L'immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

Le présent travail illustre la commodité de l’utilisation de l’immunothérapie sublinguale pour stimuler la réponse immunitaire innée dans les poumons et conférer une protection contre la pneumonie pneumococcique aiguë chez la souris.

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser l’immunothérapie sublinguale pour stimuler la réponse immunitaire innée dans les poumons et la protection contre la pneumonie pneumococcique mortelle. Chez la souris, la première étape consiste à administrer une solution avec le drapeau de l’agent immunostimulant dans la muqueuse sublinguale de la souris anesthésiée. Ensuite, une suspension contenant une dose létale d’une souche génique de pneumonie à streptocoques est instillée par racine intranasale à des souris anesthésiées préalablement traitées avec une ligne plate ou une solution saline comme témoin.

Le lage broncho-bilaire est effectué pour analyser la sous-population infiltrant les voies respiratoires et le tissu pulmonaire est traité pour obtenir une suspension unicellulaire pour la caractérisation phénotypique de la population cellulaire. La cytométrie en flux multiparamétrique mandibulaire, les ganglions lymphatiques mandibulaires accessoires ainsi que le tissu sublingual peuvent également être traités pour effectuer une cytométrie en flux ou d’autres analyses en aval. Populations cellulaires infiltrant les voies respiratoires.

Les poumons ou la muqueuse sublinguale peuvent être identifiés par phénotypage immunitaire et cytométrie en flux multiparamétrique L’activation immunitaire dans différents tissus après une immunothérapie sublinguale peut également être analysée en étudiant le profil de transcription par PCR en temps réel. Bienvenue au Laboratoire de recherche sur les vaccins du Département de biotechnologie, nous allouons l’école de médecine, Université de U.L’un des principaux intérêts de notre laboratoire est de générer de nouvelles stratégies d’intervention immunitaire contre les infections respiratoires. La voie internasale a été utilisée avec succès pour l’administration d’agents immunostimulants pour traiter ou prévenir l’infection pulmonaire ou une autre théologie.

Nous avons montré que l’administration intranasale, le composant du gel bactérien, peut être utilisée efficacement pour briser l’infection pulmonaire en cours causée par les souris STO. Bien que la racine intranasale nécessite normalement une faible dose de l’agent thérapeutique et induise une forte réponse dans les voies respiratoires, elle présente certains inconvénients tels que la possibilité d’une toxicité du système nerveux central et d’une paralysie faciale associée à l’absorption de composés immunostimulants à travers les nerfs oratoires. Par conséquent, nous avons mis en place un modèle d’immunothérapie UAL comme alternative pour induire une immunité protectrice contre la pneumonie à pneumocoque.

L’immunothérapie sublinguale offre une alternative plus sûre par rapport à l’installation intranasale. Il est non invasif, indolore et simple. Bien qu’il puisse nécessiter des doses plus élevées d’un agent thérapeutique, il peut être utilisé pour administrer des produits NA ou pharmaceutiques afin de moduler la réponse immunitaire dans la durée.

Nous allons maintenant vous montrer comment effectuer une administration sublinguale chez la souris en utilisant le flatteur comme agent thérapeutique. L’immunothérapie subine avec flatteur peut éventuellement protéger les souris contre une provocation intranasale mortelle avec une pneumonie à streptocoque en déclenchant une réponse immunitaire innée dans les poumons. Nous aborderons également la caractérisation de la longueur, de la réponse innée pendant l’infection et après l’immunothérapie sublinguale à l’aide de la géométrie fluide et de la PCR en temps réel.

Enfin, nous vous montrerons comment prélever des ganglions lymphatiques locaux et des tissus sublinguaux pour une analyse plus approfondie. Après avoir préparé la solution de l’agent stimulant à tester, anesthésier les animaux en administrant 200 microlitres de la solution de kétamine OSI par injection interpéritonéale à Pet, la solution contenant l’immunostimulant dans un volume maximal de 10 microlitres. Prenez ensuite la souris avec votre main gauche et tenez-la à l’aide de votre pouce et de votre index avec votre main libre.

Placez délicatement la pince fermée sous la langue et maintenez-la en place. À l’aide de votre majeur et de votre annulaire, prenez la pipette et administrez la solution sur le plancher de la bouche et la face dorsale de la langue. Retirez la pince et laissez la bouche reposer pendant trois à cinq minutes avant de la remettre dans la cage.

