Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un Ex-ovo Approche d'électroporation

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une transfection plasmidique de cellules rétiniennes à haute efficacité pour permettre des études génétiques fonctionnelles dans des cultures rétiniennes primaires. Ceci est accompli en recueillant d’abord des embryons de poulet au stade 27 du système hamburger et Hamilton. Une mise en scène appropriée est essentielle pour atteindre une efficacité optimale.

La deuxième étape consiste à disséquer les yeux embryonnaires et à retirer l’épithélium pigmenté rétinien exposant la rétine neurale. Ensuite, la cupule rétinienne est placée dans une chambre remplie de solution plasmidique. Il est ensuite soumis à une électroporation dans des conditions optimisées à l’aide d’électrodes sur mesure faciles à construire.

Les dernières étapes consistent à retirer le corps vitré et le cristallin et à dissocier la rétine neurale en cellules uniques pour une culture primaire à faible densité. En fin de compte, les cellules transfectées peuvent être visualisées par l’expression de gènes rapporteurs ou l’immunohistochimie, et la manipulation génétique efficace peut être évaluée en évaluant l’expression de gènes en aval et/ou les modifications cellulaires phénotypiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la lipofection ou la transfection chimique, est qu’elle multiplie par cinq le taux de transfection des cellules rétiniennes, ce qui permet d’obtenir une efficacité de 22 à 25 % de la population cellulaire totale.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des photorécepteurs, car elle permet de manipuler l’expression des gènes dans les cultures rétiniennes primaires à un niveau d’efficacité qui peut fournir des informations biologiquement significatives. Les implications de cette technique vont au-delà de la recherche fondamentale, car elles peuvent facilement être adaptées aux technologies à haut débit pour le développement de médicaments. Commencez par incuber des œufs de poule fécondés à 37,5 degrés Celsius et à 60 % d’humidité relative pendant cinq jours dans un incubateur d’œufs.

Avant l’expérience, procurez-vous un filament de boîte normalement utilisé dans les tirages de micro-pipettes. À l’aide d’une pince, défaites la boîte carrée et redressez le filament en une longue bande. Ensuite, à l’aide d’une règle comme guide, pliez le filament en forme de U carré, de trois millimètres de long à la base et de deux millimètres de haut d’un côté avec l’autre côté, la longueur restante du filament utilisez une pince pour tremper l’électrode dans de l’éthanol à 96 % et allumez brièvement la flamme de l’électrode afin de la stériliser.

Fixez ensuite un fil électrique avec une petite pince crocodile au bras long de l’électrode. Ensuite, nettoyez l’électrode épaisse à pointe dorée avec de l’éthanol à 70 %. Préparez ensuite la chambre d’électroporation en coupant le couvercle d’un microtube de centrifugation stérile de 1,5 millilitre à l’aide de ciseaux stérilisés et en le fixant à plat sur une boîte de Pétri de 100 millimètres à l’aide de ruban adhésif.

Ensuite, stérilisez les outils microdisecteurs en trempant les pointes des instruments dans de l’éthanol à 96 % et en les flambant brièvement. Essuyez également la lunette de dissection avec de l’éthanol à 70 %. Réchauffez une bouteille de solution saline équilibrée de Hanks stérile sans calcium ni magnésium dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Une fois chaud, utilisez-le pour remplir une boîte de Pétri stérile de 100 millimètres aux trois quarts. Placez ensuite la chambre d’électroporation sous un microscope à dissection propre. Connectez ensuite les électrodes à l’appareil d’électroporation, en vous assurant que l’électrode sur mesure est connectée au pôle négatif et que l’électrode à pointe dorée est connectée au pôle positif de la machine.

Nettoyez les œufs en essuyant l’extérieur de la coquille avec de l’éthanol à 70 %. Soyez prudent et maintenez la stérilité tout au long du reste du protocole. Pour éviter de transporter la contamination dans les cultures à l’aide de grandes pinces de Maloney incurvées, ouvrez soigneusement un trou dans la coquille de l’œuf en tapotant doucement sur l’extrémité arrondie d’un œuf directement au-dessus de la chambre à air.

