Mesure de l'anaphylaxie locaux chez la souris

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les changements de perméabilité vasculaire, afin de quantifier les réponses allergiques localisées. Ceci est accompli en sensibilisant d’abord les animaux à un allergène, tel que l’albumine O. La deuxième étape consiste à défier les oreilles avec une injection intradermique de l’allergène.

Ensuite, le colorant bleu d’Evan est injecté dans la veine de la queue. La dernière étape consiste à extraire le colorant des oreilles contestées en les incubant pendant la nuit. Dans la forme, amide, une photométrie finalement spectro est utilisée pour quantifier la quantité de colorant qui a pénétré dans l’oreille.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que l’extravasation du colorant est mesurée par spectrométrie. Cela signifie que le test n’est pas facilement soumis au biais de l’observateur. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les injections intradermiques et dans les veines de la queue sont techniquement difficiles et nécessitent beaucoup de pratique pour atteindre la compétence.

Commencez par porter une aliquote de la solution mère d’ovules à température ambiante pour l’utilisation. Lorsqu’il est à température ambiante, diluez le stock d’ovules à une concentration d’un milligramme par millilitre dans un XPBS. Utilisez un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres.

Tourbillonnez le tube à vitesse moyenne et ajoutez soigneusement un volume égal de complètement homogénéisé. Injectez de l’alun dans la solution d’ovules goutte à goutte. En parallèle, préparer une solution témoin négative d’alun mélangé à du PBS dans un rapport de un à un en utilisant la même technique.

Ensuite, bouchez les tubes et fixez-les au vortex. Faites fonctionner le vortex au réglage le plus bas pendant une demi-heure avec les tubes attachés. Lorsque les solutions sont prêtes, procédez immédiatement à la sensibilisation des souris BAB.

Chargez le mélange d’alun d’ovules dans une seringue d’un millilitre. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 27, injectez 100 microlitres dans le péritoine de chaque souris. Répétez cette opération pour les souris témoins négatives utilisant la solution d’alun sans ovules au cours des trois prochaines semaines.

Répétez ce processus pour un total de trois injections par souris après la dernière injection, attendez au moins deux semaines avant d’effectuer le test d’anaphylaxie locale à partir d’ovules congelés. Commencez par préparer une solution de travail de cinq milligrammes par millilitre dans PBS. Vortex brièvement, en utilisant 5 % de fluor ISO.

Anesthésie une souris sensibilisée, et lorsqu’elle devient immobile, réduisez l’isofluor à 3 %. Maintenant, chargez une seringue de trois 10 insulines avec 10 microlitres de la préparation d’ovules, et bouchez-la avec une aiguille de calibre 31 et chargez une deuxième seringue avec 10 microlitres d’un XPBS. Ensuite, enveloppez un tube conique de 15 millilitres avec du ruban adhésif transparent côté collant sous un microscope à dissection, fixez le côté dorsal de l’oreille gauche d’une souris anesthésiée au tube. Insérez l’aiguille de la seringue PBS, côté biseau vers le haut, entre les deux feuilles de l’oreille et injectez lentement les 10 microlitres complets.

Évitez de heurter les vaisseaux sanguins. Une injection réussie entraînera un problème intradermique évident. Il est essentiel d’injecter tout le volume dans l’oreille.

Si du liquide s’échappe du site d’injection, l’animal ne peut pas être utilisé dans l’analyse. De plus, si l’aiguille traverse complètement l’oreille ou égratigne la surface de l’oreille, le test n’est pas valide car ces traumatismes confondront les résultats dans l’oreille droite. Utilisez la même méthode pour injecter l’ovule pendant la période de trois minutes.

Transférez la souris dans un dispositif de contention et placez-la sous une lampe chauffante. Injectez ensuite lentement 200 microlitres de colorant bleu Evans à 0,5 % dans la veine de la queue. À l’aide d’une aiguille de calibre 27, l’injection rapide peut être dommageable si le vaisseau est détruit avant que tout le colorant ne soit injecté.

Continuez à injecter du côté opposé de la queue. Attendez maintenant 10 minutes, puis euthanasiez la souris avec du dioxyde de carbone, suivie d’une luxation cervicale. Une fois l’animal euthanasié, utilisez des pinces et des ciseaux pour retirer les oreilles.

Saisissez le bord de l’oreille avec la pince sans exercer de pression sur le site d’injection. Ensuite, coupez près de la crête cartilagineuse à la base des oreilles, mais pas à travers celle-ci. Prélevez autant de tissu que possible.

Maintenant, en prenant les précautions appropriées, aliquote 700 microlitres de forme amide pour chaque oreille dans un micro tube à centrifuger. Transférez une oreille dans chaque tube et incubez-les pendant la nuit à 63 degrés Celsius dans un bloc de chaleur sec, le lendemain, la majeure partie du colorant sera extraite, mais les oreilles peuvent apparaître légèrement bleues. Ajouter 300 microlitres de chaque échantillon en double dans une plaque de 96 puits.

Évitez de transférer de la fourrure et ne formez pas de bulles pour les blancs. Chargez deux puits avec 300 microlitres de forme amide. Mesurez ensuite l’absorbance à 620 nanomètres.

Soustrayez les valeurs de l’arrière-plan et analysez les résultats. Les animaux sensibilisés au PBS n’ont pas réagi à la provocation des ovules ou à la provocation PBS. Comme prévu, les deux oreilles sont restées blanches.

L’année où l’on a reçu le test PBS chez les animaux sensibilisés aux OVA, elle était soit complètement blanche, soit légèrement bleue, localisée au site d’injection où ses oreilles recevant le test de provocation aux ovules sont devenues progressivement plus foncées pendant 10 minutes après l’administration du colorant, le tissu auditif traité par l’IDE des animaux sensibilisés au PBS avait des lectures d’absorbance négligeables après le test PBS et le test OVA. Alors que pour les animaux sensibilisés aux ovules, l’injection de PBS a généralement donné une lecture d’absorbance moyenne de 0,13. À l’inverse, une provocation d’ovules de 50 microgrammes a donné une lecture d’absorbance moyenne de 0,58.

La quantité d’ovules utilisée pour le défi peut être ajustée dans certaines limites. Par exemple, un test de provocation de 20 microgrammes a entraîné une absorbance moyenne de 0,30. Cependant, un test de moins de 20 microgrammes n’a pas donné de résultats fiables.

Bien qu’il soit difficile une fois qu’une personne maîtrise les injections intradermiques et intraveineuses, cette technique peut être réalisée sur un animal en 15 minutes environ avec deux personnes travaillant ensemble, l’une effectuant les injections dans l’oreille et l’autre effectuant les injections dans la veine de la queue. La procédure peut être effectuée sur 10 animaux en une heure environ. Ce test est très polyvalent car il peut être utilisé pour l’anaphylaxie cutanée active et passive.

Il peut également être utilisé pour une grande variété d’allergènes. N’oubliez pas que le fluor peut avoir des effets négatifs sur le système reproducteur humain. Utilisez-le uniquement dans une pièce bien ventilée et ayez une cartouche de récupération attachée à la chambre d’induction pour neutraliser les gaz résiduaires si vous êtes enceinte.

Lors de l’utilisation de fluor, portez un masque à filtre à charbon pour minimiser l’exposition.