Name: Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à laide quépisomes et les inhibiteurs de HDAC (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour générer des cellules souches pluripotentes induites sans intégration à partir de sang périphérique. Ce protocole utilise des plasmides épisomaux et des inhibiteurs d'histone désacétylases pour améliorer le rendement.

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Les auteurs tiennent à remercier les subventions suivantes du NIH pour soutenir cette recherche: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), et K12HL0806406 (SKS); et la Fondation McCarthy JP (AR).

Le consentement éclairé, tel qu&#39;approuvé par les Institutional Review Board de la Cancer Research Center Fred Hutchinson et de l&#39;hôpital de Philadelphie s enfants », a été obtenu à partir de patients avant de recueillir des échantillons de sang périphérique. Toutes les lignes directrices institutionnelles ont été observées. Toutes les expériences animales, y compris la génération MEF et formation de tératome ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et institutionnel. 1. Ficoll séparation des PBMC et Expansion des érythroblastes - Jour 0 <ol><li> Diluer le sang périphérique de 1: 1 avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Dans un tuyau à fond rond en polystyrène de 15 ml, 7 ml soigneusement la couche de sang dilué sur 3 ml de la température ambiante de Ficoll-Hypaque. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 400 g pendant 30 min. </li><li> Les PBMC aura réglé à l&#39;interface entre le plasma et le Ficoll-Hypaque, vu comme une couche blanche trouble. L&#39;utilisation d&#39;un transfert pipette stérile, recueillir le PBMC dans un tube de 15 ml conique. Porter le volume à 10 ml à l&#39;aide de DPBS. </li><li> En utilisant un hématimètre, compter les PBMC. </li><li> Pipette 2 × 10 6 PBMC dans un tube de 15 ml conique séparé et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Centrifuger les cellules restantes et le gel à une concentration de 2 x 10 6 CMSP / ml dans 90% de sérum bovin fœtal (FBS) / 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). </li><li> Préparer Expansion: milieu libre QBSF-60 sérum (abri de la lumière) + pénicilline / streptomycine (1%) + acide ascorbique (50 ng / ml) + facteur des cellules souches (SCF, 50 ng / ml) + interleukine 3 (IL 3, 10 ng / ml) + érythropoïétine (EPO, 2 U / ml) + insuline-like growth factor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexaméthasone (1 uM; abri de la lumière; dégeler une partie aliquote de chaque média changer). </li><li> Remettre en suspension 2 × 10 6 PBMC dans 2 ml de fraîchement préparé milieu d&#39;expansion et le placer dans un puits d&#39;une plaque de culture de 12 tissu puits et incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° avec une atmosphère de 5% O 2, 5% CO 2 et 90% N 2. </li><li> Le jour 3 et le jour 6, remplacer médias. <ol><li> Recueillir les cellules et laver le puits avec 2 ml de QBSF-60 pour recueillir toutes les cellules restantes. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 300 xg pendant 5 min et le surnageant aspiré. </li><li> Reprendre les cellules dans 2 ml de la nouvelle extension moyenne et les retourner à la même plaque 12 puits. </li></ol></li></ol> 2. reprogrammation des cellules par nucléofection - Jour 9 <ol><li> Pipeter les plasmides de reprogrammation dans un tube Eppendorf de 1,5 ml stérile (tableau 1). </li><li> Mélanger la solution de nucléofection avec supplément (fourni par le fabricant) et la pipette dans un tube Eppendorf de 1,5 ml stérile. </li><li> Introduire à la pipette 2 ml de moyen d&#39;extension dans un puits d&#39;une plaque 12 puits et la place dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O 2, 5% CO 2 et 90% N 2) pour atteindre l&#39;équilibre avant l&#39;ajout de cellules. </li><li> Recueillir leLavage des cellules cultivées et le puits avec 2 ml de QBSF-60 pour recueillir les cellules restantes. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min et aspirer le surnageant. </li><li> Laver les cellules par remise en suspension dans 5 ml de DPBS et centrifugation à 300 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant. </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans 100 pi de solution de nucléofection + Supplément, en prenant soin d&#39;éviter les bulles de production. </li><li> Introduire à la pipette la suspension cellulaire dans le tube contenant les plasmides de reprogrammation, pipette de haut en bas une fois, et la pipette l&#39;échantillon dans le fond de la cuvette de nucléofection. </li><li> Placez la cuvette dans la machine de nucléofection et exécuter le programme T-019. </li><li> Transférer 100 ul de l&#39;expansion préchauffé moyen (à partir de la plaque d&#39;équilibrage à l&#39;étape 2.3) dans la cuvette