De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

Pour ce faire, l’objectif global de cette procédure est de mesurer la loi de diffusion des lipides et des protéines dans les membranes cellulaires vivantes. Tout d’abord, la fonction d’étalement du point du microscope est calibrée par l’imagerie de billes fluorescentes nanoscopiques. Ensuite, des vecteurs à base de liposomes, y compris une molécule d’intérêt marquée par fluorescence, sont préparés et introduits dans des cellules vivantes soit par transfection, soit par incorporation directe.

L’imagerie rapide de la membrane plasmique des cellules vivantes est réalisée par microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. Enfin, la fonction de corrélation est calculée et la loi de diffusion moléculaire est extraite par ajustement gaussien. Les données résultantes.

Identifier le mode de mouvement du lipide ou de la protéine étudié. Le principal avantage de cette technique par rapport à l’approche conventionnelle de récupération de fluorescence après photoblanchiment ou à la spectroscopie classique de corrélation de fluorescence en un seul point est qu’elle permet de mesurer la loi de diffusion moléculaire. Nous connaissons une connaissance prioritaire du système.

Également contraire aux méthodologies classiques de suivi des particules uniques. Ici, le déplacement moléculaire est mesuré sans qu’il soit nécessaire d’extraire les trajectoires des particules. Par conséquent, ce métal peut être facilement utilisé en combinaison avec des molécules relativement réputées et denses comme, par exemple, des protéines fluorescentes génétiquement codées.

Dans l’ensemble, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire cellulaire, telles que comment le mouvement des protéines ou des lipides régule-t-il la structure de la membrane plasmique et l’organisation fonctionnelle La réponse à ces questions et à d’autres questions connexes sera mise à la disposition de tous et en utilisant simplement un microscope commercial, la démonstration de la procédure globale sera effectuée par zo, un doctorant du laboratoire. Commencez ce protocole en calibrant la fonction d’étalement des points du système d’imagerie. Commencez par diluer 10 microlitres d’une solution de billes fluorescentes dans 90 microlitres d’eau distillée préalablement ajoutée à un tube à centrifuger de 500 microlitres.

Soniquez la solution pendant 20 minutes dans un sauna à l’aide d’un scalpel, coupez un morceau carré d’un centimètre carré de gel de rose 3 % AGA et placez-le dans une boîte de Pétri. Déposez 10 microlitres de la solution de billes fluorescentes diluées sur le dessus du gel. Ensuite, à l’aide d’une pince, retournez le morceau de gel dans une boîte de Pétri en verre de deux centimètres.

Encore une fois, à l’aide de forceps. Appuyez sur le morceau de gel pour disperser la goutte. Ensuite, activez la configuration d’acquisition, qui consiste en un microscope à fluorescence à réflexion interne totale.

Equipé d’un incubateur et d’une caméra E-M-C-C-D rapide connectée à un ordinateur exécutant une suite d’applications, un logiciel fluorescent avancé et/ou un logiciel d’acquisition d’images Solis. Placez l’échantillon dans le support sur la platine du microscope à l’aide de la pièce I et de la lumière transmise. Concentrez-vous sur le bord du gel.

Ensuite, centrez le gel sur l’objectif et ajustez la mise au point pour démarrer la procédure d’alignement laser dans la suite d’applications Leica, le logiciel fluorescent avancé sélectionne l’alignement automatique et suit la procédure d’alignement automatique. Une fois que le laser a été aligné dans le logiciel d’acquisition et/ou Solis, cliquez sur le bouton des paramètres. Une fenêtre s’ouvrira.

Réglez l’exposition de l’appareil photo sur 100 millisecondes, l’EM gagné sur 1000, la répétition sur 100 et cochez la case Transfert d’image. Cliquez ensuite sur la fenêtre d’enregistrement automatique et insérez le nom de l’expérience. Trouvez un champ de vision avec des points uniques isolés.

Concentrez-vous sur un point lumineux, qui représente généralement un agrégat de billes. Acquérez ensuite 100 cadres. Répétez cette étape cinq à six fois pour obtenir des images de plusieurs points uniques.

