Name: Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Apprenez une méthode d'immunofluorescence quantitative pour mesurer les variations de protéines au centrosome dans des cellules RPE1 fixées. Cette technique permet de normaliser l'intensité fluorescente à l'aide d'un standard interne comme la gamma-tubuline.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (GM77311) et une subvention de démarrage de The Ohio Cancer Research Associates (à H.A.F.). SM a été partiellement soutenu par une bourse Up on the Roof du programme de génétique du cancer humain du Comprehensive Cancer Center de l’Ohio State University.

1. Culture cellulaire <ol><li> Utilisez télomérase humaine transcriptase inverse (hTERT) cellules de l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine immortalisées (hTERT-RPE1; appelle ici RPE1). REMARQUE: les cellules sont des cellules humaines RPE1 quasi-diploïdes, non transformées qui sont couramment utilisés pour étudier ensemble centriole et ciliogenèse. Ces cellules suivent un cycle de duplication normale centriole coordonné avec un cycle cellulaire régulée. </li><li> Passage d&#39;une boîte de 100 mm de culture cellulaire quasi-confluente de cellules RPE1 à 1: 5 dilution de la culture d&#39;origine dans une boîte fraîche de 100 mm contenant 10 ml de DME / F-12 (1: 1) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de streptomycine (milieu complet est désignée sous le DME / F-12). Cultiver les cellules à 37 ° C en présence de 5% CO 2. <ol><li> Incuber 12 mm lamelles de verre rondes dans 50 ml de HCl 1 N dans un bécher de verre couverte, O / N sans agitation, à 60 ° C dans un bain-marie ou incubateur. </li><li> After jeter la solution acide, laver les lamelles trois fois dans 100 ml d&#39;eau distillée par incubation pendant 15 min en agitant de temps. Répéter le lavage de manière similaire dans 70% d&#39;éthanol et 95% d&#39;éthanol. </li><li> Sécher les lamelles couvre-objet en les étalant individuellement sur un papier buvard laboratoire dans une enceinte de sécurité biologique, suivi par une stérilisation avec un rayonnement UV pendant 60 min. </li></ol></li><li> 4.2 Placer les lamelles sec dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm. Diluer la solution de fibronectine ou de la fibronectine comme polymère d&#39;ingénierie (concentration stock de 1 mg / ml) jusqu&#39;à une concentration de 25 ug / ml dans une culture cellulaire PBS. <ol><li> Placez 80-100 ul de la solution diluée sur chaque lamelle et incuber pendant 60 min à enduire le côté haut de la lamelle. Laver les lamelles trois fois en utilisant du PBS avant d&#39;ajouter un milieu complet. </li></ol></li></ol> 2. la croissance de cellules et le traitement des cellules avec des inhibiteurs du protéasome <ol><li> Passage 2 x 10 5 croître de manière asynchroneING RPE1 cellules dans chaque boîte de 35 mm contenant des lamelles couvre-objet et cultiver les cellules dans 2 ml de milieu complet. Remplacez le milieu de culture toutes les 24 heures avec un milieu complet frais préchauffé. <ol><li> Pour analyser l&#39;effet de l&#39;inhibition du protéasome au niveau centrosomale de la protéine de test (ici VDAC3 ou γ-tubuline), poussent les cellules dans deux boîtes de 35 mm pour 44 h. Remplacer le milieu de culture avec du milieu complet et ajouter soit MG115 ou le DMSO en tant que solvant témoin à une concentration finale de 5 uM ou 0,05%, respectivement. Dans le même temps, ajouter BrdU dans les cellules à une concentration finale de 40 uM et on incube les cellules pendant 4 heures. </li><li> Transférer chaque lamelle dans une plaque de 24 puits. Ajouter 500 ul de methanol refroidi dans chaque puits et incuber la plaque à 20 ° C pendant 10 min pour fixer les cellules sur des lamelles couvre-objet. Laver immédiatement les lamelles trois fois avec 500 pi de tampon de lavage (1x PBS contenant 0,5 mM MgCl 2 et 0,05% de Triton X-100). </li></ol></li><li> Récolter les résiduellecellules de la boîte de 35 mm et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min. Utiliser le culot de cellules à analyser la protéine totale par buvardage de Western (étape 6). </li></ol> 3. BrdU Pulse et Chase essai pour analyser les niveaux de protéines dans les différentes phases du cycle cellulaire <ol><li> Pour analyser la variation du niveau d&#39;une protéine (ici VDAC3, SAS6 ou Cep135) à centrosomes à différentes phases du cycle cellulaire, cultiver les cellules dans deux boîtes de 35 mm contenant des lamelles couvre-objet pendant 44 h. Remplacer le milieu de culture avec du milieu complet contenant 40 uM de BrdU et incuber les cellules pendant 4 heures dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> D&#39;un plat, transférer les lamelles à une plaque de 24 puits pour fixer les cellules à l&#39;aide de méthanol glacé comme décrit à l&#39;étape 2.1.2. </li><li> Après l&#39;impulsion de BrdU 4 heures, retirer le milieu contenant BrdU, laver les cellules une fois avec du PBS et une fois avec du milieu complet, ajouter du milieu frais, puis les cellules croître en l&#39;absence de BrdU pendant divers temps (typiquement un autre 4 hpour les cellules RPE1) avant de fixer les cellules comme décrit à l&#39;étape 2.1.2. NOTE: Pour les cellules RPE1, la majorité des cellules positives à la BrdU sont à la fin de S ou G2 phase après une poursuite de 4 heures. Cela doit être déterminé de façon indépendante pour chaque type de cellule. </li></ol> 4. Immunocoloration <ol><li> Incuber les cellules fixées sur des lamelles dans 200 ul de tampon de blocage (2% de BSA et 0,1% de Triton X-100 dans du PBS 1x) pendant 30 min. <ol><li> Incuber les cellules avec un mélange d&#39;anticorps primaires (typiquement chez le lapin a soulevé une et l&#39;autre soulevée dans une souris) dilué dans du tampon de blocage O / N à 4 ° C dans une chambre humidifiée. </li><li> Pour faire une chambre humidifiée, mettre une serviette en papier humide dans la moitié inférieure d&#39;un mille ul boîte de pointe de la pipette vide. Déposer une bande de Parafilm sur la surface de crémaillère, et repérer une gouttelette (15 à 20 pi) de la solution d&#39;anticorps sur le Parafilm pour chaque lamelle à incuber. Inverser une lamelle couvre-objet sur une gouttelette de solution d&#39;anticorps (de sorte que les cellules sont immergées) et à proximitéle couvercle de la boîte de pointe. </li><li> Inversez lamelles encore et les retourner à la boîte de 24 puits. Laver les lamelles couvre-objet, puis les incuber en mélange 150 ul de l&#39;anticorps secondaire (ici colorant anti-lapin conjugué fluorescent vert-rouge et un colorant fluorescent conjugué anti-souris dilué dans du tampon de blocage) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les lamelles trois fois. NOTE: Les anticorps secondaires conjugués fluorophores sont sensibles à la lumière. Protéger les échantillons de la lumière pendant les étapes 