Name: Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de lurine cellules dérivées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez la génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules urinaires de patients atteints de dystrophie musculaire. Cette méthode non invasive utilise le virus Sendai pour une reprogrammation efficace et sans intégration.

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Le développement de ce protocole a été soutenu par Advancing a Healthier Wisconsin et le National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, par le biais de la subvention numéro 8UL1TR000055. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles du NIH.

NOTE: Les patients et / ou leurs tuteurs doivent donner un consentement éclairé à participer à un Institutional Review Board étude approuvée. 1. Tampons et préparations des médias <ol><li> tampon de lavage: Pour préparer 100 ml de tampon de lavage, ajouter 1 ml de stylo 100x / Solution streptococcique (100 U / ml de pénicilline + 100 pg / ml de streptomycine) à 99 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Progenitor urinaire cellulaire (UPC) Medium: Pour préparer le milieu UPC, mélanger des volumes égaux de kératinocytes Free Serum (KSF) Medium + de cellules souches moyen. <ol><li> KSF Medium: Pour préparer le milieu de kératinocytes, ajouter 5 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 50 ng / ml d&#39;extrait pituitaire bovin (BPE), 30 ng / ml de toxine cholérique, et la solution pen / strep (100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine) à 500 ml de milieu KSF. </li><li> Moyen de cellules souches: Ajouter trois quarts de DMEM avec un quart des médias Ham-F12 et de compléter avec 10% de FBS, 0,4 pg / ml hydrocortisone, 0,1nM toxine du choléra, 5 ng / ml d&#39;insuline, 1,8 x 10 -4 M d&#39;adénine, 5 ug / ml de transferrine, 2 x 10 -9 M triiodo thyronine, 10 ng / ml d&#39;EGF, et pen / strep solution. </li></ol></li><li> hES moyenne: 20% Ajouter remplacement KO-sérum (M-SR), 1x MEM acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 100 uM de β-mercaptoéthanol, 20 ng / ml de bFGF et pen / strep à 400 ml de DMEM / F12. </li></ol> 2. Prélèvement d&#39;échantillons d&#39;urine <ol><li> Demander aux patients de boire des liquides 30 min avant la collecte d&#39;urine pour se assurer qu&#39;une quantité adéquate (~ 30-40 ml) d&#39;urine peut être collectée. </li><li> Donner aux patients et / ou leurs tuteurs un kit de collecte d&#39;urine contenant les éléments suivants: (1) des instructions écrites sur la façon d&#39;obtenir l&#39;échantillon captures d&#39;urine stérile ou propre, (2) toilettes anti-bactériennes humides, et (3) un 100 ml stérile collecte de spécimens tasse. Demander aux patients pour recueillir l&#39;échantillon. </li><li> Placer immédiatement les échantillons d&#39;urine sur la glace et transfert à l&#39;laboraTory dans une glacière. Traiter l&#39;urine pour l&#39;isolement cellulaire immédiatement. Si un retard est inévitable, stocker les échantillons sur la glace jusqu&#39;à 4 heures avec une perte minimale de la viabilité cellulaire. </li></ol> 3. Isolement et expansion des cellules d&#39;urine REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles dans un Cabinet de sécurité biologique BSL2. <ol><li> L&#39;aide de pipettes stériles, les échantillons d&#39;urine pour le transfert stériles tubes de centrifugation de 50 ml. