Name: Limmunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 56 s
Description: Découvrez l'immunothérapie sublinguale pour renforcer l'immunité innée pulmonaire chez la souris. Cette méthode protège contre la pneumonie pneumococcique létale et offre une alternative sûre à l'administration intranasale.

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Nous remercions le Dr Jean-Claude Sirard du Centre d’Infection et d’Immunité de Lille, Institut Pasteur de Lille-France, pour avoir aimablement fourni la flagelline purifiée et le Dr Teresa Camou, Directrice du Laboratoire National de Référence, Ministère de la Santé de l’Uruguay, pour avoir aimablement fourni la souche pneumococcique. 
Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à M. Diego Acosta et M. Ignacio Turel de BichoFeo Producciones-Uruguay pour leur engagement et leur travail acharné tout au long de la production et de l’édition de la vidéo. 
Ce travail a été soutenu par les subventions PR_FCE_2009_1_2783 et BE_POS_2010_1_2544 de l’Agence nationale de recherche et d’innovation, ANII de l’Uruguay, du Programme de développement des sciences fondamentales, PEDECIBA de l’Uruguay et de la Commission sectorielle de la recherche scientifique, CSIC-Universidad de la República, Uruguay.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;administration sublinguale d&#39;agents thérapeutiques a été prouvé comme un moyen utile pour moduler la réponse immunitaire dans les voies respiratoires. Le principal avantage de VSL pour le traitement des maladies respiratoires est qu&#39;elle n&#39;implique pas la livraison directe des composés dans les poumons ou les narines, être sûr que les traitements basés sur l&#39;administration intranasale 31. L&#39;immunothérapie sublinguale peut être utilisé pour moduler la réponse immunitaire de différentes façons, que ce soit pour l&#39;induction de réponses de régulation qui peut améliorer les symptômes de l&#39;inflammation allergique et l&#39;asthme 32 ou à induire une activation transitoire de mécanismes immunitaires innées pour traiter des infections pulmonaires aiguës comme indiqué ici. Le modèle de souris présentée dans cette vidéo est un procédé commode pour le criblage de composés différents comme agents thérapeutiques pour fente. Ce modèle animal offre un moyen utile pour déterminer l&#39;impactde la SLIT dans la réponse immunitaire des poumons, ainsi que dans d&#39;autres organes (par exemple,. drainage des ganglions lymphatiques ou des sites distaux des muqueuses) qui ne peut pas être imitée par l&#39;utilisation de modèles in vitro. Bien qu&#39;il existe plusieurs documents qui décrivent les résultats obtenus en utilisant l&#39;immunothérapie sublinguale, méthodes détaillées pour les procédures de l&#39;administration sublinguale n&#39;ont pas encore été mis à disposition. En outre, le modèle peut être utilisé pour l&#39;évaluation de vaccins sublinguaux visant à conférer une protection systémique ainsi que locale dans les voies respiratoires. Comme montré dans la vidéo d&#39;accompagnement, l&#39;administration sublinguale de composés est une procédure simple qui peut être facilement réalisée sans qu&#39;il soit nécessaire de formation étendue. En règle générale, une personne compétent dans la manipulation des animaux, il faudra 1 heure pour effectuer SLIT dans un groupe de 10 souris en utilisant des anesthésiques injectables comme décrit dans ce protocole. Si la récusation contre le pneumocoque est effectuée ainsi, 90 min supplémentaire sera nécessaire pour préparerla suspension bactérienne et effectuer provocation intranasale des animaux. Les protocoles FACS présentés ici permettent de caractériser pratique de l&#39;impact de la fente sur le site de l&#39;administration locale, les ganglions lymphatiques drainant ainsi que leurs effets sur la dynamique des cellules des poumons. L&#39;analyse séparée de la teneur et du parenchyme pulmonaire bronchoalvéolaire est important de discriminer résidant à l&#39;abri de l&#39;infiltration des voies respiratoires et des types de cellules à partir de ceux qui restent à l&#39;intérieur du tissu. L&#39;analyse du contenu BAL permet l&#39;étude du chiffre d&#39;affaires des macrophages alvéolaires ainsi que la