Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de l'urine cellules dérivées

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer efficacement des cellules souches pluripotentes induites ou IPSC à partir de patients atteints de dystrophie musculaire à partir de cultures cellulaires dérivées de l’urine et d’une méthode de reprogrammation sans intégration. Ceci est réalisé en prélevant d’abord des échantillons d’urine de patients atteints de dystrophie musculaire. Dans un deuxième temps, les cellules urinaires sont isolées et développées dans des cultures de cellules dérivées de l’urine.

Ensuite, les cellules dérivées de l’urine sont transduites avec le virus Sendai contenant des facteurs Yamanaka et des colonies pluripotentes typiques émergent après 12 jours. En fin de compte, par le passage 13, l’état libre de transgènes des cellules souches pluripotentes peut être confirmé par l’analyse R-T-P-C-R. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la reprogrammation de fibroblastes cutanés isolés à l’aide de vecteurs lentiviraux est qu’avec cette technique, les cellules somatiques peuvent être obtenues de manière non invasive auprès des patients et utilisées pour générer efficacement les IPC en utilisant une méthode de reprogrammation virale à empreinte zéro.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la dystrophie musculaire, telles que la façon dont ces conditions peuvent être modélisées in vitro sans problèmes de sécurité pour une application humaine. Mohammad Zishan Al, un boursier postdoctoral, Courtney Guesting, un technicien et Melanie Ryder, une étudiante diplômée, tous trois de mon laboratoire. Pour prélever un échantillon d’urine, commencez par conseiller au patient de boire des liquides 30 minutes avant le prélèvement afin de s’assurer qu’environ 30 à 40 millilitres d’urine peuvent être prélevés. Lorsque le patient est prêt, donnez-lui une trousse de prélèvement d’urine contenant les articles suivants, des instructions écrites sur la façon d’obtenir des toilettes antibactériennes stériles ou propres, plus accrocheuses et humides, et un gobelet de prélèvement d’échantillons stériles de 100 millilitres.

Une fois l’échantillon prélevé, placez immédiatement le gobelet de prélèvement sur de la glace et transférez-le au laboratoire dans une glacière. Ensuite, utilisez des pipettes stériles pour transférer l’échantillon d’urine dans des tubes à centrifuger stériles de 50 millilitres, et faites tourner les tubes à 400 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, dans une BSL, deux enceintes de sécurité biologique aspirent tout sauf le dernier, millilitre du surnageant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.

Ensuite, lavez les cellules dans sept millilitres de tampon de lavage et faites tourner les cellules à nouveau. Cette fois-ci, il a aspiré tous les millilitres sauf le dernier, environ 0,2 à 0,5 millilitres du surnageant. Maintenant, réutilisez la pastille dans deux à trois millilitres de cellule progénitrice urinaire ou de milieu UPC et transférez la suspension dans quatre à six puits d’une plaque non revêtue de 24 puits après 72 heures, complétez la culture avec 0,5 millilitre de milieu UPC frais par puits.

Surveillez la culture pendant quatre à six jours d’incubation. De petites colonies cellulaires de deux à quatre cellules arrondies ou allongées représentant respectivement des cellules épithéliales rénales de type un ou de type deux devraient commencer à apparaître. Continuez à changer de milieu tous les deux à trois jours.

Comme les colonies subiront une phase d’expansion rapide après environ neuf à 15 jours de culture, les cellules devraient être confluentes à 80 à 90 % à ce stade, divisez les cellules sur deux à quatre puits d’une plaque de 24 puits pour une expansion supplémentaire. En marquant cette culture comme passage cellulaire un, les cellules urinaires peuvent ensuite être caractérisées pour des marqueurs spécifiques à la lignée par analyse cytométrique en flux, coloration immunohistochimique ou par réaction en chaîne par polymérase à transcriptase inverse pour assurer une reprogrammation à haute efficacité jusqu’à 60 000 cellules par puits avant la graine de transduction. D’un passage une à cinq cultures dans deux puits d’une plaque à six puits le jour zéro.

