1.3: Visualisation du calcium dans les neurones

L’imagerie calcique est une technique extrêmement utile pour étudier la variété des rôles que les ions calcium ont dans le fonctionnement des neurones. Les ions calcium génèrent une multitude de signaux intracellulaires qui contrôlent des fonctions clés, telles que la libération de neurotransmetteurs par les vésicules synaptiques. Les méthodes d’imagerie calcique permettent de mesurer directement le flux calcique dynamique dans les neurones et les tissus neuronaux. Cette vidéo donne un aperçu du fonctionnement des colorants indicateurs de calcium, de la réalisation d’une expérience d’imagerie calcique et enfin de certaines des applications de cette technique.

Tout d’abord, passons en revue les principes biochimiques des colorants indicateurs de calcium.

Les colorants indicateurs de calcium sont des molécules chélatrices modifiées, telles que Fura-2, qui sont composées de deux composants principaux. Le premier est le site chélateur qui lie le calcium de manière sélective. Le second est un site fluorescent qui émet de la lumière à une longueur d’onde spécifique lorsqu’il est éclairé par une longueur d’onde d’excitation de la lumière ultraviolette.

La liaison du calcium au colorant modifie ses propriétés de fluorescence, ce qui permet de quantifier les changements de concentration en calcium, qui est représentée ici par la différence d’intensité fluorescente émise par ce neurone à deux longueurs d’onde d’excitation différentes.

La plupart des colorants indicateurs de calcium sont modifiés pour traverser facilement la membrane cellulaire et sont introduits soit dans la solution de bain avec les neurones, soit injectés dans le tissu cérébral pour des études sur l’ensemble de l’animal.

Certains colorants ont des propriétés de double excitation ou de double émission selon que le calcium est lié ou non. Prenons, par exemple, le colorant Fura-2, qui a une longueur d’onde d’excitation différente lorsque le calcium est lié ou lorsqu’il ne l’est pas. En prenant le rapport de l’intensité d’émission aux deux longueurs d’onde d’excitation, une estimation beaucoup plus précise de la concentration en calcium peut être faite.

Les colorants à double excitation ou émission, comme Fura-2, sont appelés indicateurs calciques ratiométriques. Il existe des colorants non ratiométriques qui ont des longueurs d’onde d’excitation et d’émission uniques. Cependant, ils sont plus sensibles au photoblanchiment, c’est-à-dire à l’affaiblissement ou à la perte de fluorescence avec une exposition prolongée à la lumière.

Une étape clé avant d’utiliser un colorant dans une expérience consiste à calibrer les mesures de fluorescence prises sur le colorant avec des solutions de concentrations de calcium connues. Cela permettra aux scientifiques d’estimer avec précision les concentrations de calcium intracellulaire en fonction des intensités d’émission mesurées au cours des expériences.

Maintenant que nous avons appris comment fonctionnent les indicateurs de calcium, explorons comment imager le flux de calcium dans les neurones plaqués.

Commencez par préparer le colorant indicateur de calcium de votre choix, tel que Fura-2, et mélangez-le avec des solutions physiologiques supplémentaires. Vortex est la solution pour assurer un bon mélange. Une fois suffisamment mélangé, transférez dans un plat. Placez maintenant la lamelle avec les neurones cultivés dans le plat avec la solution de colorant. Ensuite, incubez les neurones dans l’obscurité pendant le temps requis à la température appropriée, qui dans ce cas est de 30 minutes à 37 °C. Après la période d’incubation, transférez la lamelle dans un plat sans colorant.

L’étape suivante consiste à monter la lamelle sur la chambre d’imagerie du microscope. Une fois monté, connectez la conduite d’entrée du système de perfusion et remplissez lentement la chambre. Fixez la chambre à la platine du microscope et installez les lignes de perfusion de sortie, en assurant un flux continu dans tout le système de perfusion.