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Préparation pour la coloration anti-BrdU en fixant les cellules colorées RPE1 de nouveau avec 500 ul de methanol refroidi à -20 ° C pendant 10 min, comme décrit dans l&#39;étape 2.1.2. Laver les lamelles trois fois. REMARQUE: Cette fixation fixe le primaire et le secondaire marquage de l&#39;anticorps de la protéine (s) d&#39;intérêt au cours du processus d&#39;hydrolyse acide dans l&#39;étape suivante. <ol><li> Incuber les cellules dans 200 ul de HCl 2 N pendant 30 minutes à température ambiante. Neutraliser avec 300 pi de 1 M Tris-Cl, pH 8 uneD laver les cellules trois fois avec le tampon de lavage. </li><li> Bloquer de nouveau les cellules en utilisant 200 ul de tampon de blocage pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps de rat anti-BrdU (dilué dans du tampon de blocage) pendant 45 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée. Retourner les lamelles de retour à l&#39;antenne de 24 puits, lavez-les et puis incuber avec un colorant bleu anticorps secondaire fluorescent conjugué anti-rat (dilué dans 150 pi de tampon de blocage dans un plat de 24 puits pendant 1 heure à température ambiante. </li></ol></li><li> Laver les lamelles trois fois. Repérer une goutte (environ 3-6 pi) d&#39;une solution de montage contenant antifade réactif sur une lame de microscope en verre. Inverser une lamelle couvre-objet, avec la cellule du côté orienté vers le bas, sur la solution de montage. Essuyez l&#39;excès de liquide en appuyant doucement la lamelle contre la diapositive en utilisant des tissus de nettoyage doux. Appliquer le vernis à ongles transparent le long du bord de la lamelle pour la sceller sur la lame de microscope. </li></ol> 5. immunofluorescence image Acquisition et Analyse <ol><li> Utilisez un objectif à immersion d&#39;huile plan 100X Apo (avec une ouverture numérique de 1,4) pour acquérir les images de cellules RPE1 BrdU-positifs à la température ambiante. <ol><li> Placer une lame sur le microscope (voir équipement) attaché avec une caméra capable de l&#39;imagerie numérique. Pour chaque fluorophore, déterminer le temps d&#39;exposition approprié (typiquement entre 300-1000 ms) en examinant manuellement tous les échantillons d&#39;une expérience. Avant l&#39;acquisition des images d&#39;une cellule, déterminer manuellement la partie supérieure appropriée et fond plan focal le long de l&#39;axe Z (en général 0,2 um taille de pas). Acquérir des images de différents échantillons qui sont sur des lamelles séparées en utilisant le temps d&#39;exposition identique pour différents fluorophores le long de l&#39;axe Z en utilisant un logiciel d&#39;imagerie par microscopie numérique. </li></ol></li><li> Effectuer déconvolution (dans ces cas en utilisant l&#39;algorithme Pas de voisin) de toutes les piles d&#39;images acquises le long de l&#39;axe-Z. <ol><li> Obtenir la projection totale de l&#39;intensité de chaque pile d&#39;images le longl&#39;axe-Z. </li></ol></li><li> Dans les cellules où centrosomes sont proches (distance entre deux centrosomes est inférieure à 2 um), dessiner un petit carré (généralement 20 à 30 pixels par côté) autour des deux centrosomes et marquer la zone sélectionnée. <ol><li> Dessinez un carré plus grand (en général de 24 à 35 pixels par côté) entourant la première place et marquer la zone sélectionnée de la grande place. </li><li> Obtenir la zone (A) et l&#39;intensité de fluorescence totale (F) de chaque fluorophore dans chaque boîte (S désigne petite boîte et L désigne grande boîte). </li><li> Analyser le fond corrigé intensité de fluorescence de chaque fluorophore en utilisant la formule décrite par Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x S A / (A L - A S)]. </li><li> Obtenir l&#39;intensité de fluorescence normalisée de la protéine d&#39;intérêt (ici ou VDAC3 SAS6) en calculant le rapport de l&#39;intensité de fluorescence d&#39;arrière-plan corrigé de ses fluorophore à celle du fluorophore utilisé pour le standard interne choisi (ici γ-tubuline, ou SAS6 Cep135). </li></ol></li><li> Dans le cas de l&#39;analyse de cellules où centrosomes sont bien séparées (distance entre deux centrosomes est supérieure à 2 um), analyser séparément chaque centrosome en traçant deux ensembles distincts de boîtes. Dessinez un petit carré (généralement 15 à 25 pixels par côté) autour de chaque centrosome et marquer la zone sélectionnée. Dessinez un carré plus grand (20 à 30 pixels par côté) entourant la première place et marquer la zone sélectionnée. <ol><li> Obtenir la zone (A) et l&#39;intensité de fluorescence totale (F) de chaque fluorophore dans chaque boîte, et de calculer les intensités de fluorescence corrigée fond de chaque fluorophore, séparément pour chaque centrosome, comme décrit à l&#39;étape 5.3.3. </li><li> Combiner les intensités de fluorescence de fond corrigé de chaque protéine à partir des deux centrosomes pour obtenir le niveau centrosomale totale de cette protéine dans cette cellule. </li><li> Obtenir leintensité normalisée pour la protéine d&#39;intérêt en calculant le rapport de son intensité totale centrosomale à l&#39;intensité centrosomale totale de l&#39;étalon interne. </li></ol></li><li> Analyser au moins 15 à 25 cellules pour chaque condition expérimentale et tracer le graphique dans une feuille de calcul. </li></ol> 6. Analyse de la protéine totale Utilisant Western Blot <ol><li> Resuspendre les cellules dans radioimmunoprecipitation dosage (RIPA) un tampon contenant 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, le désoxycholate de sodium à 1%, 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) et incuber pendant 10 min sur de la glace à lyser les cellules. <ol><li> Centrifuger le mélange à 10 000 xg pendant 10 minutes, séparer le lysat provenant de la fraction de culot et de mesurer la concentration totale en protéines de chaque lysat en utilisant un acide bicinchoninique (BCA) trousse de dosage. </li></ol></li><li> Mélanger 40 pg de lysat avec SDS-PAGE 4x tampon de chargement (50 mM de Tris-Cl, pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glycerol, 100 mM de dithiothréitol, 0,1% Bromophenol bleu). <ol><li> Faire bouillir les échantillons pendant 10 min et exécuter les échantillons sur un 12,5% de dénaturation SDS-PAGE à une tension constante de 200 V. </li></ol></li><li> Transférer les protéines séparées sur SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose en utilisant la technique du Western blot (à une tension constante de 90 V pendant 1 heure à froid). <ol><li> Bloquer la membrane avec 3% de lait écrémé dans du PBS 1x, puis incuber la membrane avec des solutions d&#39;anticorps primaire dilué (dans ce cas de lapin anti-VDAC3, lapin anti-γ-tubuline et de souris anti-α-tubuline) pour une heure à température ambiante. </li><li> Après avoir lavé la membrane trois fois (chaque 5 minutes d&#39;incubation sous agitation) à l&#39;aide du tampon PBS-T (PBS 1x et 0,2% de Tween-20), incuber la membrane dans un mélange de proche infrarouge (IR) colorant fluorescent conjugué anti-lapin et Anticorps de colorant fluorescent IR anti-souris conjuguée secondaires (dilué dans du PBS-T) pendant 1 heure. </li><li> Laver la membrane trois fois, puis balayer la membrane d&#39;analyser les bandes en utilisant un f infrarougeSystème d&#39;imagerie par luorescence approprié pour la détection par immunotransfert. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+transition+from+centriole+to+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulating the transition from centriole to basal body.</a> J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).</li>