Retirez tous les morceaux de la coquille avec une autre paire de pinces. Retirez les membranes et récupérez l’embryon en le retirant soigneusement de l’œuf. Placez l’embryon dans une boîte de Pétri avec la solution saline Hanks Balance préchauffée sans calcium ni magnésium.

Lorsqu’un nombre approprié d’embryons a été collecté, assurez-vous qu’ils sont tous au bon stade. Selon le système de stadification hamburger et Hamilton pour une efficacité optimale, les embryons doivent être au stade 27. Euthanasiez les embryons par décapitation à l’aide d’une pince à maloney, puis utilisez une pince à épiler Dumont pour nucléer soigneusement les yeux.

Transférez les yeux dans une nouvelle boîte de Pétri sans HBSS ni calcium ni magnésium. Commencez par la partie postérieure de chaque œil près de la tête du nerf optique, puis introduisez une pointe de chaque paire de pinces Dumont entre la rétine neurale et l’épithélium pigmenté rétinien. En partant de la partie postérieure de l’œil vers l’avant, utilisez la pince à épiler pour disséquer soigneusement l’épithélium pigmenté rétinien.

Veiller à ne pas endommager la rétine neurale. Configurez l’électro-perteur pour qu’il délivre cinq impulsions carrées de 15 volts d’une durée de 50 millisecondes et d’un intervalle de 950 millisecondes. Ensuite, remplissez la chambre d’électroporation avec 120 microlitres de solution plasmidique à une concentration de 1,5 microgramme par microlitre dans du PBS.

Placez ensuite l’électrode négative en forme de U à l’intérieur de la chambre d’électroporation du couvercle de la microcentrifugeuse. À l’aide d’une pince à épiler incurvée dumont. Transférez une cupule rétinienne dans la chambre d’électroporation et placez-la à l’intérieur de l’électrode en forme de U.

Positionnez la rétine de manière à ce que la partie postérieure de celle-ci soit vers le bas de l’électrode et que le cristallin soit orienté vers le haut. Ensuite, placez l’anode de manière à ce qu’elle touche la partie antérieure de l’œil à côté de la lentille. Utilisez ensuite la pédale de l’électro raider pour délivrer cinq impulsions électriques.

Une fois terminé, transférez la cupule rétinienne électroporée dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de HBSS sans calcium ni magnésium. Répétez la procédure d’électroporation avec chaque cupule rétinienne supplémentaire. Jusqu’à six cupules rétiniennes peuvent être électroporées avec la même solution plasmidique sans diminution significative de l’efficacité de la transfection.

Ensuite, à l’aide d’une pince dentée à liaison, retirez délicatement le cristallin et le corps vitré de chaque échantillon électroporé tout en maintenant l’œil en place avec l’arrière de la pince à épiler incurvée de Dumont Une fois retirée, procédez à la dissociation et à la culture des cellules rétiniennes électroporées à l’aide de techniques standard. Les cellules rétiniennes montrées ici ont été électroporées avec une expression de GFP, plasmidiques, dissociées et cultivées pendant quatre jours. Les micrographies fluorescentes ont montré des noyaux de coloration dappy et des cellules rétiniennes exprimant la GFP.

Une coloration aux anticorps anti-visine a été réalisée pour identifier les cellules photoréceptrices. Les paramètres décrits dans ce protocole ont été optimisés pour obtenir des efficacités de transfection qui sont en moyenne de 22 % par rapport à la population totale après quatre jours. En culture, cette mesure passe à une moyenne de 25 % d’efficacité lorsque seule la population de photorécepteurs est considérée comme considérée une fois maîtrisée.

Cette technique, du prélèvement d’embryons à l’électro-opération, peut être réalisée en moins de 30 minutes pour six yeux si elle est réalisée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il ne doit pas s’écouler plus de trois heures entre la collecte des embryons et le placage cellulaire dissocié afin d’obtenir une culture de bonne qualité. Cette technique peut être appliquée à la surexpression ou à la corrélation de gènes, par exemple, à l’aide d’un système ARNi.

De plus, les rétines qui ont été transfectées à la suite de cette procédure peuvent être utilisées pour les cultures rétiniennes organotypiques.