Stéréologique et cytométrie de flux Caractérisation des sous-populations leucocytaires dans les modèles de transitoires ou permanentes ischémie cérébrale

L’objectif global de cette procédure est de caractériser les sous-ensembles de cellules myéloïdes de souris du cerveau ischémique par deux méthodologies différentes. Tout d’abord, un modèle permanent d’ischémie cérébrale est introduit par l’occlusion, à la fois l’artère carotide commune ou ACC et le tronc distal de l’artère cérébrale moyenne ou ACM générant un infarctus qui affecte principalement le cortex cérébral. Ensuite, pour la quantification stéréologique des sous-ensembles de cellules myéloïdes, les sections coronales en série du cerveau sont immuno-colorées pour les cellules d’intérêt, puis les cellules infiltrées sont quantifiées par l’approche du fractionneur optique.

Alternativement, les cellules myéloïdes peuvent être isolées à partir de tissu cérébral frais par dissociation mécanique, puis colorées et analysées par cytométrie en flux. En fin de compte, une quantification précise et une caractérisation qualitative détaillée des sous-ensembles spécifiques de cellules myéloïdes qui infiltrent le cerveau de la souris après une ischémie cérébrale peuvent être obtenues par quantification stéréoscopique et cytométrie en flux multiparamétrique, respectivement. Le principal avantage de ce modèle d’ischémie en série par rapport aux autres modèles existants est que notre technique a des taux de mortalité nettement inférieurs à ceux des autres méthodes, minimisant le nombre d’animaux requis pour l’étude.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’AVC, telles que quels sont les rôles de la micro-réactivation, de l’extravasation des macrophages hématogènes ou des neutrophiles dans les lésions cérébrales ? La quantification théologique précise des approches de cytométrie multiparamétrique démontrées dans cet article peut donner un aperçu du nombre, du phénotype et de la fonction de la population de cellules myéloïdes dans la réponse immunitaire innée à l’ischémie CE. Pour ligaturer d’abord l’ACC, faites une incision médiane d’un centimètre autour de la surface ventrale du cou de l’animal sous un microscope chirurgical.

Une fois disséqué, utilisez une suture en nylon à six zéros pour occlure l’ACC gauche avec un nœud permanent pour ligaturer l’ACM distale. Ensuite, faites une incision horizontale sur le muscle temporal de droite à gauche. Faites ensuite une deuxième incision verticale sur le côté droit du muscle temporal.

Prendre soin d’éviter de couper la veine temporale. Séparez le muscle temporal du crâne et maintenez-le avec une suture pour maintenir une surface du crâne propre. Nettoyez ensuite le crâne avec une solution saline stérile froide pour détecter la position exacte du MCA gauche via la transparence du crâne.

Une fois que l’ACM a été identifiée, utilisez une fraise en acier inoxydable pour effectuer une craniotomie ronde d’un millimètre dans le lobe frontal entre l’arc zygomatique et l’os squamaire. Retirez délicatement le crâne exposant le MCA. Ensuite, utilisez une suture en nylon à neuf zéros pour occlure le MCA gauche dans le tronc distal juste avant la bifurcation entre les branches MCA frontale et postérieure avec un nœud permanent.

Pour enlever le cerveau, décapitez la souris euthanasiée juste au-dessus de la moelle épinière et faites une incision antérieure postérieure dans la peau pour exposer le crâne. Faites ensuite deux entailles latérales à la jonction des parois latérales et de la base du crâne et retirez le petit morceau d’os. Ensuite, faites une incision à travers le crâne le long de la suture sagittale et utilisez une pince pour retirer le crâne recouvrant chaque hémisphère afin d’exposer le cerveau.

À l’aide d’une spatule, séparez le cerveau du crâne et transférez-le dans une solution à 4 % de PFA. Après trois heures, retirez le PFA et incubez le cerveau dans une solution à 30 % de saccharose pour cryoprotéger le cerveau. Après 48 heures, retirez la solution de saccharose et congelez rapidement le cerveau à moins 40 degrés Celsius isop pentane, puis utilisez un microtome de congélation pour faire des sections de cerveau coronaire de 30 micromètres.

Collecte de 10 ensembles en série dans une solution de cryo-conservateur. Chaque série est composée d’environ 14 à 16 coupes coronales avec une distance inter-tranches de 300 micromètres. Assurer un échantillonnage adéquat du cerveau de la souris entre 1,94 et moins 2,46 en arrière du bgma pour estimer le nombre total de neutrophiles infiltrés.

Après occlusion du MCA par un fractionneur optique, on immunocolore d’abord les neutrophiles avec l’anticorps anti LY six G du rat et l’anticorps secondaire approprié sur des coupes flottantes par la technique d’immunofluorescence conventionnelle. Ensuite, montez les sections de cerveau sur des lames de microscope Super Frosts avec la zone infarctus placée sur la droite et ouvrez le logiciel d’investigation stéréo. Ensuite, cliquez sur le menu du gestionnaire de sections de série d’outils et ajoutez une nouvelle section avec le bouton de nouvelle section.