<li>Azimzadeh, J., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Building the centriole.</a> Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).</li>
<li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+HsSAS-6+levels+ensure+formation+of+a+single+procentriole+per+centriole+during+the+centrosome+duplication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle.</a> Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).</li>
<li>Hilbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+centriolar+protein+SAS-6+forms+a+spiral+that+is+consistent+with+imparting+a+ninefold+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).</li>
<li>Pike, A. N., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centriole+assembly+and+the+role+of+Mps1%3A+defensible+or+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable.</a> Cell Div. 6, 9(2011).</li>
<li>Haren, L., Stearns, T., Luders, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk1-dependent+recruitment+of+gamma-tubulin+complexes+to+mitotic+centrosomes+involves+multiple+PCM+components%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components.</a> PLoS One. 4, e5976(2009).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+the+human+centrosome+by+protein+correlation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.</a> Nature. 426, 570-574 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).</li>
<li>Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP+proteins%3A+the+knights+of+centrosome+dynasty%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">CEP proteins: the knights of centrosome dynasty.</a> Protoplasma. 250, 965-983 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interaction+between+mortalin+and+Mps1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase.</a> Genes Cells. 12, 797-810 (2007).</li>
<li>Jakobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+asymmetrically+localizing+components+of+human+centrosomes+identified+by+complementary+proteomics+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods.</a> Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).</li>
<li>Sang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+NPHP-JBTS-MKS+protein+network+reveals+ciliopathy+disease+genes+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways.</a> Cell. 145, 513-528 (2011).</li>
<li>Dowdle, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+ciliary+B9+protein+complex+causes+Meckel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).</li>
<li>Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+regulates+centriole+assembly+by+targeting+Mps1+to+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes.</a> Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).</li>
<li>Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk4+trans-autophosphorylation+regulates+centriole+number+by+controlling+betaTrCP-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation.</a> J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).</li>
<li>Holland, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoregulated+instability+of+Polo-like+kinase+4+limits+centrosome+duplication+to+once+per+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle.</a> Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).</li>
<li>Kasbek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+the+degradation+of+mps1+at+centrosomes+is+sufficient+to+cause+centrosome+reduplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).</li>
<li>Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antizyme+restrains+centrosome+amplification+by+regulating+the+accumulation+of+Mps1+at+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).</li>
<li>Puklowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCF-FBXW5+E3-ubiquitin+ligase+is+regulated+by+PLK4+and+targets+HsSAS-6+to+control+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).</li>
<li>Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cep97+and+CP110+suppress+a+cilia+assembly+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program.</a> Cell. 130, 678-690 (2007).</li>
<li>Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrin-2+is+required+for+centriole+duplication+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells.</a> Curr. Biol. 12, 1287(2002).</li>
<li>Lukasiewicz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+centrin+stability+by+Aurora+A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of centrin stability by Aurora A.</a> PLoS One. 6, e21291(2011).</li>
<li>Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+to+the+centrosome+in+response+to+inhibition+of+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes.</a> J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li>
<li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened%3A+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li>
<li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li>
<li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores%2C+along+spindle+fibers%2C+and+at+spindle+poles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li>
<li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li>
<li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP%2C+and+is+required+for+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li>
<li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome%3A+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li>
<li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li>
<li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li>
<li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li>
<li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li>
<li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La microscopie quantitative en biologie cellulaire est souvent associée à des tests d&#39;imagerie cellules vivantes telles que Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), etc. Cependant, il ya des exemples croissants de biologistes cellulaires développement différents tests de microscopie quantitative pour fixe cellules au cours des dernières années 27,34-36. Fait important, les progrès dans la compréhension de la biologie centrosome néc...

