Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

L’objectif général de cette procédure est de quantifier les changements relatifs du niveau d’une protéine au niveau des centrosomes dans diverses conditions. Par exemple, à un moment précis du cycle cellulaire après l’inhibition du protéasome, cela est accompli en traitant d’abord les cellules qui se développent sur des lamelles de recouvrement avec l’inhibiteur du protéasome MG one 15 ou avec le solvant témoin DMSO. Ensuite, l’ajout immédiat de BRDU aux deux cellules et leur incubation pendant quatre heures dans un incubateur de culture cellulaire.

La deuxième étape consiste à transférer les lamelles sur une plaque à 24 puits pour fixer les cellules. Ensuite, les cellules sont colorées avec des anticorps contre BRDU et les protéines d’intérêt, puis avec des anticorps secondaires correspondants. La dernière étape consiste à acquérir des images de cellules BRDU positives à l’aide d’un microscope à fluorescence et d’un logiciel d’imagerie numérique afin d’appliquer un temps d’exposition et une longueur d’axe Z identiques aux cellules de chaque échantillon.

Puis en analysant les images pour quantifier le niveau relatif de VDA C3 romal. En fin de compte, la microscopie quantitative par immunofluorescence est utilisée pour montrer que le pool centro-somal de VDA C3 est multiplié par deux lorsque le protéasome est inhibé pendant la phase S. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la cytométrie en flux, l’immuno-transfert ou le microscope quantitatif, est qu’elle analyse le niveau romal relatif de la protéine dans deux échantillons traités différemment qui sont traités sur deux lamelles de protection différentes. Cette méthode utilise la normalisation à un standard interne pour contrôler la nécessité de traiter les deux populations cellulaires expérimentales.

Séparément, bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la régulation de protéines spécifiques au niveau des centrosomes. Il peut également être appliqué à d’autres situations, telles que d’autres structures subcellulaires ou l’examen de pools spécifiques de protéines qui se trouvent à plusieurs endroits dans la cellule. La démonstration de la procédure sera faite par Schu Majumder, un post-doctorant de mon laboratoire, pour commencer l’expérience, passer deux fois 10 à la cinquième, en cultivant de manière asynchrone des cellules RPE dans des plats de 35 millimètres préalablement préparés avec des lèvres de couverture et cultiver les cellules dans deux millilitres de milieu complet.

Remplacez le milieu de culture toutes les 24 heures par un milieu de préchauffage frais Après 44 heures. Remplacer le milieu de culture par un milieu complet contenant 0,05 % de DMSO ou MG 15 à une concentration finale de cinq micromolaires, et ajouter simultanément du BRDU aux cellules à une concentration finale de 40 micromolaires, incuber les cellules pendant quatre heures. Ensuite, transférez chaque lamelle dans une plaque à 24 puits.

Ajoutez 500 microlitres de méthanol pré-labouré dans chaque puits et incubez la plaque à moins 20 degrés Celsius pour fixer les cellules. Après 10 minutes, lavez immédiatement les lamelles trois fois avec 500 microlitres de tampon de lavage. Incuber les cellules fixes à couvert, glisse dans 200 microlitres de tampon de blocage pendant 30 minutes pendant que les cellules sont en incubation.

Préparez une chambre humidifiée en plaçant une serviette en papier humide dans la moitié inférieure d’une boîte vide de pointes de pipette de 1000 microlitres. Posez une bande de parfum sur la surface de la grille et ajoutez une gouttelette de 20 microlitres de l’anticorps anti V DDA trois de lapin et de l’anticorps anti gamma tubuline de souris dilué dans un tampon de blocage sur le paraforme. Après le blocage, inversez une lamelle sur chaque gouttelette de solution d’anticorps.

Assurez-vous que les cellules sont immergées et fermez le couvercle de la boîte à pointes. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans la chambre humidifiée. Retournez à nouveau les lamelles et remettez-les dans le 24.

