Name: Création anatomique précise et reproductible intracrânienne xénogreffes de tumeurs cérébrales humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Découvrez la création de xénogreffes intracrâniennes précises pour modéliser les tumeurs cérébrales humaines chez la souris. Cette technique chirurgicale permet de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques avec une reproductibilité optimale.

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Dr Keating est financé par CA100335 de subvention DOD et est Boursier de la Fondation de la Saint-Baldrick.

Toutes les procédures décrites ont été examinés et approuvés par notre comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle. 1 plan de l&#39;Expérience <ol><li> Choisir les cellules à injecter. Les cellules provenant de différentes sources sont des candidats pour l&#39;injection: les lignes de culture de cellules adhérentes, les clones génétiquement modifiées, les cellules de neurosphères, de cultures primaires ou de tumeurs ventilées. Le type de modèle désiré définir l&#39;emplacement le plus approprié de l&#39;injection. <ol><li> Déterminer le nombre de cellules pour injection. Le nombre de cellules nécessaires pour former des tumeurs varie en fonction de la lignée cellulaire et doit être déterminée de manière empirique; le taux de croissance tumorale dépend fortement du type de cellule, le nombre de cellules et la culture de tissus nombre de passage. Les nombres de cellules allant de 1 x 10 4 à 2 x 10 5 ou plus par injection ont produit des tumeurs de différents taux de croissance. </li><li> Limiter le volume pour injection. Les cellules doivent être suspendus dans le plus petit volume de milieu sans sérum ou un tampon de phosphate dealine (PBS) qui permet de lisse, passage facile à travers une aiguille 26 G. Plus le volume effectivement administré dans le cerveau, plus précis et défini de la tumeur résultante; les meilleurs résultats sont obtenus en injectant des volumes variant entre 3 et 6 ul. Plan de préparer un volume total final d&#39;au moins 50 pi de cellules en suspension, quel que soit le nombre d&#39;injections prévues, afin de permettre une mesure précise, le mélange et l&#39;échantillonnage. </li></ol></li><li> Choisissez souris approprié pour le modèle. Les modèles murins de tumeurs humaines utilisent généralement les jeunes souris immunodéprimées pour éviter le rejet du greffon immunitaire à médiation. Il n&#39;est pas nécessaire pour le travail de prendre place dans une enceinte de sécurité biologique si des précautions appropriées soient prises, y compris la décontamination, la désinfection et la stérilisation des matériels et équipements. Le travail présenté ici a été fait chez la souris nude athymiques, hommes et femmes, entre 6 et 12 semaines d&#39;âge. Les souris qui pèsent moins de 20 g peut être difficile à positionner en tant quecadre tereotaxic et peut-être plus sensibles à l&#39;hypothermie. </li></ol> 2 Montez l&#39;équipement <ol><li> Obtenir et décontaminer une souris cadre stéréotaxique, console d&#39;alignement, et support de tête de l&#39;anesthésie au gaz de la souris, pompe à microseringue, pad thermique, l&#39;appareil d&#39;anesthésie, lampe de travail de la fibre optique, et forage rotatif à vitesse variable. Nettoyer et désinfecter tout le matériel. </li><li> Programmer les paramètres d&#39;injection (dont le volume d&#39;injection, le débit, les unités de débit, le type de seringue d&#39;écoulement) et d&#39;autres variables nécessaires pour le fonctionnement de la pompe à seringue. Optimiser les réglages pour chaque modèle particulier. NOTE: Dans ces injections étaient les réglages 3.000 échantillons nl à un taux de 400 nl / min (unités de débit &quot;M&quot;) en utilisant un 25 pi seringue (Device Type &quot;E&quot;) mode dans le non-groupés (&quot;N&quot;). </li><li> Nettoyer une micro-précision avec 26 aiguille G avec plusieurs rinçages d&#39;eau déminéralisée stérile (diH 2 O) et 70% d&#39;éthanol (EtOH), faire un ri finalense avec diH 2 O. Certains, mais pas tous les modèles sont conçus pour être à l&#39;autoclave. Assurez-vous que le mouvement du piston est lisse et libre. </li><li> Obtenir de l&#39;équipement de livraison anesthésie. L&#39;isoflurane est l&#39;anesthésique préféré car il est facile de régler la profondeur et la durée de l&#39;anesthésie. S&#39;assurer que l&#39;appareil de stéréotaxie est équipé d&#39;une fixation de gaz d&#39;anesthésie et de la souris que les tubes et raccords nécessaires sont en place pour délivrer le mélange de gaz de l&#39;appareil d&#39;anesthésie de la souris. </li><li> Outils chirurgicaux autoclave, y compris les ciseaux fine pointe, deux pinces hémostatiques / (avec les dents) pour les sutures, ciseaux, pince à épiler de taille moyenne à moyen et à pointe fine, et au moins deux dentaires forets de 1 mm. Gardez instruments propres au cours de la procédure avec EtOH à 70%, du désinfectant ou un stérilisateur à billes. </li><li> Obtenir l&#39;isoflurane, analgésique, pommade ophtalmique / lubrifiant, un