniques. Ici, le déplacement moléculaire est mesuré sans qu’il soit nécessaire d’extraire les trajectoires des particules. Par conséquent, ce métal peut être facilement utilisé en combinaison avec des molécules relativement réputées et denses comme, par exemple, des protéines fluorescentes génétiquement codées.Dans l’ensemble, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire cellulaire, telles que comment le mouvement des protéines ou des lipides régule-t-il la structure de la membrane plasmique et l’organisation fonctionnelle La réponse à ces questions et à d’autres questions connexes sera mise à la disposition de tous et en utilisant simplement un microscope commercial, la démonstration de la procédure globale sera effectuée par zo, un doctorant du laboratoire. Commencez ce protocole en calibrant la fonction d’étalement des points du système d’imagerie. Commencez par diluer 10 microlitres d’une solution de billes fluorescentes dans 90 microlitres d’eau distillée préalablement ajoutée à un tube à centrifuger de 500 microlitres.Soniquez la solution pendant 20 minutes dans un sauna à l’aide d’un scalpel, coupez un morceau carré d’un centimètre carré de gel de rose 3 % AGA et placez-le dans une boîte de Pétri. Déposez 10 microlitres de la solution de billes fluorescentes diluées sur le dessus du gel. Ensuite, à l’aide d’une pince, retournez le morceau de gel dans une boîte de Pétri en verre de deux centimètres.Encore une fois, à l’aide de forceps. Appuyez sur le morceau de gel pour disperser la goutte. Ensuite, activez la configuration d’acquisition, qui consiste en un microscope à fluorescence à réflexion interne totale.Equipé d’un incubateur et d’une caméra E-M-C-C-D rapide connectée à un ordinateur exécutant une suite d’applications, un logiciel fluorescent avancé et/ou un logiciel d’acquisition d’images Solis. Placez l’échantillon dans le support sur la platine du microscope à l’aide de la pièce I et de la lumière transmise. Concentrez-vous sur le bord du gel.Ensuite, centrez le gel sur l’objectif et ajustez la mise au point pour démarrer la procédure d’alignement laser dans la suite d’applications Leica, le logiciel fluorescent avancé sélectionne l’alignement automatique et suit la procédure d’alignement automatique. Une fois que le laser a été aligné dans le logiciel d’acquisition et/ou Solis, cliquez sur le bouton des paramètres. Une fenêtre s’ouvrira.Réglez l’exposition de l’appareil photo sur 100 millisecondes, l’EM gagné sur 1000, la répétition sur 100 et cochez la case Transfert d’image. Cliquez ensuite sur la fenêtre d’enregistrement automatique et insérez le nom de l’expérience. Trouvez un champ de vision avec des points uniques isolés.Concentrez-vous sur un point lumineux, qui représente généralement un agrégat de billes. Acquérez ensuite 100 cadres. Répétez cette étape cinq à six fois pour obtenir des images de plusieurs points uniques.Importez les séries acquises dans un programme de traitement de données tel que MATLAB et faites la moyenne de la pile dans le temps. Affichez ensuite l’image de l’intensité moyenne mesurée. Zoomez sur un petit point fluorescent brillant et identifiez grossièrement le centre comme le pixel le plus brillant du spot.Enfin, sélectionnez la taille de la région d’intérêt que vous souhaitez dessiner autour de la particule, généralement un micron à côté pour ajuster la distribution d’intensité sélectionnée avec une fonction gaussienne. Sélectionnez la commande gause fit. Inspectez les résidus obtenus pour vérifier la qualité de l’ajustement.Enfin, calibrez l’appareil photo comme décrit dans le document d’accompagnement. Une fois le système calibré, il est temps d’étiqueter les cellules pour l’acquisition d’images. Commencez à préparer les liposomes nécessaires à l’incorporation des lipides en dissolvant un milligramme de DOPE, un milligramme de D-O-T-A-P et un milligramme de PPE ADO 4 88 chacun dans un microtube de centrifugation séparé contenant un millilitre de chloroforme.Ensuite, combinez 0,5 millilitre chacune des solutions DOPE et D-O-T-A-P avec 25 microlitres de solution PPE ATO 4 88. Mettez le tube dans un évaporateur centrifuge et lancez l’essorage à 280 g. Démarrez la pompe à vide et laissez-la tourner pendant 24 heures.Le lendemain, ajoutez 0,5 millilitre de tampon HEIS de 20 millimolaires dans le tube et agitez-le pendant 15 minutes. Placez ensuite le tube dans un bain sonique et sonifiez pendant 15 minutes à 40 degrés Celsius. Pour préparer les cellules, lavez trois fois avec 10 millilitres de PBS un plat de 100 cellules de hamster chinois confluent ou CHOK.Ajoutez ensuite un millilitre de trypsine et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajoutez neuf millilitres de D-M-E-M-F 12 complété par 10 % de FBS pour suspendre les cellules et ensemencer 150 microlitres de cette solution contenant des cellules. Dans une boîte de Pétri à fond de verre de 22 millimètres contenant 800 microlitres du même milieu.