de nucléofection. </li><li> Recueillir immédiatement l&#39;ensemble de l&#39;échantillon et le dépôt dans le puits de préchauffé Moyen Foisonnement. Éviter de recueillir le, des débris flottants de cellules mortes blanc. </li&gt; <li> Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O 2, 5% CO 2 et 90% N 2) pour la croissance. </li></ol> 3. Placage Feeder cellules - Jour 10 ou 11 <ol><li> Au jour 10, les cellules plaque d&#39;alimentation. <ol><li> Revêtez un 6 et plaque de culture de tissu avec de la gélatine. <ol><li> Introduire à la pipette 1 m de gélatine à 0,1% en solution saline tamponnée de Hank (HBSS) dans chaque puits de la plaque. </li><li> Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur pendant au moins 5 min. </li><li> Immédiatement avant utilisation, aspirer la solution de gélatine à partir de la plaque. </li></ol></li><li> Décongeler une fiole de 2 x 10 6 fibroblastes embryonnaires de souris irradiées à 3000 cGy dans 10 ml d&#39;préchauffé MEF Media (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + pénicilline / streptomycine (1%)). </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Reprendre les cellules dans 12 ml de MEF médias et pipette 2 ml inPour chaque puits de la plaque 6 puits revêtu de gélatine. Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O 2, 5% CO 2 et 90% N 2) jusqu&#39;au jour 12. </li></ol></li></ol> 4. étalement des cellules sur des cellules nourricières et changement de support - Jour 12 <ol><li> Recueillir les cellules dans une nucleofected 15 ml tube conique et collecter toutes les cellules restantes par un lavage des puits avec 2 ml de QBSF-60. Centrifuger l&#39;échantillon à 300 g pendant 5 min. </li><li> Préparer reprogrammation moyenne: Iscove modification de Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + non animale L-glutamine (1 mM) + non-acides aminés essentiels (NEAA, 1%) + pénicilline / streptomycine (1%) + β mercaptoéthanol (0,1 mM) + le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF, ajoutées à l&#39;alimentation fraîche, 10 ng / ml) + acide ascorbique (frais ajoutés à l&#39;alimentation, 50 pg / ml). </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 12 ml de reprogrammation moyenne. Introduire à la pipette 2 ml par puits de la suspension de cellules dansla plaque à 6 puits de cellules nourricières (tel que préparé dans la section 3). Centrifuger la plaque à 50 xg pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O 2, 5% CO 2 et 90% N 2) pour la croissance. Changer la reprogrammation moyenne tous les deux jours jusqu&#39;à ce que les colonies iPSC commencent à apparaître (1-2 semaines). </li><li> Préparer hESC moyenne: DMEM / F12 1: 1 + Knockout sérum de remplacement (20%) + pénicilline / streptomycine (1%) + NEAA (1%) + non animale L-glutamine (1 mM) + pyruvate de sodium (1%) + bicarbonate de sodium (0,12%) + β-mercaptoéthanol (0,1 mM) + bFGF (ajoutés à l&#39;alimentation fraîche, 10 ng / ml) </li><li> Préparer les inhibiteurs de HDAC: butyrate de sodium (ajouté à l&#39;alimentation fraîche, 100 M), de l&#39;acide suberanilohydroxamic (SAHA, a ajouté à l&#39;alimentation fraîche, 200 nM). Une fois colonies iPSC apparaissent, commencent à se nourrir les cellules avec des inhibiteurs de CSEh moyen + HDAC, le changement moyen chaque jour. REMARQUE: le butyrate de sodium est une petite molécule qui est adsorbé sur des tubes en plastique, therefore stocker dans un tube en verre de borosilicate à 4 ° C. </li></ol> 5. Les clones isolation iPSC <ol><li> Une fois colonies iPSC sont assez grands pour être isolé (20-25 cellules), les prendre avec une pipette P20. </li><li> Préparer les inhibiteurs de HDAC: butyrate de sodium (ajouté à l&#39;alimentation fraîche, 100 M), SAHA (ajoutée à l&#39;alimentation fraîche, 200 nM) </li><li> Placez les colonies isolées sur iMEFs dans les différents boîtes de 35 mm contenant des inhibiteurs d&#39;HDAC CSEh moyen + + Supplément Clonage &amp; Recovery. </li><li> Le jour après la cueillette des colonies, changer de support de CSEh inhibiteurs HDAC moyen +. </li><li> Changer le support tous les jours jusqu&#39;à ce que les colonies iPSC sont prêts pour des passages. </li><li> Retirer les inhibiteurs d&#39;HDAC dans le milieu une fois colonies se stabilisent à passage 2-3. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Pour la réussite génération iPSC lors de l&#39;utilisation de ce protocole, il ya plusieurs mises en garde importantes qui devraient être considérés. Au cours de la phase d&#39;expansion des érythroblastes, le calendrier de changement de support doit être strictement suivie, que les écarts peuvent conduire à la stimulation inefficace de la population de cellules progénitrices cible et un rendement plus faible de génération iPSC. Il est important de faire de nouveaux milieu d&#39;expansion avec la dexaméthasone frais à c...