onguent antibiotique, une solution saline, 30% de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2), un antiseptique, et de la cire d&#39;os (si désiré) à partir d&#39;unproduits vétérinaires ou médicaux. Préparation stérile diH 2 O et 70% d&#39;EtOH. Jetables tels que des tampons de gaze, des pansements stériles, sutures, des tampons d&#39;éthanol, coton écouvillons, des gants chirurgicaux stériles, lames chirurgicales et plus sont détaillés dans la liste des matériaux. Un marqueur permanent pointe fine pour marquer le crâne doit être décontaminé et destiné à un usage chirurgical. </li></ol> 3 Préparer les cellules pour injection <ol><li> Dans les expériences présentées ici, sélectionnez une lignée de cellules humaines immortalisées GBM. Déterminer le nombre de cellules (2 x 10 5) et le volume de la suspension à injecter (3 pi) de façon empirique; les détails peuvent varier avec le type de cellule. Utiliser un volume d&#39;au moins 50 pi pour faciliter précis de mesure, le mélange et l&#39;injection. </li><li> Traitement à la trypsine et remettre en suspension dans les médias ou PBS. Effectuez les étapes suivantes juste avant l&#39;injection de cellules: <ol><li> Retirez le support de cellules par aspiration et rincer avec 10 ml de PBS par plaque de 100 mm; enlever PBS. </li><li> Annonced 1 ml de trypsine à chaque plaque de 100 mm et incuber à température ambiante juste assez longtemps pour obtenir une suspension cellulaire unique. </li><li> Arrêter l&#39;activité de la trypsine avec 5 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum bovin fœtal (FBS) par plaque de 100 mm. </li><li> cellules de pellets par centrifugation à 450 xg et remettre en suspension dans ~ 5 ml DMEM dépourvu de sérum (SF-DMEM) par plaque de 100 mm. </li><li> Compter les cellules viables en utilisant un hématimètre ou un compteur de cellules automatisé. </li><li> Ajuster la densité de cellules vivantes à 2 x 10 5 cellules / pl 3 (ou comme déterminé par expérimentation) par la granulation des cellules et remise en suspension dans du milieu DMEM SF-. </li></ol></li><li> Maintenir les cellules dans de la glace ou un pack de froid (ne pas laisser les cellules de gel). Mélanger doucement en tapotant du doigt. </li></ol> 4. Anesthetize et préparer souris pour la chirurgie <ol><li> Induire une anesthésie à l&#39;aide ~ 5% d&#39;isoflurane (oxygène flux ~ 2 L / min) ou comme dirigé par un vétérinaire. Induction devrait prendre 2 à 3 min. Maintenir la souris à une profondeur suffisantede l&#39;anesthésie avec ~ 3% d&#39;isoflurane. <ol><li> Contrôler la profondeur de l&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil, ajuster l&#39;isoflurane si indiqué et continuer à surveiller la respiration et des orteils réaction au pincement tout au long de la procédure. Couvrir la souris avec des tampons de gaze pour plus de chaleur et de surveiller régulièrement la souris tout au long de la procédure, qui peut prendre 45 min à 1 h, en fonction de la vitesse d&#39;injection. </li></ol></li><li> Placez la souris dans un cadre stéréotaxique avec soin en glissant la barre de palais sur la langue et dans la bouche. Accrocher les incisives dans le trou de la dent. Utilisez barres d&#39;oreilles à stabiliser la tête, avec la surface oreille à l&#39;œil le plus près horizontale que possible. Ne forcez pas les bars dans le conduit auditif. Il est essentiel de positionner la tête en toute sécurité: vérifier mouvement d&#39;un côté à l&#39;autre et va-et-vient du bout des doigts. Utilisez les commandes réglables de l&#39;appareil de stéréotaxie pour optimiser ajustement. </li><li> Lubrifier les yeux avec pommade ophtalmique. Nettoyer la peau entre les oreilles et les yeux deux fois avec les applications alternées d&#39;une povidone-iodine antiseptique et 70% d&#39;EtOH. </li><li> Injecter par voie sous cutanée analgésique choisi (SQ) dans le flanc (ou selon les directives). </li></ol> 5 Effectuez injection <ol><li> Déterminer le point d&#39;injection. Le site d&#39;injection peut varier en fonction de la taille et de la souche de la souris et du type de cellule. Cellules injectées trop près des ventricules peuvent conduire à cranio-spinale propagation de la maladie. Cellules injectées trop peu profonde peuvent se développer à travers le trajet de l&#39;aiguille. REMARQUE: Dans les expériences présentées ici, la cible est définie comme la région frontale du cortex cérébral d&#39;un site de 2,5 mm latéral (à droite), à 1,5 mm en avant, et de 3,5 mm ventral par rapport au bregma a été choisie (figure 1), la production d&#39; une tumeur du cerveau moyen chez les souris allant de 20 à 30 g. </li><li> Faire une petite incision (~ 8 mm de longueur) en utilisant une technique stérile à travers la peau de la tête pour exposer le bregma et le site d&#39;injection. Une coupe en diagonale, à partir d&#39;un point situé entre l&#39;axe de la ligne médiane et l&#39;œil droit vers l&#39;oreille droite ( <strong&gt; La figure 2) permet d&#39;accéder à la fois au bregma et le site d&#39;injection. </li><li> Rétracter la