Importez les séries acquises dans un programme de traitement de données tel que MATLAB et faites la moyenne de la pile dans le temps. Affichez ensuite l’image de l’intensité moyenne mesurée. Zoomez sur un petit point fluorescent brillant et identifiez grossièrement le centre comme le pixel le plus brillant du spot.

Enfin, sélectionnez la taille de la région d’intérêt que vous souhaitez dessiner autour de la particule, généralement un micron à côté pour ajuster la distribution d’intensité sélectionnée avec une fonction gaussienne. Sélectionnez la commande gause fit. Inspectez les résidus obtenus pour vérifier la qualité de l’ajustement.

Enfin, calibrez l’appareil photo comme décrit dans le document d’accompagnement. Une fois le système calibré, il est temps d’étiqueter les cellules pour l’acquisition d’images. Commencez à préparer les liposomes nécessaires à l’incorporation des lipides en dissolvant un milligramme de DOPE, un milligramme de D-O-T-A-P et un milligramme de PPE ADO 4 88 chacun dans un microtube de centrifugation séparé contenant un millilitre de chloroforme.

Ensuite, combinez 0,5 millilitre chacune des solutions DOPE et D-O-T-A-P avec 25 microlitres de solution PPE ATO 4 88. Mettez le tube dans un évaporateur centrifuge et lancez l’essorage à 280 g. Démarrez la pompe à vide et laissez-la tourner pendant 24 heures.

Le lendemain, ajoutez 0,5 millilitre de tampon HEIS de 20 millimolaires dans le tube et agitez-le pendant 15 minutes. Placez ensuite le tube dans un bain sonique et sonifiez pendant 15 minutes à 40 degrés Celsius. Pour préparer les cellules, lavez trois fois avec 10 millilitres de PBS un plat de 100 cellules de hamster chinois confluent ou CHOK.

Ajoutez ensuite un millilitre de trypsine et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajoutez neuf millilitres de D-M-E-M-F 12 complété par 10 % de FBS pour suspendre les cellules et ensemencer 150 microlitres de cette solution contenant des cellules. Dans une boîte de Pétri à fond de verre de 22 millimètres contenant 800 microlitres du même milieu.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour l’incorporation de lipides, remplacez le milieu cellulaire par 500 microlitres de milieu exempt de sérum et incubez pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez deux microlitres de solution de liposomes et incubez pendant encore 15 minutes.

Lavez ensuite les cellules avec du PBS et ajoutez un nouveau DM EMF 12. Avant d’obtenir l’imagerie au moins 12 heures avant l’expérience, allumez l’incubateur du microscope pour amener la platine du microscope et les composants optiques à la température expérimentale. L’étape la plus difficile de cette procédure est l’acquisition.

Afin d’assurer le succès, assurez-vous d’optimiser chaque paramètre d’acquisition du système. À l’étude. Le jour de l’expérience, allumez le microscope, attendez que les caméras atteignent la température de fonctionnement.

Pour réaliser l’expérience, nous utiliserons deux caméras. La première caméra sera utilisée pour l’imagerie et la deuxième caméra sera utilisée pour sélectionner la cellule. Cette configuration permettra d’obtenir le temps d’acquisition le plus rapide possible dans le logiciel.

Pour définir les paramètres d’imagerie en lumière transmise. Entrez 20 millisecondes Pour le temps d’exposition, entrez un pour le gain EM pour les deux caméras. Ouvrez ensuite la fenêtre du mode de contraste dans le logiciel et laissez tomber.

Cliquez sur BF pour sélectionner l’option de fond clair. Placez les échantillons dans le support tout en regardant l’échantillon à travers les oculaires. Mettez l’échantillon au point.

Ensuite, envoyez manuellement la lumière à la caméra et poussez doucement les fentes pour que seule la valeur d’intérêt à imager soit éclairée. Ensuite, déplacez une cellule dans la région sélectionnée et, à l’aide du logiciel, envoyez la lumière à la deuxième caméra. Ensuite, dans le logiciel, dessinez un ROI pour générer une référence.