Préparez le vecteur de reprogrammation de Sendai en ajoutant chacun des quatre facteurs OSKM à un MLI approprié pour la reprogrammation à un millilitre de milieu UPC préchauffé, aspirez le milieu de suspense et ajoutez lentement la suspension virale à un puits de cellules urinaires pendant les six jours suivants. Remplacer quotidiennement le surnageant par un milieu UPC frais le cinquième jour sur une plaque de graines de mitomycine traitées MES sur des boîtes de culture de 100 millimètres carrés enrobées de gélatine le sixième jour. Dissociez les cellules urinaires avec de la trypsine, mettez-les en suspension dans un milieu UPC et plaquez-les à cinq fois 10 de la quatrième à deux fois 10 de la cinquième cellule par plaque d’alimentation de méthamphétamine.

Le lendemain, remplacez le milieu UPC par un milieu au stade embryonnaire humain ou HES et surveillez les cellules au microscope pour observer les cellules transformées environ 12 à 18 jours. Après la transduction, les cellules doivent former des agrégats clonaux avec une morphologie de pavé caractéristique et un rapport noyau/cytoplasme plus élevé. Pour identifier les clones IPSC reprogrammés, effectuez une coloration de cellules vivantes pour un anticorps TRA 180 1.

Ensuite, utilisez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 26 pour hachurer les agrégats clonaux positifs TRA 180 1 en quatre à six petits morceaux de taille égale par clone. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélevez et transférez 10 à 20 morceaux hachurés de plusieurs clones dans chaque puits. Medium, 24 à 48 heures après que les clones reprogrammés ont été plaqués sur la surface du matrigel.

Remplacez le support par un support IPSC. À l’aide d’une pointe de pipette, on peut gratter manuellement les cellules différenciées ou les cellules contaminantes qui se nourrissent de méthamphétamine afin de faciliter la purification des clones IPSC dystrophiques pluripotents entièrement reprogrammés. Une fois que les clones ont atteint une taille d’environ 100 micromètres, dissociez les cellules avec de l’EDTA pendant trois minutes, puis mettez en plaque de petits agrégats cellulaires de l’IPSC dystrophique reprogrammé, en suspension dans un milieu IPSC complété par un inhibiteur de kinase RO sur une plaque de 12 feuilles de matrigel fraîche.

Enfin, confirmez la pluripotence de chaque clone par l’analyse de l’expression génique et la coloration immunohistochimique. Pour les marqueurs pluripotents, la plupart des cellules isolées dans l’urine humaine sont positives pour les marqueurs de cellules progénitrices et souches tels que CD 44, CD 73 et CD 1 46. Les cellules présentent également des marqueurs mésenchymateux tels que l’alpha, le muscle lisse, l’actine et le menton.

R-T-P-C-R des cellules isolées fournit la preuve d’une population mixte de cellules dans les cultures. En ce qu’il y a une faible expression de la cytokératine sept et de l’UIN un A et trois marqueurs a des cellules euro-épithéliales. Les cellules urinaires se transforment de cellules allongées de type deux le jour zéro en un motif pavé au quatrième jour de la reprogrammation.

Au 12e jour, des clones pluripotents typiques sont observés et sont capables de maintenir leur morphologie pluripotente dans des conditions exemptes de nourrisseurs. La coloration des cellules vivantes pour TRA 180 1 peut être utilisée pour identifier les clones reprogrammés. Pour confirmer la génération de vecteurs et de transgènes, des clones pluripotents libres, R-T-P-C-R, peuvent être réalisés à l’aide d’amorces contre le génome du virus Sendai et chacun des facteurs OSKM exogènes.

L’expression des gènes exogènes n’est plus détectée par le passage 13, mais on observe la régulation positive des facteurs endogènes. La coloration immunofluorescente confirme l’expression de marqueurs pluripotents sur les IPC mais pas sur les cellules urinaires. L’expression de la protéine et du gène de la dystrophine peut ensuite être vérifiée par d’autres colorations immunofluorescentes, western blot et R-T-P-C-R respectivement, comme démontré avec ces images représentatives provenant d’un contrôle de type sauvage et de lignées cellulaires dystrophiques.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour réaliser une reprogrammation sans ène de l’ucs. En quelques semaines Suite à cette procédure, nous pouvons différencier les IPC en cardiomyocytes ou en myocytes squelettiques afin d’approfondir les mécanismes à l’origine de la dystrophie musculaire.