Bien laver les lamelles, puis les incuber dans une solution de 150 microlitres d’anticorps secondaires, diluées dans un tampon bloquant pendant une heure à température ambiante Après l’incubation, lavez les lamelles trois fois avec un tampon de lavage. Fixez les cellules RPE colorées avec 500 microlitres de méthanol refroidi à moins 20 degrés Celsius. Une fois que les cellules sont fixées pendant 10 minutes, lavez-les trois fois dans un tampon de lavage.

Ensuite, incubez les cellules dans 200 microlitres de deux HCL normaux pendant 30 minutes. À température ambiante, neutralisez les cellules avec 300 microlitres d’une molaire tris CL pH huit, et lavez les cellules trois fois. Avec tampon de lavage, bloquez les cellules avec 200 microlitres de tampon de blocage pendant 30 minutes à température ambiante.

Après le blocage, incubez les cellules avec un anticorps anti-BRDU de rat et un tampon de blocage pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius dans la chambre humidifiée. Retournez les capots de couverture au 24. Bien vaisselle et laver les cellules.

Ensuite, incubez-les avec des anticorps secondaires dilués dans 150 microlitres de tampon de blocage. Dans un plat à 24 puits pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec un point XPBS, une gouttelette de six microlitres d’une solution de montage contenant un réactif Antifa sur un microscope en verre.

Faites glisser une lamelle inversée avec le côté de la cellule vers le bas sur la solution de montage. À l’aide d’un chiffon de nettoyage doux, appuyez doucement la lamelle contre la lame pour enlever l’excès de liquide, scellez la lamelle sur le microscope. Faites glisser en appliquant du vernis à ongles le long du bord de la lamelle.

Utilisez un objectif à immersion dans l’huile plan APO 100 x avec une ouverture numérique de 1,4 pour acquérir les images des cellules BRDU RPE positives à température ambiante. Déterminez les plans focaux supérieur et inférieur appropriés le long de l’axe Z avec une taille de pas de 0,2 micron, et acquérez des images le long de l’axe Z. Ensuite, effectuez la déconvolution de toutes les piles d’images acquises le long de l’axe Z.

Obtenez la projection d’intensité totale de chaque image. Empilez le long de l’axe Z pour les cellules dont les centrosomes sont séparés par moins de deux microns. Dessinez un petit carré de 20 à 30 pixels de chaque côté autour des deux centrosomes et marquez la zone sélectionnée.

Dessinez un carré plus grand de 24 à 35 pixels de chaque côté autour du premier carré et marquez la zone sélectionnée du grand carré. Obtenez ensuite l’aire et l’intensité de fluorescence totale de chaque quatre fluoros. Dans chaque case, calculez l’intensité de fluorescence corrigée de chaque fluor. Quatre.

Enfin, obtiens l’intensité de fluorescence normalisée de VDA C3 en calculant le rapport de l’intensité de fluorescence corrigée du bruit de fond de son fluor. Quatre à celui des quatre fluoros utilisés pour les images standard internes choisies ont été capturées de champs aléatoires de cellules RPE one en croissance asynchrone incubées avec BRDU et soit l’inhibiteur de protéasome MG 15, soit le solvant de contrôle DMSO et l’ADN d’affichage et BRDU. L’intensité de fluorescence corrigée de l’arrière-plan correspondant à celle du Centro Somal.

La VD 3 était environ 2,5 fois plus élevée dans les cellules traitées par MG 1 15 que dans les cellules témoins, comme le montre ce diagramme en boîte et moustaches. Lorsque les données ont été normalisées pour la fluorescence totale de VD trois par rapport à celle de la tubuline gamma, le pli a augmenté, légèrement diminué à environ deux fois. La coloration en C3 de la VD au niveau des cytes non romaux ou du niveau cellulaire total de la VD trois n’a pas été affectée par l’inhibition du protéasome.

Ainsi, le pool romal de VDA C3 est régulé par la dégradation médiée par le protéasome. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les anticorps contre la protéine testée et l’étalon interne doivent être élevés chez différentes espèces hôtes et que les images des deux échantillons doivent être acquises à l’aide de paramètres d’imagerie identiques, tels que le nombre de césariennes et les temps d’exposition, afin de minimiser l’effet de l’imagerie numérique.