Les principales caractéristiques de cette technique sont le volume total utilisé pour traiter les animaux et l’anesthésie. La petite taille de la cavité buccale chez les souris limite le volume maximum pouvant être appliqué au rapport sublingual à 10 microlitres. Une fois la dose décidée, vous devez ajuster la concentration de l’échantillon à ce volume maximum.

Des volumes plus importants pourraient entraîner une ingestion ou une aspiration indésirable de la solution. L’anesthésie est cruciale pour éviter l’ingestion et permettre la pénétration des substances à travers l’épithélium. Nous vous conseillons de ne pas utiliser l’inhalation sous anesthésie car les souris se réveilleront trop tôt.

Notez que certains anesthésiques injectables peuvent induire la salivation chez la souris. Si cela se produit, utilisez un petit morceau d’ajustement ou de papier pour éliminer la salivation excessive avant d’appliquer la solution avec l’agent thérapeutique, la dose de l’agent thérapeutique doit être ajustée pour maximiser son effet et il est fortement recommandé de tester plusieurs doses. Si vous avez déjà utilisé votre composé par racine intranasale, une dose cinq à 10 fois plus élevée serait un bon point de départ pour tester.

Testez votre agent thérapeutique par la racine sublinguale. Notez que l’absorption par l’épithélium sera limitée par la taille de la molécule décongélation Une aliquote du stock de travail préalablement préparé de la pneumonie à streptocoque de l’indice CFU bactérien connu centrifuge pendant cinq minutes à 2 500 G et jeter le supernat Suspendre dans un millilitre de sérum physiologique et centrifuger. Encore une fois, jetez le surnageant, puis mettez-vous au repos.

Suspendre la pastille dans le volume approprié de solution saline stérile pour obtenir une suspension de quatre fois 10 à cinq UFC dans 50 microlitres, ce qui correspond à la dose bactérienne minimale du sérotype particulaire utilisé qui provoque une mortalité de 100 % dans le bulbe C.Les souris prennent 50 microlitres de la suspension bactérienne et instillent soigneusement le volume total dans les narines d’une souris préalablement anesthésiée. Tenez la souris à la verticale pendant deux minutes et laissez-la reposer en position dorsale pendant deux minutes supplémentaires. Après le défi, confirmation des numéros d’UFC dans la suspension bactérienne en effectuant une dilution en série de la suspension par dix et en les plaquant sur du sang.

Plaque de gélose Incuber toute la nuit à 37 degrés avec 5 % de muco CO2. Les colonies d’ethno se distinguent par le vert alo caractéristique des bactéries alpha-hémolytiques. Compter les unités formant colonies et consigner l’utilisation de la dose de provocation.

Après avoir euthanasié l’animal, ouvrez la cavité thoracique jusqu’au cou. Faites une incision le long des pattes avant pour exposer la trachée et la zone sublinguale. Identifiez les ganglions lymphatiques mandibulaires.

Ceux-ci apparaissent généralement sous la forme de structures de forme ovale blanchâtre reposant sur les glandes salivaires. À l’aide de la pince à pointe fine, tirez doucement le tissu sublingual vers le haut et exposez la face dorsale du plancher de la bouche. Prélevez les ganglions lymphatiques mandibulaires en tirant doucement vers le haut avec la pince à pointe mince pour les libérer du tissu.

Placez-les dans un tube contenant C-R-P-M-I ou une solution de conservation d’acide nucléique selon la procédure en aval. Cela serait fait plus tard. Identifiez maintenant les petits ganglions lymphatiques situés plus profondément des deux côtés de la gorge et retirez-les.

Ce sont les ganglions lymphatiques mandibulaires accessoires. Ouvrez la cavité thoracique pour exposer le poumon et retirez le thymus. Coupez le binna CVA inférieur et retirez l’excès de sang avec un tissu absorbant pour effectuer le lavage broncho.

Tout d’abord, exposez la trachée. Faites ensuite une petite incision avec un scalpel et introduisez une pointe fine. Transférez le peppe préalablement rempli d’un millilitre de PBS sans calcium et de magnésium plus un millimolaire d’EDA Instillez et aspirez soigneusement le volume total au moins trois fois.

Ensuite, aspirez et transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Perfuser les poumons en injectant cinq millilitres de PBS sans calcium et magnésium plus un millimolaire d’EDTA dans le ventricule droit du cœur pour éliminer tous les globules rouges et les cellules immunitaires présents dans les vaisseaux sanguins des poumons. Si la perfusion a été effectuée correctement, la couleur des poumons passera du rose au blanc.