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant laissant 1 ml dans le tube; attention à ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension et de combiner les pellets à partir de tubes multiples dans 7 ml de tampon de lavage et répéter centrifugation à 400 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Aspirer soigneusement le surnageant, en laissant le culot de cellules et de ~ 0,2 à 0,5 ml de surnageant. Remettre en suspension dans 2-3 ml de Progenitor urinaire cellulaire (UPC) à moyen et à transférer la suspension dans 4-6 puits d&#39;une nonplaque de 24 puits revêtue. </li><li> Après 72 h, compléter la culture avec 0,5 ml de milieu frais UPC par puits et changer moyenne tous les 2-3 jours après. Les érythrocytes et des cellules squameuses qui ne se attachent pas à la plaque seront enlevés avec les moyennes changements. </li><li> Surveiller la culture après 4-6 jours. Remarque: Les petits 2-4 colonies de cellules vont commencer à apparaître. Les cellules seront arrondies ou allongées qui représentent de type I ou II de l&#39;épithélium rénal (RE) des cellules respectivement 3. </li><li> Changer le support tous les 2-3 jours car une fois les cellules apparaissent, ils seront soumis à une phase d&#39;expansion rapide. </li><li> Une fois que les cellules atteignent 80-90% de confluence, autour de 9-15 jours après placage, et le passage dissocier les cellules (15,000-18,000 cellules / cm 2) sur 2-4 puits de plaque à 24 puits pour poursuivre son expansion. Marquer comme ce passage d&#39;une cellule (P1). </li><li> Caractériser les cellules d&#39;urine pour les spécifications de la lignée à travers l&#39;analyse de cytométrie en flux, immunohistochemcoloration ical ou par réaction en chaîne de polymérase-transcriptase inverse (RT-PCR). </li><li> Reprogrammer des cellules isolées d&#39;urine (section 4) ou congelez-les dans un milieu de congélation (DMEM complété avec 10% de sérum et 10% de DMSO) pour cryoconservation à long terme. </li></ol> 4. urine cellulaire Reprogrammation Utilisation Sendai Virus NOTE: La manipulation et l&#39;utilisation des EPI (équipements de protection individuelle) est recommandée lors de la manipulation des agents de transfection. Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles dans un Cabinet de sécurité biologique BSL2. L&#39;élimination appropriée des transfection de cellules de l&#39;agent et / ou transfectées est recommandé d&#39;éviter tout risque de risques environnementaux et sanitaires. Pour l&#39;urine cellules reprogrammation, utiliser une reprogrammation Kit Sendai avec des modifications du protocole d&#39;alimentation dépendant du fabricant tel que détaillé ci-dessous. <ol><li> Pour assurer la reprogrammation de haute efficacité utilisant le virus Sendai, l&#39;utilisation des passages 1-5 de cellules d&#39;urine qui sont rapideLy divisant. Si les cellules ne se répliquent pas bien ou deviennent sénescentes, jetez-les car ils ne seront pas reprogrammer efficacement. </li><li> Seed 60 000 cellules par puits dans deux puits d&#39;une plaque à 6 puits. Marquer ce que la Journée -2. Régler la densité d&#39;ensemencement des cellules (5 x oct 4 à 9 x 10 4 cellules par puits) comme nécessaire pour atteindre 80 à 90% de confluence au jour 0. </li><li> Le jour 0 (48 h après étalement des cellules), préparer les vecteurs de reprogrammation Sendai (DVE) contenant chacun des quatre facteurs de OSKM. Ajouter chacun des vecteurs à 1 ml de milieu préchauffé UPC. Utiliser une MOI de 1 à 1,5 (de 5 à 7,5 x 10 5 CIU), qui est suffisante pour la reprogrammation des cellules d&#39;urine. Aspirer le milieu et ajouter lentement 1 ml de la UPC + SeV à une bien des cellules d&#39;urine. Utilisez la seconde ainsi que la transduction contrôle négatif. </li><li> Le Jour 1, remplacer le milieu UPC + SeV avec le milieu UPC frais. Certains mort cellulaire est observée après 24 h en raison de la cytotoxicité virale. </li><li> Selon efficacité de Clon reprogramméformations e et la morphologie compacte, ne cessent de changer le milieu tous les jours jusqu&#39;au jour 6 ou 7. </li><li> Un jour avant la dissociation des cellules transduites (jour 5 ou 6), préparer des plaques d&#39;alimentation MEF par placage