Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l'aide qu'épisomes et les inhibiteurs de HDAC

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des cellules souches pluripotentes induites sans intégration à partir d’une petite quantité de sang périphérique. Ceci est réalisé en cultivant des cellules mononucléées isolées du sang périphérique dans des facteurs de croissance définis pour produire une population de progéniteurs érythrocytaires très sensibles à la reprogrammation. Dans un deuxième temps, des plasmides épisomaux non intégrateurs porteurs de gènes de reprogrammation sont introduits dans les érythroblastes par l’affection du noyau pour initier le processus de reprogrammation.

Ensuite, les cellules affectées par le nucule sont plaquées sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris irradiés pour permettre une reprogrammation continue avec succès. Des colonies de cellules souches pluripotentes induites reprogrammées peuvent être identifiées en fonction de leurs caractéristiques morphologiques, de l’activité de la phosphatase alcaline, de l’immunochimie positive pour les marqueurs de pluripotence et de l’expression des gènes de pluripotence endogènes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la reprogrammation virale, est que ce protocole garantit une génération cohérente d’IPSC sans intégration.

Un technicien dans le laboratoire Commencez par diluer le sang périphérique dans un rapport de un pour un dans le DPBS. Ensuite, dans un tube en polystyrène à fond rond de 15 millilitres, superposez soigneusement sept millilitres de sang dilué sur trois millilitres de liquide à température ambiante. Après avoir séparé l’échantillon pendant 30 minutes à 400 GS et à température ambiante, le pbmc se sera déposé dans la couche d’interface blanche trouble entre le plasma et le fial high pack.

À l’aide d’une pipette de transfert stérile, transférez les BMC P dans un tube conique de 15 millilitres et portez le volume à 10 millilitres avec du DPBS frais. Ensuite, après avoir compté les cellules, transférez deux fois 10 aux six BMC P dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et faites tourner les cellules restantes, congelez les cellules granulées à une concentration de deux fois 10 à six pbmc par millilitre dans du sérum bovin fœtal à 90 % avec 10 % de sulfoxyde de diméthyle. Ensuite, après avoir fait tourner les BMC P qui ont été mis de côté, nous suspendons la pastille dans deux millilitres de milieu d’expansion fraîchement préparé et les plaçons dans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits pour incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec une atmosphère de 5 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone et 90 % d’azote.

Ensuite, le troisième et le sixième jour, remplacez le milieu en prélevant les cellules du puits. Laver le puits avec deux millilitres de QBSF 60 pour recueillir les cellules restantes, granuler les cellules par centrifugation, puis ressusciter en suspendant la pastille dans deux millilitres de milieu d’expansion frais. Ensuite, retournez les cellules dans la même plaque à 12 puits et poursuivez l’incubation. Le neuvième jour, pipetez les plasmides de reprogrammation dans un tube einor stérile de 1,5 millilitre, comme indiqué dans le tableau.

Ensuite, mélangez la solution d’affection nucléotique avec les suppléments fournis par le fabricant et transférez le mélange dans un tube DPH renversé stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, versez deux millilitres de milieu d’expansion dans un puits d’une nouvelle plaque à 12 puits et équilibrez le milieu dans l’incubateur humidifié à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules soient prêtes. Collectez les cellules, lavez bien la culture cellulaire comme nous venons de le démontrer et lavez les cellules dans cinq millilitres de DPBS.

Ensuite, suspendez la pastille cellulaire dans 100 microlitres de solution d’affection nucléotique plus supplément en prenant soin d’éviter de générer des bulles et transférez la suspension cellulaire dans le tube contenant le plasmide de reprogrammation. Mélangez les cellules en pipetant une fois de haut en bas et transférez toute la solution au fond d’un détecteur d’affection de nucule. Ensuite, placez le vete dans la machine à affection Nucle et exécutez le programme T 0 1 9.

Ajoutez maintenant 100 microlitres du milieu d’expansion EQUILIBRATED au niveau d’affection du nucule, et collectez immédiatement l’échantillon entier en évitant tout débris de cellules mortes flottantes blanches et déposez-le dans le puits du milieu de préchauffage. Ensuite, remettez les cellules dans l’incubateur humidifié le jour 10 ou 11. Enduire chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits de gélatine avec un millilitre de gélatine à 0,1 % dans HBSS, puis placer la plaque dans l’incubateur humidifié ou au moins cinq minutes pendant l’incubation transférer un flacon de décongélation, deux fois 10 dans les six souris irradiées de 3000 degrés centigrades, embryonnaires, fibroblastes ou mes dans 10 millilitres de milieu de méthamphétamine préchauffé, puis centrifuger les cellules pendant qu’elles tournent vers le bas.

Aspirez la solution de gélatine de la plaque à six puits, puis mettez les mes en suspension dans 12 millilitres de méthamphétamine fraîche. Versez immédiatement deux millilitres d’OFM dans chaque puits de la gélatine. Six. Placez la plaque et remettez-la dans l’incubateur humidifié jusqu’au 12e jour.

Le 12e jour, collectez les cellules nucléaires affectées du puits dans un tube conique de 15 millilitres, en lavant le puits comme démontré pour collecter toutes les cellules restantes. Après avoir fait tourner les cellules, nous suspendons la pastille dans 12 millilitres de milieu de reprogrammation fraîchement préparé, et distribuons deux millilitres de cellules dans chaque puits de cellules nourricières. Dans la plaque à six puits, centrifugez ensuite la plaque pendant 30 minutes à 75 GS et à température ambiante, puis remettez la plaque dans l’incubateur humidifié, en changeant le milieu tous les deux jours pendant une à deux semaines.

Une fois que les colonies de cellules pluripotentes inductibles apparaissent, commencez à nourrir les cellules avec un milieu de cellules souches embryonnaires humaines fraîchement préparé contenant des inhibiteurs de l’histone désacétylase trois jours après l’affection du nucule et avant l’ensemencement, les cellules affectées par le nucle avec de la méthamphétamine inductible. L’efficacité d’une affection nucléaire NU réussie doit être estimée par microscopie à fluorescence Pour l’EGFP, par exemple, une expérience typique d’affection des noyaux avec environ 5 à 10 % de la population cellulaire totale exprimant EGFP des colonies de cellules souches pluripotentes inductibles reprogrammées commenceront à apparaître environ deux semaines après l’affection nucléaire NU. Les colonies sont généralement circulaires avec des bords bien définis et peuvent être identifiées par leur morphologie caractéristique de cellules souches embryonnaires humaines, y compris de petites cellules serrées avec un rapport nucléaire/cytoplasmique élevé et des nucléoles visibles des lignées représentatives qui ont été complètement caractérisées.

Tous les tests positifs pour l’activité de la phosphatase alcaline expriment les marqueurs de pluripotence standard et réactivent les gènes de pluripotence endogènes une fois maîtrisés. Cette technique peut générer systématiquement un IPSC sans intégration en quatre semaines si elle est exécutée correctement. À la suite de cette procédure, des études de différenciation peuvent être effectuées pour répondre à des questions sur n’importe quel type de tissu.