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour l’incorporation de lipides, remplacez le milieu cellulaire par 500 microlitres de milieu exempt de sérum et incubez pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez deux microlitres de solution de liposomes et incubez pendant encore 15 minutes.Lavez ensuite les cellules avec du PBS et ajoutez un nouveau DM EMF 12. Avant d’obtenir l’imagerie au moins 12 heures avant l’expérience, allumez l’incubateur du microscope pour amener la platine du microscope et les composants optiques à la température expérimentale. L’étape la plus difficile de cette procédure est l’acquisition.Afin d’assurer le succès, assurez-vous d’optimiser chaque paramètre d’acquisition du système. À l’étude. Le jour de l’expérience, allumez le microscope, attendez que les caméras atteignent la température de fonctionnement.Pour réaliser l’expérience, nous utiliserons deux caméras. La première caméra sera utilisée pour l’imagerie et la deuxième caméra sera utilisée pour sélectionner la cellule. Cette configuration permettra d’obtenir le temps d’acquisition le plus rapide possible dans le logiciel.Pour définir les paramètres d’imagerie en lumière transmise. Entrez 20 millisecondes Pour le temps d’exposition, entrez un pour le gain EM pour les deux caméras. Ouvrez ensuite la fenêtre du mode de contraste dans le logiciel et laissez tomber.Cliquez sur BF pour sélectionner l’option de fond clair. Placez les échantillons dans le support tout en regardant l’échantillon à travers les oculaires. Mettez l’échantillon au point.Ensuite, envoyez manuellement la lumière à la caméra et poussez doucement les fentes pour que seule la valeur d’intérêt à imager soit éclairée. Ensuite, déplacez une cellule dans la région sélectionnée et, à l’aide du logiciel, envoyez la lumière à la deuxième caméra. Ensuite, dans le logiciel, dessinez un ROI pour générer une référence.Tout d’abord, pour aligner le laser à l’aide d’un logiciel, sélectionnez l’alignement automatique. Ensuite, pour démarrer la procédure d’alignement automatique, sélectionnez activer le collimateur. Ouvrez ensuite l’incubateur sur le dessus et collimatez le faisceau laser.Lorsque le laser est aligné dans le coin inférieur gauche de la fenêtre du logiciel à gauche, cliquez sur le bouton 70 pour régler la profondeur de pénétration à 70 nanomètres. Cela correspondra à un angle d’incidence du laser sur le verre inférieur d’environ 70 degrés dans la suite d’applications Leica. Boîte de texte du temps d’exposition du logiciel fluorescent avancé.Entrez 70 millisecondes dans la zone de texte Gain EM. Entrez 1000 pour faire de même sur la deuxième caméra. Ouvrez la fenêtre des paramètres et entrez les mêmes numéros dans les zones de texte correspondantes.Cliquez ensuite sur le bouton en direct. La fluorescence sera envoyée à la première caméra, et une image de l’échantillon apparaîtra à l’écran. Déplacez l’échantillon jusqu’à ce qu’une cellule fluorescente atteigne la région de référence d’intérêt.Appuyez ensuite sur le bouton situé à l’avant du corps du microscope pour envoyer la lumière à la caméra deux et déplacez la molette de position Z avec précision pour faire la mise au point sur la membrane cellulaire dans le logiciel et/ou unique. Ouvrez la fenêtre des paramètres et réglez le temps d’exposition minimum réalisable 1000 EM gain recadré du capteur mode 10 sur la cinquième répétition, puis réglez l’option d’enregistrement automatique pour commencer à acquérir la série d’images. Cliquez sur l’icône de l’appareil photo du logiciel et attendez la fin de l’acquisition.Ouvrez ensuite la fenêtre des paramètres, désactivez le gain EM et décochez l’option du mode recadré. Lors de l’acquisition, la température de l’appareil photo augmente généralement d’environ deux à trois degrés. Ainsi, avant d’acquérir des images d’une nouvelle cellule, attendez que la température de travail optimale soit atteinte.Encore une fois, une fois l’imagerie terminée, suivez les instructions du document d’accompagnement pour calculer le déplacement carré moyen à partir de l’imagerie afin d’obtenir une variante marquée par fluorescence de la molécule d’intérêt. Les cellules CHOK one ont été soit marquées avec ADO 4 88 PPE, soit transfectées avec un transfert dans le récepteur ou T-F-R-G-F-P et imagées par TIRF comme décrit dans cette vidéo. Comme on peut le voir ici, la loi de diffusion mesurée pour ADO 4 88 PPE est plate, indiquant une diffusion principalement libre comme précédemment montré par la fluorescence à appauvrissement par émission stimulée, la spectroscopie de corrélation ou les mesures FCS stead après transfection avec le T-F-R-G-F-P, la loi de diffusion mesurée pour T-F-R-G-F-P est initialement plate restant en dessous de 100 nanomètres de déplacement moléculaire moyen avec un coefficient de diffusion apparent moyen d’environ 0,7 micron carré par seconde.Ceci est suivi d’une diminution rapide de la diffusivité apparente jusqu’à 0,2 micron carré par seconde. La valeur généralement mesurée par la FCS limitée par la diffraction. Il est intéressant de noter que, comme le montre ce dernier exemple, la présente approche permet de mesurer facilement le déplacement moléculaire moyen avec une résolution de quelques dizaines de nanomètres, même en utilisant des marqueurs relativement faibles et denses tels que GFP.De plus, l’échelle spatiale à laquelle le coefficient de diffusion apparent commence à diminuer fixe la taille caractéristique du confinement partiel des protéines par le squelette membranaire à environ 120 nanomètres, conformément aux estimations précédentes. Une fois maîtrisé, la procédure d’analyse des données et cette acquisition peuvent être réalisées en quelques minutes. Nous pensons que cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire et moléculaire pour explorer facilement et quantitativement la régulation spatio-temporelle de la diffusion des protéines et des lipides dans les échantillons de vie.

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