Retirez le cœur, prenez les poumons perfusés et placez-les dans un milieu complet ou une solution de conservation d’acide nucléique en fonction de l’analyse en aval à effectuer. Si vous souhaitez analyser la population cellulaire de la muqueuse sublinguale, isolez la tête de l’animal et retirez les glandes salivaires et fixez les tissus mous. Faites une incision de chaque côté de la bouche jusqu’à ce qu’elle atteigne l’articulation de la mandibule et séparez la mâchoire inférieure de la langue et le plancher de la bouche.

À l’aide d’une paire de pinces à dents de rat émoussées, tirez la langue vers le haut et faites une incision à l’endroit où la base de la langue rencontre le plancher de la bouche. Cette zone constitue la muqueuse sublinguale. Coupez et retirez la langue à l’aide d’un poinçon de biopsie, d’une pince et de ciseaux.

Découpez le tissu muqueux sublingual et placez-le dans un tube propre. Transférez les poumons dans une plaque de 24 puits et signifiez-les avec une paire de ciseaux propres. Ajouter un millilitre de milieu de digestion en pipetant plusieurs fois de haut en bas et incuber à 37 degrés et 5 % de CO2 pendant 40 minutes après l’incubation.

Tournez à nouveau la pipette de haut en bas pour vous assurer que la plupart des cellules ont été libérées du tissu. Transférez la suspension cellulaire sur une crépine de 40 micro-mailles et lavée avec cinq millilitres de PBA. Centrifugeuse EDTA de cinq millimolaires à 2 500 GS cinq minutes.

Reus suspendent les cellules dans un millilitre de fax EDTA composé de PBS sans calcium et de magnésium, un millimolaire d’EDTA et 1 % de sérum de boing fœtal. Prenez un QU et faites une double dilution des cellules avec trip et bleu et comptez Reus en suspension des cellules à une concentration de deux fois 10 à sept cellules par millilitre et ajoutez 50 microlitres par tube. Ajoutez 50 microlitres d’un mélange d’anticorps deux fois dans chaque tube pour une analyse immunophénotypique.

Incuber pendant 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité après s’être lavé trois fois avec des faits. EDTA remettre en suspension les cellules dans 200 microlitres de faits EDTA et analyser dans un cytomètre la même procédure peut être utilisée pour analyser la population cellulaire dans le tissu sublingual en utilisant des milieux de digestion contenant cet espace. L’immunothérapie sublinguale par la collagénase et la DS one à l’aide d’une flatline purifiée, un agoniste de TLR cinq et LC quatre, a induit une régulation positive significative des niveaux d’ARNm des chimiokines et des cytokines impliquées dans le recrutement des neutrophiles dans les poumons.

Cela a également été observé pendant l’infection. Le recrutement de PMN dans les poumons a été confirmé par cytométrie en flux. Le traitement sublingual par cinq agonistes du TLR était corrélé à une survie accrue des animaux et à une protection contre la pneumonie à pneumocoque.

Nous avons montré que l’immunothérapie sublinguale est un moyen efficace d’induire une protection dans les lignes contre la pneumonie pneumococcique invasive PNE. Cela a été réalisé par l’installation sublinguale de lain, un tailleur à cinq agonistes qui n’est pas produit par une pneumonie histologique. L’installation sublinguale de lain a induit une régulation positive de la chimiokine C Xcl L one dans les lignes, ainsi que l’infiltration de neutrophiles.

Un type de cellules cruciales pour l’élimination du pneumocoque, l’immunothérapie sublinguale avec des agonistes du TLR pourrait être utilisé pour traiter les infections seules ou en combinaison avec les thérapies actuelles comme l’antibiothérapie afin de prévenir la dissémination bactérienne et le développement de formes graves d’infection. La racine sublinguale peut également être utilisée pour administrer le vaccin et elle s’est avérée efficace pour induire une immunité protectrice muqueuse et systémique. Cette stratégie est particulièrement intéressante dans le cas des infections respiratoires et en particulier pour les pneumonies de bro car elle pourrait non seulement prévenir la maladie de base, mais aussi la colonisation assale bloquant la bactérie au niveau du sport d’entrée.

Dans l’ensemble, nous pensons que la voie sublinguale est une alternative intéressante pour développer de nouvelles stratégies de traitement ou de prévention des infections respiratoires. Nous vous encourageons à essayer cette technique.