peau et utiliser un coton-tige stérile pour sécher la surface du crâne. Éponger l&#39;os avec un autre coton-tige imbibé d&#39;H 2 O 2 pour visualiser bregma. L&#39;H 2 O 2 se produire des bulles d&#39;oxygène, en laissant de minces lignes de mousse blanche le long des sutures coronale et sagittale qui se coupent au bregma. </li><li> Verrouiller une seringue vide avec une aiguille sur la micro-pompe et manœuvrer la pointe de l&#39;aiguille directement sur le bregma; les coordonnées de l&#39;ensemble console d&#39;alignement à 0,0 mm latéral, 0,0 mm antérieur / postérieur, et 0,0 mm ventral / dorsal. </li><li> Déplacer l&#39;aiguille de 2,5 mm latéral (à droite) et 1,5 mm en avant par rapport au bregma (ou emplacement désiré) en utilisant les boutons de commande de l&#39;appareil de stéréotaxie. Soulevez légèrement la seringue et marquer l&#39;emplacement exact sur le crâne avec un stylo-feutre dédié. Si la surface externe du crâne se trouve pas sur un plan de niveau avec bregma (i.e., la dorsale / ventrale coordonner plus lit zéro), réinitialiser le ventral / dorsal sur 0,0 à veiller à ce que la profondeur de l&#39;injection n&#39;est pas déplacé. </li><li> Percez un petit trou dans le crâne avec un forage rotatif portatif équipé d&#39;une pointe dentaire stérile sur le site approprié marqué avec le stylo dans l&#39;étape 5.5. Tenir la perceuse à un angle par rapport au crâne et toucher très doucement la pointe de l&#39;os. Répéter au besoin. Perçage presque, mais pas complètement à travers l&#39;os, en laissant l&#39;aiguille à pénétrer effectivement cette couche du crâne, des résultats de l&#39;injection propre. </li><li> Enlevez la poussière d&#39;os avec un coton-tige imbibé dans du PBS ou une solution saline. Retour à la seringue de la pompe et abaisser l&#39;aiguille vers le bas dans le trou de trépan pour confirmer l&#39;emplacement. Si le trou de trépan n&#39;est pas centré avec l&#39;aiguille, utiliser la perceuse pour agrandir l&#39;ouverture. </li><li> Mélanger délicatement la suspension de cellules et d&#39;en tirer les cellules dans la seringue en utilisant le contrôleur de pompe. Éviter les bulles et les touffes et essuyez l&#39;esprit de l&#39;aiguilleh d&#39;un tampon imbibé d&#39;alcool pour éliminer les cellules contaminantes sur la surface extérieure. Si la seringue / aiguille est bouché ou gelé, retirez rapidement et propre avec de l&#39;eau stérile et EtOH à 70%. </li><li> Abaissez l&#39;aiguille au niveau de la surface du crâne (0.0 mm ventral / dorsal). Puis lentement (environ 1 min) abaisser l&#39;aiguille pour percer à travers toute l&#39;épaisseur du crâne et du cerveau pénétrer à une profondeur de 4 mm ventrall. Retirer l&#39;aiguille lentement à 3,5 mm ventral. Si la tête de la souris est maintenu en l&#39;unité stéréotaxique, il devrait y avoir presque aucun mouvement du crâne. </li><li> Assurez-vous que les paramètres corrects sont entrés dans le contrôleur de pompe (section 2.2) et appuyez sur &quot;RUN / STOP&quot; (ou comme dirigé par le manuel du produit) à autoinject cellules. Surveiller la souris et ajuster l&#39;isoflurane si indiqué. Voir la seringue et faire en sorte que le piston se déplace dans le canon. Mouvement gelé ou obstrué peut entraîner un penchant / piston cassé. </li><li> Attendre 1 à 2 minutes avec l&#39;aiguille dans le bpluie, alors très lentement (plus de 3 à 4 minutes) retirer l&#39;aiguille du tissu. Le temps total pour retirer l&#39;aiguille après l&#39;injection est terminée est de 5 min. Utilisez un coton-tige pour effacer la zone autour du trou de trépan; laisser les bords de la peau ouverte pour permettre à l&#39;os de sécher. </li><li> Retirez la seringue de la pompe et rincer rapidement 3x avec H 2 O stérile, 3x avec 70% EtOH, et 3x avec H 2 O stérile (ou comme dirigé par machine). Essuyez aiguille avec de l&#39;EtOH et mettre de côté. </li><li> Appliquez la cire d&#39;os stérile (équivalent à 1 ou 2 pi) au trou de trépan et utiliser le bout de bois d&#39;un coton-tige stérile de tasser la cire sur et dans l&#39;os. Si la surface est séchée correctement, il devrait s&#39;en tenir. </li><li> Étaler champ stérile sur la souris et les objets environnants et suturer l&#39;incision; trois points devraient suffire. En variante, l&#39;adhésif chirurgical peut être utilisé. Appliquer un antibiotique topique. </li><li> Réduire l&#39;isoflurane à 0% et de supprimer la souris de l&#39;unité stéréotaxique, étant careful à protéger les dents. Vérifiez les oreilles, la bouche et la langue. </li><li> Surveiller la souris en suivant de près l&#39;injection. Placez la souris sur un coussin chauffant pendant 5 à 10 min; puis transfert à cage (sur le pavé de la chaleur) et d&#39;observer jusqu&#39;à ce que la souris se réveille et est ambulatoire. Ne laissez pas la souris sans surveillance tant qu&#39;il a retrouvé assez de conscience pour maintenir la position couchée sternale. Ne pas retourner la souris pour la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. Envisager l&#39;utilisation d&#39;analgésique supplémentaire