Maintenant que la platine du microscope est prête, faites la mise au point sur les neurones à l’aide de la lumière visible. Testez le colorant en éclairant les cellules aux longueurs d’onde de 340 et 380 nm. Rappelons qu’avec Fura-2, les neurones non activés devraient émettre plus de lumière lorsqu’ils sont excités par 380 nm puisque le calcium n’est pas lié.

Ensuite, ajustez les paramètres de l’appareil photo afin d’optimiser la plage dynamique avant de commencer l’expérience. Collectez une image à chaque longueur d’onde, puis utilisez la région d’intérêt ou l’outil ROI pour mesurer l’intensité de l’arrière-plan à chaque longueur d’onde. Entrez les valeurs d’arrière-plan dans le logiciel de contrôle afin qu’elles puissent être soustraites des images suivantes.

Une fois la configuration initiale terminée, choisissez les cinq champs de vision environ qui doivent être imagés pour l’expérience et enregistrez les coordonnées dans le logiciel de contrôle. Au cours de l’expérience, l’étage automatisé se déplace vers un champ, collecte un rapport de l’intensité du champ aux longueurs d’onde de 340 et 380 nm, et passe au champ suivant jusqu’à ce que tous les champs soient collectés.

Dans certaines expériences, un agent pharmacologique est ajouté au liquide de perfusion qui provoque des changements dans les niveaux de calcium intracellulaires. Une solution riche en potassium, qui dépolarise les neurones, peut provoquer une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium, comme le montre cette série d’images en accéléré, et sert de bon contrôle positif. Une fois la collecte de données terminée, passez à l’analyse.

Pour analyser les résultats, sélectionnez des régions d’intérêt qui incluent des neurones ou des parties de neurones à l’aide du logiciel. Ensuite, utilisez le logiciel pour mesurer les informations d’intensité ratiométrique d’image des deux longueurs d’onde à chaque retour d’intérêt dans toutes les images collectées. À l’aide de ces informations, il est possible de procéder à une évaluation quantitative des changements dans les concentrations de calcium intracellulaire au fil du temps.

Maintenant que vous avez une compréhension de la façon dont l’imagerie calcique dans les neurones est réalisée, examinons quelques-unes des façons dont cette précieuse méthode est appliquée dans la recherche aujourd’hui.

Tout d’abord, l’imagerie calcique est utilisée pour étudier comment le calcium intracellulaire fluctue en relation avec l’activité neuronale.

Dans cette étude, des neurones individuels ont été remplis d’un colorant indicateur de calcium tout en étant enregistrés par patch-clamp. Le contrôle précis du potentiel membranaire rendu possible par la technique du patch-clamp donne un aperçu de la dynamique du flux de calcium.

L’imagerie calcique permet aux chercheurs d’étudier l’activité hautement synchrone du réseau des neurones.

Ici, les neuroscientifiques ont utilisé l’imagerie calcique pour évaluer le signal fluorescent de 40 neurones. Grâce à ces informations, il est possible de déterminer les propriétés du réseau telles que la propagation du signal et les corrélations neuronales.

La dynamique du calcium peut également révéler comment les neurones traitent les signaux du monde extérieur, comme les odeurs.

Dans cette expérience, des organes sensibles aux phéromones extraits du nez d’une souris ont été cultivés. Les neurones à l’intérieur du tissu ont été incubés avec Fura-2 et imagés tout en étant présentés avec des odeurs comme l’urine ou des phéromones purifiées. En manipulant l’expression des protéines réceptrices odorantes dans les neurones olfactifs, il est possible de visualiser directement comment une seule protéine influence la capacité d’une cellule à répondre à des odeurs uniques.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’imagerie calcique dans les neurones. Dans cette vidéo, nous avons discuté des propriétés de la technique et passé en revue une expérience typique.

Compte tenu des nombreux rôles importants du calcium, l’imagerie calcique restera un outil essentiel dans la compréhension des neurones et de la façon dont ils interagissent les uns avec les autres.

Merci d’avoir regardé !