Centrosomes sont constitués d&#39;une paire de centrioles entourées par un matériau péricentriolaire (PCM). Étant les principaux centres d&#39;organisation des microtubules (de MTOCs) dans les cellules de mammifères, centrosomes servent les deux pôles de fuseau mitotique dans les cellules en division, et contribuent ainsi à maintenir l&#39;intégrité du génome 1. Dans les cellules au repos (par exemple, pendant la phase G0), l&#39;un des deux centrioles du centrosome, à savoir le centriole mère, est transformé en un corps de base pour assembler le cil primaire, un organite sensoriel faisant saillie de la surface de la cellule 2. Une fois les cellules re-entrer dans le cycle cellulaire, les cils primaires sont démonté et chaque centriole dirige l&#39;assemblage d&#39;un procentriole à son extrémité proximale qui se allonge progressivement pour former un centriole maturité 3. Au début de la phase S, une structure de roue en forme qui assure la symétrie neuf fois au centriole est formée sur la surface de chaque centriole existant et deviendra la base de chaque procentriole. SAS6 tchapeau est indispensable pour l&#39;assemblage de centriole est recruté pour former le moyeu de la roue 4-6. D&#39;autres protéines centriolaires sont ensuite assemblés sur la roue dans un très réglementé, de manière proximale à distale 7. Après avoir terminé précisément duplication centriole, les cellules se assemblent matériaux péricentriolaire supplémentaires pour construire deux centrosomes fonctionnels d&#39;ici la fin de la phase G2 8. En plus des composants principaux centriolaires 9-11, plusieurs autres protéines kinases, y compris, les phosphatases, chaperons, des composants d&#39;échafaudage, protéines associées à membrane et des machines de dégradation sont associés à des centrioles, les organismes de base et PCM à différents moments du cycle cellulaire 12-16. Il est souvent noté que les niveaux centrosomales de nombreuses protéines sont temporellement régulées par des mécanismes de ciblage centrosomales et / ou dégradation par le protéasome au centrosome. Fait important, les fluctuations du niveau centrosomale de plusieurs protéines telles que PLK4, Mps1, SAS6, et un CP110t différents points du cycle cellulaire semble être cruciale pour réguler ensemble de centriole 5,17-22, et dans le cas de Mps1 empêcher cette dégradation centrosomale conduit à la formation d&#39;excès centrioles 19. D&#39;autre part, les fractions centrosomales de plusieurs protéines sont moins labiles par rapport aux piscines cytosoliques. Par exemple siRNA médiée par régulation à la baisse de Centrin 2 (Cetn2) ne conduit à une diminution modérée de la teneur en protéines dans les centrioles malgré une grande réduction dans les niveaux de cellules entières 23. Il est donc crucial pour mesurer les changements dans le niveau de protéines centrosomales au centrosome plutôt que de mesurer l&#39;ensemble des niveaux de protéines de la cellule lors de l&#39;évaluation de leurs fonctions spécifiques centrosome. Dans cette étude, nous avons développé un test par immunofluorescence indirecte (IFI) pour quantifier le niveau relatif d&#39;une protéine au centrosome. Cet essai a été développé en particulier pour analyser les cellules qui sont de différents échantillonset ainsi ne peut pas être imagée en même temps. Ces échantillons peuvent être des cellules qui ont été traitées avec différents réactifs (ce est à dire, un médicament par rapport au témoin), recueillies à différents points dans le temps (ce est à dire, le pouls contre la chasse), ou sont dans différentes phases du cycle cellulaire. Le principe de ce test réside dans la mesure de l&#39;intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région et pour normaliser la valeur contre le même pour une autre protéine dont le niveau ne varie pas dans les conditions expérimentales choisies. Plusieurs études de la biologie des centrosomes ont récemment utilisé diverses techniques de microscopie quantitative, dans les deux cellules vivantes ou fixées, afin de déterminer la fonction spécifique du centrosome de protéines candidates 24-27. Similaires à ceux des essais, la présente technique mesure aussi l&#39;arrière-plan corrigé intensité de fluorescence de la protéine d&#39;essai. Toutefois, l&#39;inclusion de la normalisation en utilisant un standard interne dans cet essai aurait probablement offrir une plus grandela précision et la confiance dans l&#39;analyse de deux échantillons différents qui sont sur deux lamelles différentes. En outre, en plus de l&#39;examen de la protéine au niveau de centrosomes, avec des ajustements mineurs ce procédé peut être appliqué à un ensemble diversifié de conditions expérimentales ou à d&#39;autres sites cellulaires. Ici, nous combinons notre analyse quantitative de microscopie avec une stratégie pulse-chase BrdU de comparer les cellules à différents stades du cycle cellulaire. Au lieu d&#39;utiliser des techniques d&#39;arrêt du cycle cellulaire standard et libération d&#39;étudier divers moments du cycle cellulaire, les cellules en croissance de manière asynchrone sont incubées avec BrdU pour marquer les cellules en phase S, et les cellules marquées sont chassés pendant divers temps (typiquement 4-6 heures). La plupart des cellules marquées seront en phase S immédiatement après l&#39;impulsion. La longueur de la chasse est choisi de manière que, après la chasse, cellules marquées seront à la fin de S, G2, ou mitose, qui peut être vérifié par des caractéristiques morphologiques telles de position as- du centrosome par rapport à nuclei, la distance entre les centrosomes, la condensation des chromosomes, etc. Ainsi, la longueur de la chasse dépend de la durée moyenne de S, G2 et M phase d&#39;un type cellulaire particulier. Étant donné que cette approche évite les inhibiteurs du cycle cellulaire tels que l&#39;hydroxyurée, l&#39;aphidicoline, nocodazole, etc., il permet une analyse plus physiologiquement pertinente du cycle cellulaire. Ainsi, nous démontrons ici que le dosage quantitatif de la microscopie par fluorescence seul, ou en combinaison avec BrdU test pulse-chase, est une technique simple mais puissant pour mesurer avec précision les changements relatifs dans le niveau centrosomale d&#39;une protéine de candidat pendant une cycle cellulaire imperturbable. Nous avons mesuré le niveau de centrosomale VDAC3, une protéine que nous avons récemment identifié au centrosomes en plus de mitochondries 16,28, l&#39;utilisation de ces tests. Les résultats obtenus ici vérifier notre observation précédente que la piscine centrosomale de VDAC3 est régulée par la dégradation, et varie également en un dependen du cycle cellulairet 16 manière, la validation outre l&#39;applicabilité de cette méthode.