iPSCs sont dérivées de tissus somatiques par l&#39;expression ectopique d&#39;un ensemble minimal de gènes de pluripotence. Cette technique a d&#39;abord été démontré par transduction rétrovirale des fibroblastes humains avec OCT4, SOX2, KLF4, et cmyc, qui sont fortement exprimés dans l&#39;état pluripotent 1. Ces exprimés de façon transitoire &quot;facteurs de reprogrammation épigénétique&quot; modifient le paysage et profil d&#39;expression génique de la cellule cible analogue aux cellules souches embryonnaires humaines 2. Une fois créé, iPSCs peut potentiellement être différenciées en tout type de tissu pour complément d&#39;enquête. Ainsi, ils sont prometteurs pour l&#39;utilisation dans la médecine régénérative, la modélisation des maladies, et des applications de thérapie génique. Cependant, ce qui perturbe le génome des virus intégrant a le potentiel de modifier l&#39;expression du gène endogène, influence le phénotype cellulaire, et en fin de compte de biaiser les résultats scientifiques. En outre, les intégrations virales aléatoires peuvent conduire à délétère e cellulaireffets, y compris la possibilité d&#39;une transformation maligne 3 ou ré-expression des transgènes oncogènes 4. Futures applications cliniques, il faudra intégrer les non-génération iPSC. Qu&#39;épisomes, qui sont chromosomiques circulaire molécules d&#39;ADN supplémentaires, offrent une stratégie visant à générer iPSCs rentables, sans intégration-5. La combinaison de vecteurs épisomiques indiqués dans le tableau 1 expriment la reprogrammation facteurs OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, et LIN28A. Le plasmide pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F contient également une p53 shRNA pour la suppression temporaire de TP53 à améliorer la reprogrammation cellulaire 6. Le déficient vecteur pCXWB-EBNA1 réplication favorise l&#39;amplification des facteurs de reprogrammation et une efficacité accrue de reprogrammation en fournissant une augmentation transitoire de l&#39;expression de EBNA1 7. Le plasmide pCXLE_EGFP peut être ajouté au mélange de nucléofection dans le but de determining l&#39;efficacité de transfection ou pour des applications de tri des cellules. A l&#39;exception du p-EBNA1 CXWB, des plasmides épisomiques utilisées dans ce protocole contiennent l&#39;origine du virus d&#39;Epstein-Barr de la réplication du virus et le gène EBNA1, qui médient la réplication et la partition de l&#39;épisome au cours de la division de la cellule hôte 8. Les qu&#39;épisomes sont spontanément perdu avec extensions successives iPSC 7. Sous-clonage et la caractérisation des CSPi avec épisomaux perte de vecteur, qui peut être déduit de la perte d&#39;expression eGFP, peuvent conduire à l&#39;intégration complètement iPSCs gratuits pour futures applications cliniques. Inhérente au processus de génération iPSC est la suppression de gènes spécifiques de la lignée et la réactivation des gènes de pluripotence associée. Régulation de l&#39;expression des gènes se produit à plusieurs niveaux dans le noyau, y compris les modifications de l&#39;ADN et la chromatine pour permettre des facteurs de transcription, des éléments d&#39;ADN régulatrices, et l&#39;accès de l&#39;ARN polymérase à ciblergènes. Rénovation du paysage épigénétique via des modifications globales de la chromatine est un élément clé de ré-expression du programme génétique de la pluripotence. Une modification de la chromatine spécifique qui est importante dans la régulation de l&#39;expression génique est l&#39;acétylation des histones particulier à des résidus lysine, permettant l&#39;accès à cibler des gènes par le biais diminution de la tension de la bobine d&#39;histone-ADN. Les inhibiteurs de HDAC sont de petites molécules qui ont été montré pour améliorer la reprogrammation de cellules iPSC et CSEh auto-renouvellement 9,10, probablement en raison de l&#39;appui de l&#39;état acétylé 11. Le protocole décrit ci-dessous, adapté d&#39;une publication préalable en utilisant des lentivirus intégrant 12, fournit une méthode étape par étape pour la production de cellules iPSC optimisé de sang périphérique en utilisant qu&#39;épisomes et les inhibiteurs d&#39;HDAC. Les concentrations d&#39;inhibiteur d&#39;HDAC utilisés ici sont la moitié de ceux décrits par Ware, et al. 9, et ont systématiquement conduit à une augmentation de 2 fois dans les colonies iPSC entièrement reprogrammés plus de normeprotocoles de reprogrammation épisomaux sans inhibiteurs d&#39;HDAC. Ce niveau de reprogrammation va de pair avec l&#39;efficacité que nous observons avec les méthodes lentiviraux. En utilisant ce protocole, nous avons généré efficacement iPSC de personnes comme vieux de 87 ans.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>Conserver à 4 &deg ;C. Chauffer à température ambiante avant utilisation.