si des signes de douleur sont remarqués. </li></ol> 6 Terminer et surveiller le rétablissement et le développement de tumeurs <ol><li> Nettoyer tous les instruments et les équipements utilisant EtOH à 70%, un stérilisateur à bille ou un désinfectant entre les souris. </li><li> Surveiller les souris injectées pendant deux jours après la procédure de signes de douleur, infection ou d&#39;autres complications. Injecter analgésique à 24 et 48 h (ou comme indiqué) après l&#39;intervention. Retirer les sutures à 7 à 10 jours, si nécessaire. </li><li> Évaluer la souris pour les signes cliniques de la maladie, paralysis, diminution de l&#39;activité, la perte de poids, des convulsions ou une maladie générale. </li><li> Suivre l&#39;évolution de la tumeur par la méthode appropriée [imagerie par résonance magnétique (IRM), in vivo Imaging Systems (IVIS), etc]. </li></ol>

<ol><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).</li>
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<li>Thaci, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+study+of+neural+stem+cell-based+cell+carrier+for+oncolytic+virotherapy%3A+targeted+delivery+of+the+therapeutic+payload+in+an+orthotopic+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model.</a> Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+orthotopic+glioma+xenografts+recapitulate+infiltrative+growth+and+isocitrate+dehydrogenase+I+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation.</a> J. Vis. Exp. (83), (2014).</li>
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<li>Iwami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+intracranial+injection+via+the+postglenoid+foramen+for+brain+tumor+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models.</a> Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Des modèles de souris orthotopique de cancer du cerveau humain peut être un excellent outil pour évaluer l&#39;efficacité des thérapies cliniques, mais des précautions doivent être prises pour optimiser le placement des cellules dans les tissus du cerveau. Des études ont montré que le volume des aliquotes excessives, la technique d&#39;injection sous-optimale et des débits d&#39;injection précipités peuvent conduire à une perméabilité et l&#39;apparition de cellules tumorales dans des endroits indésirables (ventricules,...

Des études in vitro de cellules tumorales du cerveau sont précieux pour disséquer les mécanismes moléculaires croissance, la survie, la migration et l&#39;invasion des cellules cancéreuses d&#39;entraînement; expériences sur des cellules en culture peuvent définir des voies de signalisation, de proposer des cibles thérapeutiques potentielles, et de caractériser la réponse cellulaire à un traitement médicamenteux. Mais systèmes in vitro sont beaucoup trop simpliste pour prédire la réponse organismal aux produits pharmaceutiques; ils n&#39;ont pas les réactions physiologiques, les réponses immunitaires, microenvironnement cellulaire, et l&#39;hétérogénéité globale des systèmes d&#39;animaux vivants. Génétiquement modifiés modèles peuvent être très précieux, lorsqu&#39;ils sont disponibles, mais les différences moléculaires exister entre les espèces et les cellules murines peut pas récapituler les événements dans les processus humains, ce qui entraîne des différences significatives lorsque l&#39;on compare les modèles animaux à des observations cliniques 1. Des modèles de xénogreffes de souris portant sous-cutanée (SQ) injection de lignées de cellules tumorales du cerveau humain sous la peau du flanc sont faciles à réaliseret mesurer; ils peuvent être utilisés pour étudier les effets de la modification du gène et l&#39;administration du médicament / distribution, le métabolisme et la toxicité. Inconvénients importants, cependant, limitent l&#39;utilité des modèles de la SQ. Le microenvironnement récapituler ne pas celle d&#39;une tumeur du cerveau d&#39;origine naturelle: les interactions entre les différents types de tissus et de cellules; la vascularisation locale, et une myriade d&#39;autres facteurs propres à le cerveau ne peuvent pas être répliquées. Pour reproduire plus fidèlement le milieu unique d&#39;une tumeur au cerveau naturel et de tester les effets des interventions pharmaceutiques, un modèle orthotopique de la souris doit être utilisé. En outre, les techniques orthotopiques peuvent être utilisés dans le cadre d&#39;une approche transgénique dans lequel les cellules non-cancéreuses humaines primaires (différenciées ou progénitrices) sont génétiquement modifiés et injecté dans le site approprié de la souris, avec ou sans cellules de stroma humaines, ce qui entraîne dans la tumorigenèse similaire à celle observée chez l&#39;homme 1. Cet article décritune méthode pour créer de manière précise et reproductible des tumeurs du cerveau chez les souris. En utilisant cette technique, l&#39;utilisateur peut injecter avec précision une petite aliquote de cellules en suspension dans un emplacement déterminé de la région fronto-pariéto-temporales du cortex cérébral de