<table><tbody><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Stock de 1 mg/ml dans l’eau</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Stock de 10 mM dans le DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Stock de 10 mM dans le DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&#947 ;-tubuline (monoclonal de souris, clone GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 dans le tampon de blocage IIF&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (polyclonal de lapin)&nbsp ;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 dans la mémoire tampon de blocage IIF, 1:1 000 dans la mémoire tampon de blocage de la balance WB</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (souris monoclonale)&nbsp ;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 dans le tampon de blocage IIF</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (polyclonal de lapin)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 dans le tampon de blocage IIF</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (monoclonal de rat)&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in Tampon de blocage IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in IIF</td></tr><tr><td>Blocking Buffer Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Antibody Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1 000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1 000 en IIF tampon de blocage</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Technologies</td><td>Antibody Life</td><td>A21206</td><td>1:1 000 in IIF Tampon de blocage</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life</td><td>technologies A21207</td><td>1:1 000 in IIF Tampon de blocage</td></tr><tr><td>Anti-&#947 ;-tubuline (polyclonale de lapin)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1 000 in WB tampon</td></tr> <tr><td>de blocageAnti-&#945 ;-tubuline (souris monoclonale, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20 000 in WB</td></tr><tr><td>blocking buffer Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10 000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H& L) Anticorps IRDye800CW Anticorps conjugués</td><td>Rockland</td><td>610-731-002</td><td>1:10 000 dans le tampon de blocage de la WB</td></tr><tr><td>Réactif anti-effacement SlowFade Gold&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Support de montage</td></tr><tr><td>Lamelles rondes 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Olympus IX-81 Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 Caméra IR</td><td>QImaging&nbsp ;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>Objectif à immersion dans l’huile 100X Plan Apo</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 ouverture numérique</td></tr><tr><td>Progiciel de diaporama</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Système d’imagerie IR</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td>Dosage</tr> de <tr><td>l’acide bicchoninique (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cube</td> <td>UV étroitFiltre Olympus</td><td>U-M622</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Blue cube</td><td>Filtre Olympus</td><td>U-M643</td><td>Filtre</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Green cube</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filter</td></tr></tbody></table>

immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes sont petits mais importants organites qui servent de pôles de fuseau mitotique pour maintenir l&#39;intégrité génomique ou assembler les cils primaires pour faciliter les fonctions sensorielles dans les cellules. Le niveau d&#39;une protéine peut être réglé différemment au centrosome que dans d&#39;autres endroits .cellular, et la variation du niveau centrosomale de plusieurs protéines à différents points du cycle cellulaire semble être crucial pour le bon régulation de l&#39;assemblage centriole. Nous avons développé un dosage quantitatif microscopie fluorescence qui mesure les changements relatifs dans le taux d&#39;une protéine dans des centrosomes dans des cellules fixées provenant de différents échantillons, comme à différentes phases du cycle cellulaire ou après le traitement avec divers réactifs. Le principe de ce test réside dans la mesure de l&#39;intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région, et qui normalise la même mesure par rapport à une autre protéine qui ne varie pas dans le cadre du c expérimental choisiondition. Utilisant cet essai en combinaison avec impulsion de BrdU et la stratégie de la chasse à étudier cycles cellulaires non perturbés, nous avons quantitativement validé notre récente observation que la piscine centrosomale de VDAC3 est réglementée au centrosomes au cours du cycle cellulaire, vraisemblablement par la dégradation par le protéasome spécifiquement au centrosome.