mitomycine C (10 ug / ml pendant 3 heures)-MEF traitées à une densité de 5 x 10 4 cellules / cm 2, sur 0,1 % de gélatine enduite 100 mm 2 plats de culture. </li><li> Le lendemain (jour 6 ou 7), dissocier les cellules avec 0,25% de trypsine, remettre en suspension les cellules dans du milieu UPC et de la plaque 5 x octobre 4-2 x 10 5 cellules / mm 2 100 MEF plaque d&#39;alimentation. </li><li> Le lendemain, passer à moyen hES et de changer le milieu tous les jours. Respecter les cellules sous un microscope pour surveiller cellules transformées. REMARQUE: Les cellules forment des agrégats clonales et une morphologie caractéristique pavée et ayant noyau supérieur rapport cytoplasmique (12-18 jours après transduction). </li><li> Dans les deux à trois semaines après la transduction, prélever des colonies et de les transférer sur de nouvelles plaques pour clonextension al. </li><li> Effectuer la coloration de cellules vivantes pour la sélection de clones iPSC en incubant des cellules avec TRA-1-81 anticorps pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur CO 2 suivie d&#39;une contre-coloration avec un colorant fluorescent spécifique conjugué anticorps secondaire pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur CO 2. </li><li> Utilisez un G 1½ aiguille 26 pouces de contre-éclore les grands TRA-1-81 clones positifs iPSC en petits morceaux de taille égale (4-6 pièces par clone). </li><li> Utiliser une pipette à pointe stérile pour ramasser et le transfert de 10 à 20 pièces hachurées de multiples clones dans chaque puits de Matrigel (10 ug / cm 2) doté d&#39;un revêtement plaque à 24 puits avec du milieu hES. REMARQUE: Pièces d&#39;un clone unique plaqué individuellement dans un seul puits ne étendre ou de maintenir la pluripotence. </li><li> Changer de hES à moyen iPSC 24-48 heures après les clones reprogrammées sont attachés à la surface Matrigel. </li><li> Lors de l&#39;entretien sur des plaques enduites de Matrigel, SCRA manuellementpe-off des cellules différenciées ou contaminantes cellules nourricières MEF aide d&#39;une pipette à pointe pour enrichir iPSC (MD-iPSC) clones dystrophiques entièrement reprogrammées et pluripotentes. </li><li> Après clones individuels ont atteint ~ 100 taille um, d&#39;élargir les clones en dissociant avec mM d&#39;EDTA 0,48 (acide éthylènediaminetétraacétique) solution pendant 3 min et le placage de petits agrégats de cellules de MD-iPSCs en suspension dans du milieu iPSC (additionné de 5 uM Y27632, la Rho kinase inhibiteur ) sur matrigel frais (10 ug / cm 2) revêtu 12 plaque bien. Changer le milieu iPSC quotidienne. </li><li> La reprogrammation complète de chaque clone peut être déterminée à la fois par analyse d&#39;expression génique de gènes de OSKM et la coloration immunohistochimique de marqueurs de la pluripotence (Oct3 / 4 et TRA-1-81). Une évaluation rigoureuse du potentiel de la pluripotence devrait être utilisée pour confirmer lignes iPSC entièrement reprogrammées peuvent se différencier en trois feuillets embryonnaires. Ceci peut être réalisé soit en corps embryoïdes (EB) la formation et de la différenciation ou d&#39;un dosage teratoma formation dosage. </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+as+a+Model+for+Familial+Dilated+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Modélisation des maladies cardiovasculaires à l&#39;aide CSPi devient une approche commune pour comprendre la contribution génétique 4-6. Certaines difficultés imprévues d&#39;obtenir des échantillons de cellules de patients, en particulier les jeunes enfants, peuvent être évités en offrant la possibilité d&#39;une approche non invasive comme une collection d&#39;urine. Dans cette jeune population de patients, il est souvent difficile de recueillir un volume d&#39;urine suffisante pour produire des cellules d...