souris. Mortalité de la souris est extrêmement faible; dans nos mains, pas de souris sont mortes de complications chirurgicales après 185 procédures. Les caractéristiques de la tumeur résultante peut être comparée avec celle des tumeurs cliniques humains typiques; par exemple: la rapidité de la croissance, degré de nécrose, l&#39;étendue de l&#39;invasion, l&#39;hétérogénéité de type cellulaire, la présence de cellules en mitose, les marqueurs de prolifération et de l&#39;apoptose, etc lignées cellulaires ou des échantillons ventilées de tissus ou tumeurs humaines peuvent être évalués en fonction de leur capacité à simuler la présentation clinique actuelle. Pharmaceuticals, sélectionnés en fonction de leur performance en culture cellulaire, peut être testé dans le cadre d&#39;un métabolisme de fonctionnement, le système circulatoire, et barrière hémato-encéphalique, telles qu&#39;elles existent dans un esprit animal chargéha tumeur, le tout dans un contexte architectural pertinent. En outre, les cellules choisies pour injection peuvent être génétiquement modifiés pour étudier l&#39;impact de passes rabattues spécifiques, suppressions, knock-in, mutations, etc sur la croissance tumorale et la survie. Un certain nombre de publications de documenter les études de tumeurs en utilisant une variété de techniques intracrâniennes. Yamada et al. Fait une étude détaillée de l&#39;injection de colorant et de cellules U87 et a constaté que le taux de minimiser le volume et l&#39;injection a produit le meilleur tumeur 2. . Brooks et al ont trouvé une reproductibilité supérieure et l&#39;efficacité au moyen d&#39;un injecteur commandé par microprocesseur plutôt que d&#39;un procédé manuel pour fournir les vecteurs viraux; leurs conclusions sur les paramètres d&#39;injection optimales sont applicables à la prestation de la cellule 3. Shankavaram et al. Ont montré que le glioblastome multiforme (GBM) lignées de cellules injectées orthotopique (en utilisant une méthode manuelle) dans le cerveau a récapitulé le profil d&#39;expression génique de la cltumeurs inical plus étroitement que ce soit dans les xénogreffes in vitro ou la SQ, ​​en soutenant l&#39;utilisation de modèles intracrâniennes pour les études précliniques 4. Giannini et al. Cellules à partir de spécimens chirurgicaux humains qui avaient été subies dans les flancs de souris nude par passage en série dans le cerveau de souris supplémentaires injecté, et a montré que cette approche conservé patients altérations du gène de la tumeur dans le modèle 5. Des résultats similaires ont été rapportés par Yi et al 6. En utilisant une configuration stéréotaxique, site d&#39;injection soigneusement défini, et une vitesse d&#39;injection lente et régulière, ils ont obtenu des tumeurs cérébrales reproductibles avec des taux de croissance élevé et uniforme (100%) le taux de prise de greffe. La validité de cette technique a donc été bien établie; une recherche de la littérature suggère que les applications de cette technique sont nombreux. Carty et al. Utilisé injections intracrâniennes à mener à bien des vecteurs viraux exprimant des gènes thérapeutiques dans le cortex frontal de transgenic modèle de la maladie d&#39;Alzheimer 7. Thaci et al. Décrit l&#39;utilisation d&#39;injections intracrâniennes à fournir un adenovirus oncolytiques thérapeutique dans un support à base neurale des cellules souches dans des souris nude portant des tumeurs de glioblastome orthotopique déjà injectées 8. De toute évidence, les injections intra-crâniennes sont un outil polyvalent et efficace pour la recherche préclinique. Publications antérieures dans The Journal of Experiments visualisées décrivent approches fondamentales 9-11, mais nous prenons le concept de l&#39;injection de tumeur intracrânienne et la modélisation orthotopique à un niveau supérieur de précision utilisant la technologie facile à maîtriser.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Instrument stéréotaxique pour petits animaux avec console d’affichage numérique</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ear Bars</td><td>Kopf</td><td>Medel 922</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur à fibre optique</td><td>Fisher</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Microprocesseur Micro4</td><td>WPI</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse rotative à main à vitesse variable</td><td>Dremel</td><td>Model 300</td><td></td></tr><tr><td>Mèche dentaire, 1,0 mm</td><td>514554</td><td></td>de <td>pulvérisation</td></tr><tr><td>Adaptateur pour mèche dentaire : pince de serrage 3/32 pouce</td><td>Dremel</td><td>481</td><td></td></tr><tr><td>Coussin</td><td></td><td></td> chauffant <td>pour souris</td></tr><tr>Système <td></td><td></td> de <td>vaporisation d’isoflurane</td><td>pour souris</td></tr><tr><td>Tubes et connecteurs</td><td></td><td></td> médicaux <td>pour connecter le vaporisateur d’isoflurane avec cadre</td></tr><tr> stéréotaxique<td colspan="4">Instruments</td></tr><tr><td>Precision 25 &mu ; l microseringue</td><td>Hamilton&nbsp ;</td><td>7636-01</td><td>Modèle 702, sans aiguille</td></tr><tr><td>Aiguilles de microseringue, 26s G</td><td>Hamilton&nbsp ;</td><td>7804-04</td><td>RN, pointe de 25 mm style 2</td></tr><tr><td>Ciseaux à pointe fine (droits, tranchants/tranchants)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux standard de taille moyenne Pince</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>dentelée standard</td></tr><tr><td>Hémostatiques dentelés (2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td> à pointe fine</tr><tr><td colspan="4">Fournitures</td></tr><tr><td>Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td><td>MWI</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Lames chirurgicales #10, inox (Feather)</td><td>Fisher</td><td>296#10</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)&nbsp ;</td><td>VetOne&nbsp ;</td><td>NDC 13985-528-60</td><td>Article #502017. Anesthésique par inhalation de liquide. La loi fédérale restreint l’utilisation de ce médicament par ou sur l’ordre d’un vétérinaire agréé.</td></tr><tr><td>Carprofène (Rimadyl injectable 50 mg/ml)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 61106-8507-01</td><td>dilué dans une solution saline</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique (larmes artificielles)</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique topique (AK-Poly-Bac)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-238-35</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iode antiseptique topique, 10 % (Bétadine)</td><td>Bétadine</td><td>NDC 67618-150-04</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène, 30 %</td><td>Pêcheur</td><td>H325-100</td><td>pour la visualisation des repères du crâne</td></tr><tr><td>Saline stérile</td><td>VetOne&nbsp ; &nbsp ;</td><td>NDC 13985-807-25</td><td>pour les solutions de dilution, le nettoyage des tissus</td></tr><tr><td>Cire d’os</td><td>WPI</td><td>Article #501771</td><td></td></tr><tr><td>Champs stériles</td><td>McKesson</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Gants chirurgicaux stériles</td><td>McKesson</td> <td>(sur mesure)</td><td></td></tr><tr><td>Compresses de gaze stériles, 2 x 2</td><td>Fisherbrand&nbsp ;</td><td></td><td></td>22028556</tr><tr><td>Compresses de gaze stériles, 4 x 4</td><td>Fisherbrand&nbsp ;</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Tampons de préparation à l’alcool (moyen)</td><td>PDI</td><td>B603</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs stériles à embout de coton</td><td>Fisherbrand&nbsp ;</td><td>23-400-114</td><td></td></tr><tr><td>Tube stérile à bouchon à vis de 0,5 ml avec bouchons pour cellules</td><td>USA Scientific</td><td>1405-4700</td><td>pour cellules</td></tr><tr><td>Pipettes stériles à distribution Fisher</td><td></td><td>BD 357575</td><td>pour solutions de nettoyage d’aiguilles</td></tr><tr><td>BD Seringues à insuline avec aiguilles&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>329461</td><td>pour analgésique</td></tr><tr><td>70 % Éthanol</td><td></td><td></td><td>pour le nettoyage</td></tr><tr><td>DiH2O</td><td></td><td></td> stérile <td>pour le nettoyage</td></tr><tr><td>Tubes Microfuge pour solutions</td><td></td><td></td> de <td>nettoyage pour solutions de nettoyage d’aiguilles</td></tr><tr><td>Feutre (dédié)</td><td></td><td></td> <td>pour le marquage du crâne</td></tr></tbody></table>

création anatomique précise et reproductible intracrânienne xénogreffes de tumeurs cérébrales humaines

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Des modèles de tumeur orthotopique sont actuellement la meilleure façon d&#39;étudier les caractéristiques d&#39;un type de tumeur, avec ou sans intervention, dans le cadre d&#39;un animal vivant - en particulier dans les sites avec des qualités physiologiques et architecturaux uniques tels que le cerveau in vitro et des modèles ectopiques peuvent pas. tenir compte des caractéristiques telles que le système vasculaire, barrière hémato-encéphalique, le métabolisme, l&#39;administration de médicaments et de toxicité, et une foule d&#39;autres facteurs pertinents. Modèles orthotopiques ont leurs limites aussi, mais avec les cellules tumorales appropriées technique d&#39;intérêt peuvent être greffées dans le tissu avec précision qui imite le plus étroitement des conditions dans le cerveau humain. En employant des méthodes qui fournissent des volumes mesurés précisément à définir avec précision les lieux à un taux constant et la pression, des modèles murins de tumeurs cérébrales humaines avec des taux de croissance prévisibles peuvent être créés de façon reproductible et sont appropriés pour une analyse fiable des diverses interventions. Le protocole décrit ici met l&#39;accent sur la techniques détails de la conception et de la préparation d&#39;une injection intracrânienne, d&#39;effectuer la chirurgie, et d&#39;assurer la croissance tumorale efficace et reproductible et offre des points de départ pour une variété de conditions qui peuvent être personnalisés pour une gamme de modèles de tumeurs cérébrales différentes.