Nos études récentes ont identifié roman localisation centrosomale et la fonction de VDAC3, l'un des porines mitochondriales 16,28. Immunocoloration de plusieurs cellules de mammifères y compris les cellules RPE1 utilisant un anticorps spécifique VDAC3 a présenté une coloration centrosomale proéminent et relativement faible coloration mitochondriale. Nous avons également montré que VDAC3 centrosomale est préférentiellement associée à la centriole mère, et la piscine centrosomale à la fois endogènes et ectopiqu...

Ici, un nouveau test de fluorescence quantitative est développé pour mesurer les changements de niveau d’une protéine spécifiquement au niveau des centrosomes en normalisant l’intensité de fluorescence de cette protéine à celle d’un étalon interne approprié.

Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

L’objectif général de cette procédure est de quantifier les changements relatifs du niveau d’une protéine au niveau des centrosomes dans diverses conditions. Par exemple, à un moment précis du cycle cellulaire après l’inhibition du protéasome, cela est accompli en traitant d’abord les cellules qui se développent sur des lamelles de recouvrement avec l’inhibiteur du protéasome MG one 15 ou avec le solvant témoin DMSO. Ensuite, l’ajout immédiat de BRDU aux deux cellules et leur incubation pendant quatre heures dans un incubateur de culture cellulaire.La deuxième étape consiste à transférer les lamelles sur une plaque à 24 puits pour fixer les cellules. Ensuite, les cellules sont colorées avec des anticorps contre BRDU et les protéines d’intérêt, puis avec des anticorps secondaires correspondants. La dernière étape consiste à acquérir des images de cellules BRDU positives à l’aide d’un microscope à fluorescence et d’un logiciel d’imagerie numérique afin d’appliquer un temps d’exposition et une longueur d’axe Z identiques aux cellules de chaque échantillon.Puis en analysant les images pour quantifier le niveau relatif de VDA C3 romal. En fin de compte, la microscopie quantitative par immunofluorescence est utilisée pour montrer que le pool centro-somal de VDA C3 est multiplié par deux lorsque le protéasome est inhibé pendant la phase S. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la cytométrie en flux, l’immuno-transfert ou le microscope quantitatif, est qu’elle analyse le niveau romal relatif de la protéine dans deux échantillons traités différemment qui sont traités sur deux lamelles de protection différentes. Cette méthode utilise la normalisation à un standard interne pour contrôler la nécessité de traiter les deux populations cellulaires expérimentales.Séparément, bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la régulation de protéines spécifiques au niveau des centrosomes. Il peut également être appliqué à d’autres situations, telles que d’autres structures subcellulaires ou l’examen de pools spécifiques de protéines qui se trouvent à plusieurs endroits dans la cellule. La démonstration de la procédure sera faite par Schu Majumder, un post-doctorant de mon laboratoire, pour commencer l’expérience, passer deux fois 10 à la cinquième, en cultivant de manière asynchrone des cellules RPE dans des plats de 35 millimètres préalablement préparés avec des lèvres de couverture et cultiver les cellules dans deux millilitres de milieu complet.Remplacez le milieu de culture toutes les 24 heures par un milieu de préchauffage frais Après 44 heures. Remplacer le milieu de culture par un milieu complet contenant 0,05 % de DMSO ou MG 15 à une concentration finale de cinq micromolaires, et ajouter simultanément du BRDU aux cellules à une concentration finale de 40 micromolaires, incuber les cellules pendant quatre heures. Ensuite, transférez chaque lamelle dans une plaque à 24 puits.Ajoutez 500 microlitres de méthanol pré-labouré dans chaque puits et incubez la plaque à moins 20 degrés Celsius pour fixer les cellules. Après 10 minutes, lavez immédiatement les lamelles trois fois avec 500 microlitres de tampon de lavage. Incuber les cellules fixes à couvert, glisse dans 200 microlitres de tampon de blocage pendant 30 minutes pendant que les cellules sont en incubation.Préparez une chambre humidifiée en plaçant une serviette en papier humide dans la moitié inférieure d’une boîte vide de pointes de pipette de 1000 microlitres. Posez une bande de parfum sur la surface de la grille et ajoutez une gouttelette de 20 microlitres de l’anticorps anti V DDA trois de lapin et de l’anticorps anti gamma tubuline de souris dilué dans un tampon de blocage sur le paraforme. Après le blocage, inversez une lamelle sur chaque gouttelette de solution d’anticorps.Assurez-vous que les cellules sont immergées et fermez le couvercle de la boîte à pointes. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans la chambre humidifiée. Retournez à nouveau les lamelles et remettez-les dans le 24.Bien laver les lamelles, puis les incuber dans une solution de 150 microlitres d’anticorps secondaires, diluées dans un tampon bloquant pendant une heure à température ambiante Après l’incubation, lavez les lamelles trois fois avec un tampon de lavage. Fixez les cellules RPE colorées avec 500 microlitres de méthanol refroidi à moins 20 degrés Celsius. Une fois que les cellules sont fixées pendant 10 minutes, lavez-les trois fois dans un tampon de lavage.Ensuite, incubez les cellules dans 200 microlitres de deux HCL normaux pendant 30 minutes. À température ambiante, neutralisez les cellules avec 300 microlitres d’une molaire tris CL pH huit, et lavez les cellules trois fois. Avec tampon de lavage, bloquez les cellules avec 200 microlitres de tampon de blocage pendant 30 minutes à température ambiante.Après le blocage, incubez les cellules avec un anticorps anti-BRDU de rat et un tampon de blocage pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius dans la chambre humidifiée. Retournez les capots de couverture au 24. Bien vaisselle et laver les cellules.Ensuite, incubez-les avec des anticorps secondaires dilués dans 150 microlitres de tampon de blocage. Dans un plat à 24 puits pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec un point XPBS, une gouttelette de six microlitres d’une solution de montage contenant un réactif Antifa sur un microscope en verre.Faites glisser une lamelle inversée avec le côté de la cellule vers le bas sur la solution de montage. À l’aide d’un chiffon de nettoyage doux, appuyez doucement la lamelle contre la lame pour enlever l’excès de liquide, scellez la lamelle sur le microscope. Faites glisser en appliquant du vernis à ongles le long du bord de la lamelle.Utilisez un objectif à immersion dans l’huile plan APO 100 x avec une ouverture numérique de 1,4 pour acquérir les images des cellules BRDU RPE positives à température ambiante. Déterminez les plans focaux supérieur et inférieur appropriés le long de l’axe Z avec une taille de pas de 0,2 micron, et acquérez des images le long de l’axe Z. Ensuite, effectuez la déconvolution de toutes les piles d’images acquises le long de l’axe Z.Obtenez la projection d’intensité totale de chaque image. Empilez le long de l’axe Z pour les cellules dont les centrosomes sont séparés par moins de deux microns. Dessinez un petit carré de 20 à 30 pixels de chaque côté autour des deux centrosomes et marquez la zone sélectionnée.Dessinez un carré plus grand de 24 à 35 pixels de chaque côté autour du premier carré et marquez la zone sélectionnée du grand carré. Obtenez ensuite l’aire et l’intensité de fluorescence totale de chaque quatre fluoros. Dans chaque case, calculez l’intensité de fluorescence corrigée de chaque fluor. Quatre.Enfin, obtiens l’intensité de fluorescence normalisée de VDA C3 en calculant le rapport de l’intensité de fluorescence corrigée du bruit de fond de son fluor. Quatre à celui des quatre fluoros utilisés pour les images standard internes choisies ont été capturées de champs aléatoires de cellules RPE one en croissance asynchrone incubées avec BRDU et soit l’inhibiteur de protéasome MG 15, soit le solvant de contrôle DMSO et l’ADN d’affichage et BRDU. L’intensité de fluorescence corrigée de l’arrière-plan correspondant à celle du Centro Somal.La VD 3 était environ 2,5 fois plus élevée dans les cellules traitées par MG 1 15 que dans les cellules témoins, comme le montre ce diagramme en boîte et moustaches. Lorsque les données ont été normalisées pour la fluorescence totale de VD trois par rapport à celle de la tubuline gamma, le pli a augmenté, légèrement diminué à environ deux fois. La coloration en C3 de la VD au niveau des cytes non romaux ou du niveau cellulaire total de la VD trois n’a pas été affectée par l’inhibition du protéasome.Ainsi, le pool romal de VDA C3 est régulé par la dégradation médiée par le protéasome. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les anticorps contre la protéine testée et l’étalon interne doivent être élevés chez différentes espèces hôtes et que les images des deux échantillons doivent être acquises à l’aide de paramètres d’imagerie identiques, tels que le nombre de césariennes et les temps d’exposition, afin de minimiser l’effet de l’imagerie numérique.