Tout d’abord, pour aligner le laser à l’aide d’un logiciel, sélectionnez l’alignement automatique. Ensuite, pour démarrer la procédure d’alignement automatique, sélectionnez activer le collimateur. Ouvrez ensuite l’incubateur sur le dessus et collimatez le faisceau laser.

Lorsque le laser est aligné dans le coin inférieur gauche de la fenêtre du logiciel à gauche, cliquez sur le bouton 70 pour régler la profondeur de pénétration à 70 nanomètres. Cela correspondra à un angle d’incidence du laser sur le verre inférieur d’environ 70 degrés dans la suite d’applications Leica. Boîte de texte du temps d’exposition du logiciel fluorescent avancé.

Entrez 70 millisecondes dans la zone de texte Gain EM. Entrez 1000 pour faire de même sur la deuxième caméra. Ouvrez la fenêtre des paramètres et entrez les mêmes numéros dans les zones de texte correspondantes.

Cliquez ensuite sur le bouton en direct. La fluorescence sera envoyée à la première caméra, et une image de l’échantillon apparaîtra à l’écran. Déplacez l’échantillon jusqu’à ce qu’une cellule fluorescente atteigne la région de référence d’intérêt.

Appuyez ensuite sur le bouton situé à l’avant du corps du microscope pour envoyer la lumière à la caméra deux et déplacez la molette de position Z avec précision pour faire la mise au point sur la membrane cellulaire dans le logiciel et/ou unique. Ouvrez la fenêtre des paramètres et réglez le temps d’exposition minimum réalisable 1000 EM gain recadré du capteur mode 10 sur la cinquième répétition, puis réglez l’option d’enregistrement automatique pour commencer à acquérir la série d’images. Cliquez sur l’icône de l’appareil photo du logiciel et attendez la fin de l’acquisition.

Ouvrez ensuite la fenêtre des paramètres, désactivez le gain EM et décochez l’option du mode recadré. Lors de l’acquisition, la température de l’appareil photo augmente généralement d’environ deux à trois degrés. Ainsi, avant d’acquérir des images d’une nouvelle cellule, attendez que la température de travail optimale soit atteinte.

Encore une fois, une fois l’imagerie terminée, suivez les instructions du document d’accompagnement pour calculer le déplacement carré moyen à partir de l’imagerie afin d’obtenir une variante marquée par fluorescence de la molécule d’intérêt. Les cellules CHOK one ont été soit marquées avec ADO 4 88 PPE, soit transfectées avec un transfert dans le récepteur ou T-F-R-G-F-P et imagées par TIRF comme décrit dans cette vidéo. Comme on peut le voir ici, la loi de diffusion mesurée pour ADO 4 88 PPE est plate, indiquant une diffusion principalement libre comme précédemment montré par la fluorescence à appauvrissement par émission stimulée, la spectroscopie de corrélation ou les mesures FCS stead après transfection avec le T-F-R-G-F-P, la loi de diffusion mesurée pour T-F-R-G-F-P est initialement plate restant en dessous de 100 nanomètres de déplacement moléculaire moyen avec un coefficient de diffusion apparent moyen d’environ 0,7 micron carré par seconde.

Ceci est suivi d’une diminution rapide de la diffusivité apparente jusqu’à 0,2 micron carré par seconde. La valeur généralement mesurée par la FCS limitée par la diffraction. Il est intéressant de noter que, comme le montre ce dernier exemple, la présente approche permet de mesurer facilement le déplacement moléculaire moyen avec une résolution de quelques dizaines de nanomètres, même en utilisant des marqueurs relativement faibles et denses tels que GFP.

De plus, l’échelle spatiale à laquelle le coefficient de diffusion apparent commence à diminuer fixe la taille caractéristique du confinement partiel des protéines par le squelette membranaire à environ 120 nanomètres, conformément aux estimations précédentes. Une fois maîtrisé, la procédure d’analyse des données et cette acquisition peuvent être réalisées en quelques minutes. Nous pensons que cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire et moléculaire pour explorer facilement et quantitativement la régulation spatio-temporelle de la diffusion des protéines et des lipides dans les échantillons de vie.