Xénogreffes intracrâniennes fiables peuvent être créés avec cette technique décrite. Identifier les structures critiques du crâne de la souris (figure 1) va permettre la reconnaissance de la bregma et guider le chercheur à un endroit précis de l'injection et reproductible. Dans ces études, la lignée parentale U251, cellules U251 transfectées avec la luciférase (U251-Luc), ou U87 immortalisé des cellules de culture de tissus GBM humains ont été suspendues en 4 à 6 pi de SF-DMEM et injecté 2,5 mm latéral ...

Le cerveau est un site unique avec des qualités qui ne sont pas bien représentés par des analyses in vitro ou extra-utérines. Des modèles de souris orthotopique avec l&#39;emplacement et les caractéristiques de croissance et reproductibles peuvent être créés de manière fiable avec des injections intracrâniennes en utilisant un instrument stéréotaxique de fixation et d&#39;une pompe à seringue à basse pression.

Création anatomique précise et reproductible intracrânienne xénogreffes de tumeurs cérébrales humaines

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

L’objectif global de cette procédure est de créer un modèle cohérent et reproductible de tumeur cérébrale humaine qui peut être utilisé pour tester et comparer avec précision de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ceci est accompli en préparant l’animal pour la chirurgie et en localisant le bon site d’injection. Une fois localisé, un trou est percé dans le crâne et une seringue est abaissée à la bonne profondeur.Pour obtenir la croissance tumorale, les cellules sont ensuite injectées de manière lente et contrôlée, suivie d’un retrait retardé et progressif de l’aiguille. En fin de compte, un modèle murin cohérent avec une croissance tumorale histopathologiquement similaire à la condition humaine peut être développé et les taux de croissance peuvent être mesurés par Lucci sur la base de l’imagerie in vivo. La précision de cette technique est essentielle pour comprendre de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les tumeurs cérébrales humaines.La localisation variable de l’injection tumorale peut entraîner des changements dans la croissance tumorale qui sont dus au microenvironnement, à l’administration de médicaments ou à d’autres choses qui varient considérablement entre les différentes zones du cerveau. La démonstration visuelle de cette méthode est importante car les étapes impliquant le positionnement de la souris et la localisation du site d’injection nécessitent des manipulations tridimensionnelles, qui ne sont pas facilement décrites sous forme écrite ou graphique. Pour commencer, nettoyez et décontaminez un cadre stéréotaxique de souris et tout autre équipement nécessaire à la chirurgie.Utilisation de paramètres optimisés pour le programme choisi par le modèle, les paramètres d’injection et d’autres variables pour le fonctionnement du pousse-seringue. Ensuite, disposez les outils chirurgicaux de l’autoclave dans la zone de travail, y compris au moins deux forets dentaires de 1,0 millimètre pour les procédures en série. Désinfectez les instruments chirurgicaux avec de l’éthanol à 70 %, suivi de 30 secondes dans un stérilisateur à billes entre chaque animal ou selon les conseils de vos protocoles IACUC.Enfin, rassemblez toutes les fournitures médicales et le matériel jetable nécessaires Une pointe fine, marqueur permanent pour le marquage du crâne, doit être décontaminée et dédiée à un usage chirurgical. Après trypsine resus, suspendre les cellules dans le PBS et les granuler par centrifugation Resus. Suspendez les cellules dans environ cinq millilitres de dmem sans sérum par plaque de 100 millimètres.Ensuite, comptez les cellules viables à l’aide d’un hémomètre, d’un cytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Après le comptage, ajustez la densité des cellules vivantes en granulant les cellules et en suspendant un DMT SF. Gardez les cellules réfrigérées sur de la glace ou un bloc réfrigérant, mais ne laissez pas les cellules geler.Mélangez doucement en effleurant les doigts, induisez une anesthésie animale et confirmez que l’animal est suffisamment sédaté en vérifiant le réflexe d’écriture ou le manque d’activité. Une fois anesthésiée, couvrez la souris avec des tampons de gaze pour plus de chaleur et surveillez régulièrement l’animal tout au long de la procédure. Ensuite, positionnez la souris dans un cadre stéréotaxique.À l’aide de la barre de palette et des barres d’oreille, essayez de garder la surface de l’oreille à l’œil aussi horizontale que possible. Enfin, lubrifiez les yeux avec une pommade ophtalmique et nettoyez deux fois la peau entre les oreilles et les yeux en alternant les applications d’un antiseptique à base de povidone iodée et d’éthanol à 70 %. Après avoir injecté un analgésique par voie sous-cutanée, confirmez que l’animal est complètement anesthésié en vérifiant le réflexe de pincement de l’orteil.Immédiatement avant l’incision cutanée, faites une petite incision pour exposer le BMA et le site d’injection. Une coupe diagonale à partir d’un point situé entre l’axe médian et l’œil droit vers l’oreille droite permet d’axiser à la fois le bgma et le site d’injection. Rétractez la peau et utilisez un coton-tige stérile pour sécher la surface du crâne.