Définissez l’intervalle d’évaluation sur 10 pour une fraction d’échantillonnage d’une tranche sur 10. Ensuite, dans le menu déroulant des contours, sélectionnez l’outil de contour de la zone infarctus. Dessinez un contour pour délimiter la zone infarctus sous l’objectif 10x.

Passez ensuite à l’objectif 100 x sur le microscope et dans le menu des objectifs. Pour quantifier les neutrophiles dans le menu des sondes, sélectionnez maintenant le fractionneur optique et réglez le placement XY des images de comptage sur 230 pour les tailles de grille X et Y. Sélectionnez maintenant le bouton neutrophiles dans la barre de marqueurs et marquez les neutrophiles colorés dans la zone infarctus.

Exportez les résultats de la quantification dans un fichier tableur pour dissocier le cerveau en une suspension unicellulaire. Après avoir enlevé le cerveau comme nous venons de le démontrer, disséquez les zones centrale et par infarctus du cortex ipsilatéral du cerveau d’une souris ischémique cérébrale. Pesez le tissu cérébral et placez-le dans cinq millilitres de RPMI glacé par appel pour la normalisation entre les groupes expérimentaux, puis utilisez un broyeur de tissus avec des pilons en téflon pour dissocier le tissu en une suspension unicellulaire.

Transférez les suspensions cellulaires dans un tube d’ultracentrifugation de 50 millilitres et ajoutez cinq millilitres supplémentaires de solution RPMI par appel aux échantillons. Ensuite, après avoir centrifugé les suspensions cellulaires pendant 30 minutes à 7, 800 GS et 25 degrés Celsius. Assurez-vous qu’une couche de couleur blanche correspondant à la myéline apparaît au sommet de la solution.

Retirez soigneusement la couche de myéline et filtrez l’ensemble de la suspension cellulaire, y compris les cellules granulées, à travers une passoire en maille de nylon de 40 micromètres. Lavez la passoire avec 10 millilitres de RPMI pour vous assurer que toutes les cellules sont filtrées à travers le grillage, puis transférez la solution dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez 20 millilitres de RPMI dans les cellules, puis, après avoir fait tourner les cellules, remettez en suspension la pastille leucocytaire.

Dans un millilitre de PBS, incubez les cellules pendant deux à trois minutes dans quatre millilitres de tampon de lyse à température ambiante pour lyser les érythrocytes, puis faites tourner les cellules vers le bas. Étiquetez les cellules dans 200 microlitres de PBS contenant 1 % de BSA et les anticorps appropriés sur de la glace. Ensuite, après 45 minutes, lavez les échantillons avec un millilitre de PBS froid et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de tampon de flux de fax pour l’analyse cytométrique en flux.

Ce modèle est caractérisé par des volumes d’infarctus hautement reproductibles 24 heures après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, tels qu’estimés par la méthode cavalieri. Dans les coupes colorées niales en accord avec les études précédentes, l’infiltration des neutrophiles est directement corrélée à la taille de l’infarctus. De plus, l’isolement des leucocytes et la caractérisation cytométrique en flux permettent d’isoler les cellules myéloïdes du cortex de l’hémisphère lésionnel IPS des souris ischémiques, qui représentent 10 à 30 % du total des événements trouvés dans la suspension cellulaire et présentent un faible paramètre de diffusion vers l’avant associé aux débris cellulaires.

Les cellules CD 11 B positives ont une valeur de diffusion vers l’avant plus élevée, ce qui suggère que les débris cellulaires ne sont pas marqués avec ce marqueur et, comme indiqué précédemment, qu’ils peuvent être exclus d’une analyse plus approfondie en fixant le seuil FSC à 200 neutrophiles caractérisés par LY. Six cellules G positives sont la population de cellules infiltrées la plus nombreuse trouvée 24 heures après l’occlusion de MCA dans le cerveau ischémique de la souris en utilisant ce modèle d’ischémie cérébrale et représentent 70 à 80 % des cellules du CD 11 B positif du CD 45 haut. Le reste des cellules est principalement une sous-population de CD 11 B, de CD 45 positif, de LY 6 G élevés, de six monocytes pro-inflammatoires élevés de six C, qui se trouvent en nombre élevé dans les zones cérébrales ischémiques de 24 à 48 heures après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. Ce modèle P-M-C-A-O peut être réalisé en 30 minutes s’il est réalisé correctement en suivant la procédure de cytométrie en flux.

D’autres méthodes, comme le tri d’un sous-ensemble cellulaire spécifique, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les modèles d’expression, les changements métaboliques ou les activités acétiques des cellules myéloïdes dans ce système modèle. Après avoir regardé cette vidéo, juste pour avoir une bonne compréhension de la façon de créer un modèle d’ischémie et, surtout, comment caractériser le nombre et le phénotype des cellules myéloïdes infiltrantes par deux approches différentes dans une lésion cérébrale de souris ou un tpe après un modèle d’ischémie cérébrale.