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Magasin à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Magasin à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>Se conserve à -20 &deg ; C jusqu’à ce que nécessaire. Décongeler, aliquoter, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>sulfoxyde de diméthyle (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>QBSF-60 moyen sans sérum</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>Conserver à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Solution de gélatine à 2 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>Conserver à 4 &deg ; C, liquéfier en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation.</td></tr><tr><td>Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>Magasin à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Magasin à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Magasin à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Aliquot, congélation à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>acides aminés non essentiels (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Stocker à 4 &deg ; C, à l’abri de la lumière.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham’s F12, 1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>Se conserve à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Aliquot, congélation à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>pyruvate de sodium, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>bicarbonate de sodium, 7,5 %</td><td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>Stocker à 4 °C.</td></tr>facteur <tr><td>de croissance des fibroblastes de base (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>Faire 10 mg/ml de stock dans DPBS, aliquote, congeler à -20 &deg ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Butyrate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>Faire 2000x stock (400 mM) en DPBS, aliquote, geler à -20 &deg ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>hES Clonage cellulaire & Supplément de récupération</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>Conserver à -20 &deg ; C jusqu’à ce que nécessaire. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Matrigel BD BD</td><td>Biosciences</td><td>35-4277</td> qualifié ESC <td>Décongeler pendant la nuit sur la glace à 4 &deg ; C, aliquote dans des tubes pré-refroidis à l’aide d’embouts de pipette pré-refroidis. Conserver à -20 &deg ; C jusqu’à ce que nécessaire. Décongeler à 4 &deg ; C, utiliser immédiatement.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Aliquot, congélation à -20 &deg ;C.</td></tr>acide <tr><td>ascorbique, en poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>Produire 5 mg/ml de bouillon dans DPBS, filtre stérile, stocker à 4 °C.</td></tr><tr><td>facteur de cellules souches humaines recombinantes (SCF)</td><td>R & D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>Make 100 &mu ; stock g/m en SFEM, aliquote, congélation à -20 &deg ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>interleukine humaine recombinante 3 (IL-3)</td><td>R & D Systems</td><td>203-IL-010</td><td>Make 100 &mu ; g/ml stock en SFEM, aliquote, congeler à -20 &deg ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>érythropoïétine (EPO)</td><td>R & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>Faire 1000 U/ml stock en SFEM, aliquote, congélation à -20 &deg ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>facteur de croissance analogue à l’insuline humaine recombinante 1 (IGF-1)</td><td>R & D Systems</td><td>291-G1-200</td><td>Make 100 &mu ; g/ml stock en SFEM, aliquote, congeler à -20 &deg ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Produire 1000x stock (100 mM) en DPBS.</td></tr><tr><td>dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Faire 50x stock (50 &mu ; M) dans le DPBS, filtre stérile, stocker à 4 °C.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Fabriquer 2 000x le stock (400 mM) dans DPBS, aliquote, congeler à -20 &deg ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire 12 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>Tube Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire 6 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture de tissu de 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables de 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables de 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables de 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu ; l pointes de pipette, pointes barrières</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>verre Pipettes Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>aide à la pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