La cardiomyopathie est la deuxième principale cause de décès chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne et de Becker (MD). Bien que des mutations dans le gène de la dystrophine liée à l&#39;X se produisent dans une: 3500 naissances masculines, on sait très peu sur les événements moléculaires et cellulaires conduisant à une dégradation progressive du muscle cardiaque. cellules souches pluripotentes humaines induites provenant de patients atteints de dystrophie musculaire ont émergé comme un nouvel outil pour étudier les mécanismes de la maladie sous-jacents et à utiliser pour le dépistage de drogues 1,2. Le malaise prévue de biopsies de la peau ou des échantillons de sang peut dissuader les jeunes patients et / ou leurs tuteurs de donner son consentement pour la participation à l&#39;étude. Les échantillons d&#39;urine sont une source non invasive de cellules somatiques qui sont amendable des procédés de reprogrammation. Nous avons récemment montré que les cellules d&#39;urine prélevés de patients atteints de dystrophie musculaire peuvent être cultivées et efficacement reprogrammé en utilisant CSPi transduction rétrovirale avec les facteurs Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, et c-Myc; OSKM) 1. L&#39;inconvénient de délivrance de gène rétroviral est l&#39;intégration aléatoire de gènes de reprogrammation dans les chromosomes de l&#39;hôte. Pour surmonter cette limitation, nous avons utilisé le virus Sendai non-intégration pour la reprogrammation des cellules d&#39;urine. Ce protocole détaille le virus Sendai reprogrammation des cellules isolées urine de patients atteints de dystrophie musculaire qui peut ensuite être différenciées en cardiomyocytes ou d&#39;autres types de cellules pour une étude plus approfondie. Ce protocole peut également être adapté à d&#39;autres maladies spécifiques des patients.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>4 Oz. Gobelet à échantillons avec couvercle</td><td>STL</td> Medical <td>Supply M9AMSAS340</td><td>pour le prélèvement d’échantillons d’urine</td></tr><tr><td>15 ml BD-Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml BD-Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Couvertures rondes en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Life</td><td>Technologies</td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep sans glutamine&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>B-27 Supplément avec insuline (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>B-27 Supplément sans insuline (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Versene, 1:5 000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro ; g)</td><td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Cartouches de compteur de cellules</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Sérum knockout (500&nbsp ; ml Bouteille)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Culture cellulaire de récupération Congélation Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant</td></tr><tr><td>utilisation Mélange nutritif F-12 de Ham&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>EGF Protéine humaine recombinante, Liquid Form</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311L</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Insuline, Recombinant Humain, Zinc Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5940</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK (Y-27632)</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>hESC Qualified Matrix, LVED Free</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de Synthèse d’ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Qualifié</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Adénine Bioréactif</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Toxine cholérique de Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Holo-transferrine de l’homme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine sel sodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp ;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aquous milieu de montage</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>Mouse anti CD44 - étiqueté avec FITC&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti CD146 - étiqueté avec PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti CD73 - marqué avec PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-&alpha ;-action musculaire lisse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-Vimentine</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti - TRA-1-81</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti Oct 3/4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti Dystrophine</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de dystrophie musculaire patients: efficace reprogrammation libre-intégration de l&#39;urine cellules dérivées

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Cardiomyopathie dystrophique est une conséquence mal compris de la dystrophie musculaire. Générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP) provenant de patients atteints de dystrophie musculaire est une source précieuse cellulaire pour des systèmes de modèles in vitro de la maladie à l&#39;intérieur et peut être utilisé pour des études de criblage de médicaments. Les cellules d&#39;urine provenant de patients ont été utilisés dans une reprogrammation réussie dans les cellules souches pluripotentes induites afin de modéliser une cardiomyopathie dystrophique. Répondre aux préoccupations de l&#39;intégration des systèmes de vecteurs de sécurité, nous présentons un protocole utilisant un vecteur de virus Sendai non-intégration pour la transduction de Yamanaka facteurs dans les cellules d&#39;urine prélevés chez des patients atteints de dystrophie musculaire. Ce protocole génère entièrement reprogrammé clones dans les 2-3 semaines. Les cellules pluripotentes sont indemne de vecteurs par passage-13. Ces CSPi dystrophiques peuvent être différenciées en cardiomyocytes et utilisés soit pour étudier les mécanismes de la maladie ou pour le dépistage de la drogue.

La plupart des cellules souches isolées à partir d'urine humaine sont positives pour les marqueurs progénitrices et péricytes uroépithéliales tels que CD44, CD73, et CD146 (97,37%, 97,09% et 97,3%, respectivement: la figure 1A et 1B). Ces cellules ont également exprimé d'autres marqueurs mésenchymateuses tels que l'alpha-actine musculaire lisse et vimentine (figure 1B). Analyse RT-PCR donne la preuve d'une population mixte de cellules dans les cultures en ce qu 'une fai...