Épongez l’os avec un autre écouvillon, humidifié avec du peroxyde d’hydrogène. Pour visualiser bgma, verrouillez une seringue vide avec l’aiguille dans la micro-pompe et manœuvrez l’embout directement sur la bgma. Mettez à zéro les coordonnées sur la console d’alignement.Déplacez l’aiguille à 2,5 millimètres sur le côté et 1,5 millimètres vers l’avant avec respect. Torema. À l’aide des boutons de commande de l’unité stéréotaxique, soulevez légèrement la seringue et marquez l’emplacement exact sur le crâne avec un feutre dédié. Stylo. Si la surface externe du crâne n’est plus au niveau de bgma dans le plan dorsal, réinitialisez la lecture ventrale dorsale à zéro pour vous assurer que la profondeur de l’injection est correcte.Percez un petit trou dans le crâne à l’aide d’une perceuse rotative portative munie d’un embout dentaire stérile. Tenez la perceuse à un angle par rapport au crâne et touchez très doucement la pointe à l’os. Arrêtez-vous de percer complètement l’os.L’injection la plus propre avec le moins de traumatisme est obtenue. Lorsque le crâne est percé avec l’aiguille de la seringue lors de l’injection cellulaire, retirez la poussière d’os avec un coton-tige imbibé de PBS ou de solution saline. Remettez la seringue dans la pompe et abaissez l’aiguille directement vers le trou de la fraise.Pour confirmer l’emplacement, mélangez doucement la suspension cellulaire et aspirez les cellules dans la seringue. À l’aide du contrôleur de pompe, évitez les bulles et les grumeaux et essuyez l’aiguille avec un tampon imbibé d’alcool. Pour éliminer les cellules contaminantes sur la surface externe, abaissez l’aiguille au niveau de la surface du crâne.Abaissez ensuite lentement l’aiguille. Percez toute l’épaisseur du crâne et pénétrez le cerveau à une profondeur de quatre millimètres ventralement au cours d’une minute, avant de retirer lentement l’aiguille à 3,5 millimètres ventral, confirmez que les paramètres corrects sont entrés dans le contrôleur de pompe et appuyez sur exécuter. Arrêter. Pour auto-injecter les cellules, surveillez la seringue et assurez-vous que le piston se déplace dans le cylindre.Laissez l’aiguille en place pendant une à deux minutes avant de retirer très lentement l’aiguille du tissu. L’aiguille doit être retirée au bout de cinq minutes. Utilisez un coton-tige pour éponger la zone autour du trou de la fraise et laissez les bords de la peau ouverts pour permettre à l’os de sécher.Retirez la seringue de la pompe et remplissez-la rapidement d’eau stérile et d’éthanol. Ensuite, appliquez de la cire d’os stérile sur le trou de la fraise et utilisez l’extrémité en bois d’un coton-tige stérile pour tasser la cire sur et dans l’os. Si la surface est correctement séchée, elle doit coller Après avoir suturé la plaie, réduisez l’épaisseur de fluor à 0 % et retirez la souris de l’unité stéréotaxique.Placez l’animal sur une surface chauffée et observez-le jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Il est important de nettoyer tous les instruments et équipements avec de l’éthanol à 70 % et un stérilisateur à billes ou de désinfecter entre chaque animal. Les souris injectées doivent être surveillées pendant deux jours après la procédure pour détecter des signes de douleur, d’infection ou d’autres complications.Évaluez les souris pour détecter des signes cliniques de paralysie de la maladie, de diminution de l’activité, de perte de poids, de convulsions ou de maladie générale au moment souhaité. Points après l’injection, surveiller le développement de la tumeur par imagerie par résonance magnétique ou systèmes d’imagerie in vivo. Ces images pondérées MRIT comparent une tumeur dérivée de cellules U 87 avec la tumeur dérivée de cellules U2 51.Les volumes tumoraux tracés dans le temps montrent une fenêtre reproductible de développement et de croissance tumorale qui est cohérente dans toutes les expériences. Une image IVIS de U2 51 lucifers Des cellules GBM transduites injectées intracrâniennes dans des souris nues, révèle que la souris de gauche a été injectée avec succès et montre un signal vocalisé très fort à l’endroit souhaité. Alors que la souris à droite montre un résultat infructueux en raison d’un emplacement ou d’une technique d’injection inappropriés.La taille de la tumeur est estimée à partir de l’activité de Lucifer dans la région cérébrale d’intérêt et tracée dans le temps. La ligne bleue correspond à la souris avec une injection intracrânienne réussie tandis que la ligne rouge correspond à la souris avec un déplacement des cellules tumorales vers la colonne vertébrale après h et e la coloration de la tumeur à partir de cellules U 87 GBM montre une zone de croissance tumorale dense et de tissu cérébral normal adjacent avec une invasion microscopique de cellules malignes. Cette section du centre d’une tumeur dérivée des cellules U2 51 GBM réplique très fidèlement l’histopathologie bizarre avec des cellules malignes multinucléées observées dans le GBM humain typique.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la reproductibilité du modèle tumoral dépend du positionnement précis et sûr de la tête de la souris et de la localisation cohérente du site d’injection. De plus, un taux progressif et une pression d’injection constante sont essentiels. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la neuro-oncologie d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les tumeurs cérébrales humaines tout en éliminant une partie de la variabilité aggravée par la localisation imprécise de l’injection de cellules tumorales cérébrales.

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Création anatomique précise et reproductible intracrânienne xénogreffes de tumeurs cérébrales humaines

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