efficace sur les cellules ips génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de hdac

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Ce manuscrit illustre un protocole pour créer efficacement des cellules gratuit intégration humains souches pluripotentes induites (CISP) du sang périphérique en utilisant des plasmides épisomiques et histone déacétylase (HDAC) inhibiteurs. Les avantages de cette approche sont les suivants: (1) l&#39;utilisation d&#39;une quantité minimale de sang périphérique en tant que matériau de source; (2) nonintegrating vecteurs de reprogrammation; (3) une méthode rentable pour générer des vecteurs iPSCs libres; (4) une seule transfection; et (5) l&#39;utilisation de petites molécules pour faciliter la reprogrammation épigénétique. En bref, des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont isolées à partir d&#39;échantillons de phlébotomie routine et ensuite mises en culture dans des facteurs de croissance définies pour obtenir une population de cellules progénitrices érythrocytaires hautement proliférative qui est remarquablement prêtent à une reprogrammation. Nonintegrating, plasmides épisomiques non transmissibles exprimant OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, et un court en épingle à cheveux (sh) ARN p53 sont introduced dans les érythroblastes dérivés via une seule nucléofection. La co-transfection d&#39;un épisome qui exprime renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) permet une identification facile des cellules transfectées. Un plasmide à réplication déficiente séparé d&#39;Epstein-Barr exprimant l&#39;antigène nucléaire 1 (EBNA1) est également ajouté au mélange réactionnel pour une expression accrue de protéines de épisomiques. Les cellules transfectées sont ensuite étalées sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées (les iMEFs) pour une reprogrammation continue. Dès que des colonies apparaissent comme iPSC à environ douze jours après nucléofection, les inhibiteurs de HDAC sont ajoutés au milieu pour faciliter le remodelage épigénétique. Nous avons trouvé que l&#39;inclusion d&#39;inhibiteurs HDAC augmente régulièrement la génération de colonies iPSC entièrement reprogrammé par 2 fois. Une fois colonies iPSC présentent typique cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) morphologie, ils sont délicatement transférés à Imef tissus enduits des plaques de culture individuels pour la croissance et l&#39;expansion continue.

Trois jours après nucléofection et avant l'étalement des cellules sur nucleofected iMEFs, l'efficacité de nucléofection réussi doit être estimée par microscopie à fluorescence pour eGFP. La figure 1 représente une expérience typique de nucléofection à environ 5-10% de la population totale des cellules exprimant eGFP. Colonies reprogrammées iPSC vont commencer à apparaître environ deux semaines après nucléofection. Les colonies sont généralement circulaire avec des frontières...

