Les méthodes de mesures de capacité cellulaires attaché à la souris surrénales chromaffines cellule

L’objectif global de cette procédure est de détecter une vésicule unique, une cytose et une endocytose. Ceci est accompli en obtenant d’abord une digestion propre et complète du tissu de la glande surrénale de souris. La deuxième étape consiste à dissocier et à plaquer les cellules des glandes surrénales.

Ensuite, les cellules de chromine sont identifiées et clampées pour obtenir des enregistrements de capacité attachés aux cellules. En fin de compte, une vésicule unique, une cytose et une endocytose peuvent être observées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les enregistrements cellulaires de canaux ioniques uniques, est que nous sommes en mesure de détecter l’exocytose et l’endocytose des vésicules uniques.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile car l’obtention d’un giga seal est difficile à apprendre. De plus, il peut être difficile d’identifier des cellules parmi les types de cellules mixtes trouvées dans la plaque. Pour vous préparer à la chirurgie, commencez par l’autoclave d’une paire de dissections grandes et petites, de ciseaux et de deux paires de pinces.

Placez ensuite le plateau de dissection sur un seau à glace. Commencez également à faire bouillonner la solution enzymatique avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène. La solution est rose vif avant de bouillonner. Prochain.

Après avoir euthanasié et décapité un nouveau-né jusqu’à une souris âgée de trois jours, utilisez le plus petit ensemble de ciseaux pour couper le dos du chiot en suivant la colonne vertébrale de la région cervicale à la région cordale. Assurez-vous de couper superficiellement sous la peau pour éviter de percer la cavité corporelle. Ensuite, retirez la peau de la colonne vertébrale afin que la musculature soit exposée et qu’il y ait une vue dégagée de la colonne vertébrale.

Faites maintenant une coupe trans au niveau de la moelle épinière cervicale, puis faites deux coupes parallèles le long des côtés de la colonne vertébrale avec une paire de pinces tenant le corps principal de l’animal. Utilisez l’autre paire de pinces pour saisir la colonne vertébrale et décoller la colonne vertébrale jusqu’à ce que les reins soient exposés. Après avoir localisé les glandes surrénales sur le dessus des reins, utilisez une pince pour les retirer.

Ensuite, placez soigneusement les glandes surrénales dans un tube conique rempli de solution de verrouillage. Utilisez une deuxième paire de pinces pour déloger les glandes surrénales. S’ils collent à la première paire de pinces, placez le tube conique sur de la glace.

Les glandes peuvent être maintenues en solution de verrouillage jusqu’à deux heures. À ce stade, vérifiez la solution enzymatique pour vous assurer que la solution équilibrée est passée d’une couleur rose vif à une couleur orange rosé. Ensuite, ajoutez du pape à la solution enzymatique fraîchement bouillonnée à une concentration finale de 20 à 25 unités par millilitre.

Ajoutez ensuite la solution d’enzyme de propane dans un nouveau tube conique et utilisez une pince pour transférer les glandes surrénales dans le tube d’enzyme de propane. Incuber les glandes pendant 40 à 60 minutes à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 75 % de solution d’inactivation dans chaque tube et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes supplémentaires.

Après 10 minutes, transférez doucement les glandes dans un tube nouvellement étiqueté et lavez les glandes trois fois avec un milieu de culture. Après le lavage, placez les glandes dans 200 microlitres de milieu de culture, puis titrez doucement les glandes de haut en bas à travers la pointe de la pipette d’une pipette de 200 microlitres. Lors du titrage, maintenez les glandes au fond du tube avec la force vers le bas de la pointe de la pipette de 200 microlitres et engagez le tissu doucement et lentement Assurez-vous d’utiliser des mouvements lents et continus, sans jamais pipeter rapidement ou brusquement après le titrage, ajoutez 250 microlitres supplémentaires de milieu de culture pour porter le volume total du milieu de culture à 450 microlitres.

Ensuite, sept couvercles pré-enduits de PDL de 12 millimètres se glissent dans une plaque de vaisselle de culture de 60 x 50 millimètres. Ensuite, placez 60 microlitres de la solution contenant la cellule sur chacune des sept lamelles. Une fois dressé, placez le plat dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après l’incubation, ajoutez doucement cinq millilitres de milieu de culture préchauffé dans la boîte de culture, puis incubez pendant 24 heures avant d’effectuer des enregistrements attachés aux cellules. Après le lieu d’incubation, le bordereau de couverture de 12 millimètres contenant les cellules surrénales dans la solution extracellulaire. Étant donné que l’ensemble des glandes surrénales a été utilisé, l’étape suivante consiste à différencier les cellules chrominiques et les cellules corticales.

En culture, les cellules chrominiques sont généralement très brillantes avec une coloration beige brunâtre et une forme circulaire presque parfaite. En revanche, les cellules corticales sont plus petites et plus sombres que les cellules CHRO. Après avoir tiré les pipettes patch comme décrit dans le protocole de texte, trempez la pointe de la pipette dans de la cire fondue pour réduire la capacité du verre.

Ensuite, polissez au feu la pointe pour souffler cette cire de l’intérieur de la pointe de la pipette. Ensuite, construisez la pipette avec la solution de pipette patch de sorte que sa résistance soit d’environ deux méga ohms. Fixez la pipette patch à son manipulateur et amenez-la à quelques microns de la cellule.

Continuez à faire avancer la pipette à la recherche d’une légère déformation cellulaire. Une fois la déformation repérée, appliquez une légère aspiration jusqu’à ce qu’une étanchéité giga om soit obtenue. Obtention d’une configuration attachée à une cellule.

Une fois qu’un joint giga om est révélé, effectuez des enregistrements attachés à des cellules à l’aide d’un amplificateur EPC à sept plus patch clamp et d’un amplificateur analogique à verrouillage biphasé comme décrit dans le protocole texte, réglez la phase de l’amplificateur à verrouillage, de sorte que les changements de capacité transitoires produits par une aspiration douce. Les impulsions apparaissent uniquement dans la capacité du patch, ou Im trace sans projection dans le patch, la conductance ou le retracement du processus de patching sert de stimulation mécanique. Étant donné que le courant d’action peut généralement être enregistré à partir de la plupart des cellules, identifiez les changements de capacité typiques par le pas marqué vers le bas.

La dernière étape consiste à enregistrer les données pour une analyse ultérieure. Voici un enregistrement capacitif typique attaché à une cellule avec plusieurs étapes descendantes. Chaque pas vers le bas est associé à une seule endocytose iCal.

Une fois maîtrisée, la culture cellulaire peut être terminée en deux à trois heures, et les enregistrements peuvent être effectués dans les quatre jours suivant son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la transmission synaptique pour explorer le recyclage des vésicules synaptiques dans les cellules chrominiques neuroendocrines.