Ce protocole implique des procédures détaillées pour l’isolement des cellules dérivées de l’urine de patients atteints de dystrophie musculaire ; leur reprogrammation efficace et rapide par transduction du virus Sendai.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de l&#39;urine cellules dérivées

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer efficacement des cellules souches pluripotentes induites ou IPSC à partir de patients atteints de dystrophie musculaire à partir de cultures cellulaires dérivées de l’urine et d’une méthode de reprogrammation sans intégration. Ceci est réalisé en prélevant d’abord des échantillons d’urine de patients atteints de dystrophie musculaire. Dans un deuxième temps, les cellules urinaires sont isolées et développées dans des cultures de cellules dérivées de l’urine.Ensuite, les cellules dérivées de l’urine sont transduites avec le virus Sendai contenant des facteurs Yamanaka et des colonies pluripotentes typiques émergent après 12 jours. En fin de compte, par le passage 13, l’état libre de transgènes des cellules souches pluripotentes peut être confirmé par l’analyse R-T-P-C-R. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la reprogrammation de fibroblastes cutanés isolés à l’aide de vecteurs lentiviraux est qu’avec cette technique, les cellules somatiques peuvent être obtenues de manière non invasive auprès des patients et utilisées pour générer efficacement les IPC en utilisant une méthode de reprogrammation virale à empreinte zéro.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la dystrophie musculaire, telles que la façon dont ces conditions peuvent être modélisées in vitro sans problèmes de sécurité pour une application humaine. Mohammad Zishan Al, un boursier postdoctoral, Courtney Guesting, un technicien et Melanie Ryder, une étudiante diplômée, tous trois de mon laboratoire. Pour prélever un échantillon d’urine, commencez par conseiller au patient de boire des liquides 30 minutes avant le prélèvement afin de s’assurer qu’environ 30 à 40 millilitres d’urine peuvent être prélevés. Lorsque le patient est prêt, donnez-lui une trousse de prélèvement d’urine contenant les articles suivants, des instructions écrites sur la façon d’obtenir des toilettes antibactériennes stériles ou propres, plus accrocheuses et humides, et un gobelet de prélèvement d’échantillons stériles de 100 millilitres.Une fois l’échantillon prélevé, placez immédiatement le gobelet de prélèvement sur de la glace et transférez-le au laboratoire dans une glacière. Ensuite, utilisez des pipettes stériles pour transférer l’échantillon d’urine dans des tubes à centrifuger stériles de 50 millilitres, et faites tourner les tubes à 400 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, dans une BSL, deux enceintes de sécurité biologique aspirent tout sauf le dernier, millilitre du surnageant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.Ensuite, lavez les cellules dans sept millilitres de tampon de lavage et faites tourner les cellules à nouveau. Cette fois-ci, il a aspiré tous les millilitres sauf le dernier, environ 0,2 à 0,5 millilitres du surnageant. Maintenant, réutilisez la pastille dans deux à trois millilitres de cellule progénitrice urinaire ou de milieu UPC et transférez la suspension dans quatre à six puits d’une plaque non revêtue de 24 puits après 72 heures, complétez la culture avec 0,5 millilitre de milieu UPC frais par puits.Surveillez la culture pendant quatre à six jours d’incubation. De petites colonies cellulaires de deux à quatre cellules arrondies ou allongées représentant respectivement des cellules épithéliales rénales de type un ou de type deux devraient commencer à apparaître. Continuez à changer de milieu tous les deux à trois jours.Comme les colonies subiront une phase d’expansion rapide après environ neuf à 15 jours de culture, les cellules devraient être confluentes à 80 à 90 % à ce stade, divisez les cellules sur deux à quatre puits d’une plaque de 24 puits pour une expansion supplémentaire. En marquant cette culture comme passage cellulaire un, les cellules urinaires peuvent ensuite être caractérisées pour des marqueurs spécifiques à la lignée par analyse cytométrique en flux, coloration immunohistochimique ou par réaction en chaîne par polymérase à transcriptase inverse pour assurer une reprogrammation à haute efficacité jusqu’à 60 000 cellules par puits avant la graine de transduction. D’un passage une à cinq cultures dans deux puits d’une plaque à six puits le jour zéro.Préparez le vecteur de reprogrammation de Sendai en ajoutant chacun des quatre