Nous décrivons ici un protocole pour générer des cellules souches pluripotentes induites humaines du sang périphérique en utilisant une stratégie de reprogrammation de episome base et les inhibiteurs d&#39;histone déacétylase.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des cellules souches pluripotentes induites sans intégration à partir d’une petite quantité de sang périphérique. Ceci est réalisé en cultivant des cellules mononucléées isolées du sang périphérique dans des facteurs de croissance définis pour produire une population de progéniteurs érythrocytaires très sensibles à la reprogrammation. Dans un deuxième temps, des plasmides épisomaux non intégrateurs porteurs de gènes de reprogrammation sont introduits dans les érythroblastes par l’affection du noyau pour initier le processus de reprogrammation.Ensuite, les cellules affectées par le nucule sont plaquées sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris irradiés pour permettre une reprogrammation continue avec succès. Des colonies de cellules souches pluripotentes induites reprogrammées peuvent être identifiées en fonction de leurs caractéristiques morphologiques, de l’activité de la phosphatase alcaline, de l’immunochimie positive pour les marqueurs de pluripotence et de l’expression des gènes de pluripotence endogènes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la reprogrammation virale, est que ce protocole garantit une génération cohérente d’IPSC sans intégration.Un technicien dans le laboratoire Commencez par diluer le sang périphérique dans un rapport de un pour un dans le DPBS. Ensuite, dans un tube en polystyrène à fond rond de 15 millilitres, superposez soigneusement sept millilitres de sang dilué sur trois millilitres de liquide à température ambiante. Après avoir séparé l’échantillon pendant 30 minutes à 400 GS et à température ambiante, le pbmc se sera déposé dans la couche d’interface blanche trouble entre le plasma et le fial high pack.À l’aide d’une pipette de transfert stérile, transférez les BMC P dans un tube conique de 15 millilitres et portez le volume à 10 millilitres avec du DPBS frais. Ensuite, après avoir compté les cellules, transférez deux fois 10 aux six BMC P dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et faites tourner les cellules restantes, congelez les cellules granulées à une concentration de deux fois 10 à six pbmc par millilitre dans du sérum bovin fœtal à 90 % avec 10 % de sulfoxyde de diméthyle. Ensuite, après avoir fait tourner les BMC P qui ont été mis de côté, nous suspendons la pastille dans deux millilitres de milieu d’expansion fraîchement préparé et les plaçons dans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits pour incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec une atmosphère de 5 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone et 90 % d’azote.Ensuite, le troisième et le sixième jour, remplacez le milieu en prélevant les cellules du puits. Laver le puits avec deux millilitres de QBSF 60 pour recueillir les cellules restantes, granuler les cellules par centrifugation, puis ressusciter en suspendant la pastille dans deux millilitres de milieu d’expansion frais. Ensuite, retournez les cellules dans la même plaque à 12 puits et poursuivez l’incubation. Le neuvième jour, pipetez les plasmides de reprogrammation dans un tube einor stérile de 1,5 millilitre, comme indiqué dans le tableau.Ensuite, mélangez la solution d’affection nucléotique avec les suppléments fournis par le fabricant et transférez le mélange dans un tube DPH renversé stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, versez deux millilitres de milieu d’expansion dans un puits d’une nouvelle plaque à 12 puits et équilibrez le milieu dans l’incubateur humidifié à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules soient prêtes. Collectez les cellules, lavez bien la culture cellulaire comme nous venons de le démontrer et lavez les cellules dans cinq millilitres de DPBS.Ensuite, suspendez la pastille cellulaire dans 100 microlitres de solution d’affection nucléotique plus supplément en prenant soin d’éviter de générer des bulles et transférez la suspension cellulaire dans le tube contenant le plasmide de reprogrammation. Mélangez les cellules en pipetant une fois de haut en bas et transférez toute la solution au fond d’un détecteur d’affection de nucule. Ensuite, placez le vete dans la machine à affection Nucle et exécutez le programme T 0 1 9.Ajoutez maintenant 100 microlitres du milieu d’expansion EQUILIBRATED au niveau d’affection du nucule, et collectez immédiatement l’échantillon entier en évitant tout débris de cellules mortes flottantes blanches et déposez-le dans le puits du milieu de préchauffage. Ensuite, remettez les cellules dans l’incubateur humidifié le jour 10 ou 11. Enduire chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits de gélatine avec un millilitre de gélatine à 0,1 % dans HBSS, puis placer la plaque dans l’incubateur humidifié ou au moins cinq minutes pendant l’incubation transférer un flacon de décongélation, deux fois 10 dans les six souris irradiées de 3000 degrés centigrades, embryonnaires, fibroblastes ou mes dans 10 millilitres de milieu de méthamphétamine préchauffé, puis centrifuger les cellules pendant qu’elles tournent vers le bas.Aspirez la solution de gélatine de la plaque à six puits, puis mettez les mes en suspension dans 12 millilitres de méthamphétamine fraîche. Versez immédiatement deux millilitres d’OFM dans chaque puits de la gélatine. Six. Placez la plaque et remettez-la dans l’incubateur humidifié jusqu’au 12e jour.Le 12e jour, collectez les cellules nucléaires affectées du puits dans un tube conique de 15 millilitres, en lavant le puits comme démontré pour collecter toutes les cellules restantes. Après avoir fait tourner les cellules, nous suspendons la pastille dans 12 millilitres de milieu de reprogrammation fraîchement préparé, et distribuons deux millilitres de cellules dans chaque puits de cellules nourricières. Dans la plaque à six puits, centrifugez ensuite la plaque pendant 30 minutes à 75 GS et à température ambiante, puis remettez la plaque dans l’incubateur humidifié, en changeant le milieu tous les deux jours pendant une à deux semaines.Une fois que les colonies de cellules pluripotentes inductibles apparaissent, commencez à nourrir les cellules avec un milieu de cellules souches embryonnaires humaines fraîchement préparé contenant des inhibiteurs de l’histone désacétylase trois jours après l’affection du nucule et avant l’ensemencement, les cellules affectées par le nucle avec de la méthamphétamine inductible. L’efficacité d’une affection nucléaire NU réussie doit être estimée par microscopie à fluorescence Pour l’EGFP, par exemple, une expérience typique d’affection des noyaux avec environ 5 à 10 % de la population cellulaire totale exprimant EGFP des colonies de cellules souches pluripotentes inductibles reprogrammées commenceront à apparaître environ deux semaines après l’affection nucléaire NU. Les colonies sont généralement circulaires avec des bords bien définis et peuvent être identifiées par leur morphologie caractéristique de cellules souches embryonnaires humaines, y compris de petites cellules serrées avec un rapport nucléaire/cytoplasmique élevé et des nucléoles visibles des lignées représentatives qui ont été complètement caractérisées.Tous les tests positifs pour l’activité de la phosphatase alcaline expriment les marqueurs de pluripotence standard et réactivent les gènes de pluripotence endogènes une fois maîtrisés. Cette technique peut générer systématiquement un IPSC sans intégration en quatre semaines si elle est exécutée correctement. À la suite de cette procédure, des études de différenciation peuvent être effectuées pour répondre à des questions sur n’importe quel type de tissu.