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo présente une méthode de surveillance du trafic de la protéine cellulaire 0 infectée, ICP0 dans l’infection par le virus de l’herpès simplex-1. Après la synthèse de novo, ICP0 se déplace vers le noyau, puis vers le cytoplasme au cours de la progression de l’infection. La microscopie d'immunofluorescence révèle et analyse la localisation subcellulaire de la protéine, offrant ainsi des informations sur son trafic à travers les phases d'infection.

Une technique d’immunofluorescence pour la localisation de protéines virales dans des cellules infectées

Présenté informatique est un workflow flexible permettant multiplexé analyse basée sur l'image de cellules marquées par fluorescence. Le workflow quantifie marqueurs nucléaires et cytoplasmiques et calcule marqueur translocation entre ces compartiments. Des procédures sont prévues pour perturbation de cellules en utilisant siRNA et la méthodologie fiable pour la détection du marqueur par immunofluorescence indirecte dans des formats de 96 puits.

Workflow pour haut-contenu, cellule individuelle quantification des marqueurs fluorescents de Data Universal Microscope, pris en charge par Open Source Software

Ici, nous rapportons des protocoles pour détecter les protéines centromères-kinétochores endogènes et exogènes dans les cellules humaines et quantifions ces niveaux de protéines au niveau des centromères-kinétochores par coloration immunofluorescente indirecte par l’utilisation de la fixation (fixation du paraformaldéhyde, de l’acétone ou du méthanol).

Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

Cet article décrit une méthode pour visualiser et quantifier les événements de traduction localisée dans les compartiments subcellulaires. L’approche proposée dans ce manuscrit nécessite un système d’imagerie confocal base et réactifs et est rapide et rentable.

Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

Nous avons développé une stratégie visant à purifier et un grand nombre de centrioles dans différentes orientations se prête pour la microscopie de Super-résolution et particule avec une moyenne de l’image.

Isolement et imagerie de Fluorescence pour la Reconstruction de la particule de Chlamydomonas Centrioles

Ce protocole décrit une approche d’axée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation pour étudier les interactions entre protéines médiant les interactions cellule-cellule, c'est-à-dire des protéines localisées dans les jonctions cellulaires, directement dans les cellules vivantes. Nous fournissons des lignes directrices détaillées sur l’étalonnage de l’instrument, d’acquisition de données et l’analyse, y compris les corrections apportées aux sources de l’artefact possible.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

Nous décrivons l’utilisation d’immunotransfert quantitative pour valider l’histologie immunofluorescence couplée avec l’analyse de l’image comme un moyen de quantifier une protéine d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFIP). Nos résultats démontrent l’utilité de l’examen histologique immunofluorescence pour déterminer la quantité relative de biomarqueurs protéines dans des échantillons de biopsie systématique.

Immunotransfert quantitative de lignées cellulaires comme norme pour valider l’Immunofluorescence pour quantifier les biomarqueurs des protéines dans des échantillons de tissus courants

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Nous décrivons un protocole utilisant l'hybridation in situ de fluorescence (FISH) pour visualiser les ARN herpèsvirs multiples dans les cellules humaines lytically infectées, en suspension ou adhérentes. Ce protocole comprend la quantification de la fluorescence produisant un rapport nucléocytoplasmique et peut être étendu pour la visualisation simultanée des protéines hôtes et virales avec immunofluorescence (IF).

Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV

Le CENP-Une ubiquitylation est une exigence importante pour le dépôt de CENP-A au centromère, hérité par dimerisation entre la division cellulaire, et indispensable à la viabilité cellulaire. Ici nous décrivons l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de la protéine CENP-A (EYFP-CENP-A) marquée par EYFP.

Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A)

Cette méthode décrit un protocole d’immunofluorescence et un pipeline de quantification pour évaluer la distribution des protéines avec des modèles d’organisation nucléaire variés dans les lymphocytes T humains. Ce protocole fournit des conseils étape par étape, en commençant par la préparation des échantillons et en continuant par l’exécution d’une analyse semi-automatisée aux Fidji, se terminant par le traitement des données par un ordinateur portable Google Colab.

Un pipeline polyvalent pour l’analyse des changements dynamiques dans les corps nucléaires dans une variété de types de cellules

Apprenez une méthode d'immunofluorescence quantitative pour mesurer les variations de protéines au centrosome dans des cellules RPE1 fixées. Cette technique permet de normaliser l'intensité fluorescente à l'aide d'un standard interne comme la gamma-tubuline.

Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

Explorer plus de vidéos