facteurs OSKM à un MLI approprié pour la reprogrammation à un millilitre de milieu UPC préchauffé, aspirez le milieu de suspense et ajoutez lentement la suspension virale à un puits de cellules urinaires pendant les six jours suivants. Remplacer quotidiennement le surnageant par un milieu UPC frais le cinquième jour sur une plaque de graines de mitomycine traitées MES sur des boîtes de culture de 100 millimètres carrés enrobées de gélatine le sixième jour. Dissociez les cellules urinaires avec de la trypsine, mettez-les en suspension dans un milieu UPC et plaquez-les à cinq fois 10 de la quatrième à deux fois 10 de la cinquième cellule par plaque d’alimentation de méthamphétamine.Le lendemain, remplacez le milieu UPC par un milieu au stade embryonnaire humain ou HES et surveillez les cellules au microscope pour observer les cellules transformées environ 12 à 18 jours. Après la transduction, les cellules doivent former des agrégats clonaux avec une morphologie de pavé caractéristique et un rapport noyau/cytoplasme plus élevé. Pour identifier les clones IPSC reprogrammés, effectuez une coloration de cellules vivantes pour un anticorps TRA 180 1.Ensuite, utilisez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 26 pour hachurer les agrégats clonaux positifs TRA 180 1 en quatre à six petits morceaux de taille égale par clone. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélevez et transférez 10 à 20 morceaux hachurés de plusieurs clones dans chaque puits. Medium, 24 à 48 heures après que les clones reprogrammés ont été plaqués sur la surface du matrigel.Remplacez le support par un support IPSC. À l’aide d’une pointe de pipette, on peut gratter manuellement les cellules différenciées ou les cellules contaminantes qui se nourrissent de méthamphétamine afin de faciliter la purification des clones IPSC dystrophiques pluripotents entièrement reprogrammés. Une fois que les clones ont atteint une taille d’environ 100 micromètres, dissociez les cellules avec de l’EDTA pendant trois minutes, puis mettez en plaque de petits agrégats cellulaires de l’IPSC dystrophique reprogrammé, en suspension dans un milieu IPSC complété par un inhibiteur de kinase RO sur une plaque de 12 feuilles de matrigel fraîche.Enfin, confirmez la pluripotence de chaque clone par l’analyse de l’expression génique et la coloration immunohistochimique. Pour les marqueurs pluripotents, la plupart des cellules isolées dans l’urine humaine sont positives pour les marqueurs de cellules progénitrices et souches tels que CD 44, CD 73 et CD 1 46. Les cellules présentent également des marqueurs mésenchymateux tels que l’alpha, le muscle lisse, l’actine et le menton.R-T-P-C-R des cellules isolées fournit la preuve d’une population mixte de cellules dans les cultures. En ce qu’il y a une faible expression de la cytokératine sept et de l’UIN un A et trois marqueurs a des cellules euro-épithéliales. Les cellules urinaires se transforment de cellules allongées de type deux le jour zéro en un motif pavé au quatrième jour de la reprogrammation.Au 12e jour, des clones pluripotents typiques sont observés et sont capables de maintenir leur morphologie pluripotente dans des conditions exemptes de nourrisseurs. La coloration des cellules vivantes pour TRA 180 1 peut être utilisée pour identifier les clones reprogrammés. Pour confirmer la génération de vecteurs et de transgènes, des clones pluripotents libres, R-T-P-C-R, peuvent être réalisés à l’aide d’amorces contre le génome du virus Sendai et chacun des facteurs OSKM exogènes.L’expression des gènes exogènes n’est plus détectée par le passage 13, mais on observe la régulation positive des facteurs endogènes. La coloration immunofluorescente confirme l’expression de marqueurs pluripotents sur les IPC mais pas sur les cellules urinaires. L’expression de la protéine et du gène de la dystrophine peut ensuite être vérifiée par d’autres colorations immunofluorescentes, western blot et R-T-P-C-R respectivement, comme démontré avec ces images représentatives provenant d’un contrôle de type sauvage et de lignées cellulaires dystrophiques.Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour réaliser une reprogrammation sans ène de l’ucs. En quelques semaines Suite à cette procédure, nous pouvons différencier les IPC en cardiomyocytes ou en myocytes squelettiques afin d’approfondir les mécanismes à l’origine de la dystrophie musculaire.

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Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de l'urine cellules dérivées

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