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Génération induites pluripotentes (cellules souches iPSC) lignes produit des lignes de différentes potentiel de développement, même quand ils passent des tests standard pour la pluripotence. Nous décrivons ici un protocole de produire des souris provenant entièrement de iPSCs, qui définit les lignes iPSC comme possédant la pluripotence...

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Ici, nous montrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de 3-4 ml de sang périphérique en utilisant un vecteur lentiviral unique reprogrammation. La reprogrammation des cellules sanguines facilement disponibles promet d'accélérer l'utilisation des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche.

Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Ici, nous vous présentons notre méthode établie pour reprogrammer des cellules somatiques humaines dans CSPi humaines sans transgène avec le virus de Sendai, qui montre des résultats cohérents et une efficacité accrues.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Nous proposons un protocole de reprogrammation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en cellules souches pluripotentes induites (iPSC). En plaquant les cellules sanguines transduites sur des plaques recouvertes de matrice avec centrifugation, les iPSC sont induites avec succès à partir de cellules flottantes. Cette technique suggère un protocole de reprogrammation simple et efficace pour des cellules telles que les PBMC et les CBMC.

Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la génération efficace d’iPSC sans intégration à partir de cellules sanguines périphériques humaines adultes. Grâce à l’utilisation de quatre vecteurs épisomaux basés sur oriP/EBNA pour exprimer les facteurs de reprogrammation, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 et SOX2, des milliers de colonies d’iPSC peuvent être obtenues à partir de 1 mL de sang périphérique.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Ce protocole démontre l'induction d'un programme hémogène dans les fibroblastes dermiques humains par l'expression forcée des facteurs de transcription GATA2, GFI1B et FOS pour produire des cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre.

Reprogrammation hémogénique des fibroblastes humains par expression forcée des facteurs de transcription

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Le protocole actuel détaille les étapes de dépannage de la dérivation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) d’échantillons de patients qui ont été difficiles à reprogrammer conformément aux instructions du fabricant. Ce protocole est spécifique aux échantillons de couche buffy congelée mais peut aussi être appliqué à la reprogrammation des PBMC purifiés.

Reprogrammation de lignées de cellules souches pluripotentes induites à partir d’échantillons de Buffy Coat gelés

Découvrez une méthode efficace pour générer des cellules souches pluripotentes induites sans intégration à partir de sang périphérique. Ce protocole utilise des plasmides épisomaux et des inhibiteurs d'histone désacétylases pour améliorer le rendement.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l'aide qu'épisomes et les inhibiteurs de HDAC

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