dynamique de recrutement des cellules dans les espaces alvéolaires induits par des traitements différents, par exemple., PMN, les éosinophiles, les monocytes. BAL peut également être utilisé pour évaluer la présence de cytokines et de chimiokines sécrétées par Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ou la détection d&#39;anticorps IgA sécrétées induites après vaccination par voie sublinguale. Etude du tissu du poumonpermettant la caractérisation d&#39;autres types de cellules, les cellules dendritiques Classiquement, les cellules T et les cellules B. Préparation des échantillons de LBA et les ganglions lymphatiques de l&#39;analyse FACS est simple. Après la collecte de l&#39;échantillon, normalement de 60 minutes sont nécessaires pour compléter le protocole de coloration pour 10-20 échantillons. En revanche, l&#39;isolement de cellules provenant de tissu pulmonaire ou par voie sublinguale, il faudra plus de temps car la digestion de la matrice extracellulaire est nécessaire. L&#39;absorption de l&#39;agent thérapeutique administré par voie sublinguale peut être adressée par le suivi de fluorescence des molécules radiomarquées ou en utilisant des systèmes d&#39;imagerie in vivo. L&#39;immunothérapie sublinguale est une méthode attrayante pour induire efficacement des réponses immunitaires de l&#39;appareil respiratoire ainsi que de manière systémique qui peut être utilisé pour traiter ou prévenir des troubles respiratoires. L&#39;élucidation des mécanismes de détermination de la tolérance par rapport à l&#39;activation de la réponse immunitaire dans les voies respiratoires après SLIT is cruciale pour permettre la conception rationnelle de nouvelles stratégies thérapeutiques qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec différents traitements disponibles contre les affections respiratoires.

L’objectif global de ce travail est d’illustrer les bénéfices de l’immunothérapie sublinguale pour le traitement des infections respiratoires aiguës (IRA) et de présenter les avantages de cette voie d’administration par rapport à d’autres voies d’administration, à savoir intranasale.
ARI causent des millions de décès chaque année, en particulier chez les enfants de moins de cinq ans. Streptococcus pneumoniae reste l’un des principaux agents étiologiques de la pneumonie bactérienne chez les nourrissons et les personnes âgées1,2. À l’heure actuelle, le principal traitement disponible repose sur l’utilisation d’antibiotiques mais des souches résistantes apparaissent continuellement3,4.
< classe p = 'jove_content'> SLIT induit des réponses larges au niveau systémique et aussi au niveau muqueux, en particulier au niveau des voies respiratoires5. Son efficacité a été prouvée contre l’infection grippale, favorisant une protection à long terme avec la production de réponses humorales et cellulaires6,7. En outre, il a été démontré que le traitement prophylactique avec des lysats bactériens délivrés par voie sublinguale réduisait les exacerbations de bronchite chronique obstructive chez les personnes âgées8 et prévenait les infections respiratoires récurrentes chez les enfants9. SLIT a été largement utilisé pour le traitement des allergies et de l’asthme. Des études cliniques avaient non seulement démontré son efficacité à moduler la réponse immunitaire dans les voies respiratoires, mais aussi son innocuité10. Malgré l’intérêt croissant des entreprises pharmaceutiques et des chercheurs pour le SLIT, les mécanismes impliqués dans l’induction des réponses immunitaires de la muqueuse après l’administration sublinguale de composés restent obscurs. Récemment, l’attention s’est portée sur les mécanismes favorisant la tolérance associés à la désensibilisation aux allergènes. Il a été proposé que les cellules résidentes et recrutées au niveau de la muqueuse sublinguale, comme les cellules dendritiques et les macrophages, peuvent favoriser la tolérance après SLIT11-13. Les cellules dendritiques de la muqueuse buccale peuvent favoriser les cellules T auxiliaires productrices d’IFN-gamma et d’IL-1011, ainsi que la recirculation vers la muqueuse génitale distale et favoriser les cellules T CD8+ 14. Cependant, on sait peu de choses sur l’impact de l’ITSL sur les cellules innées ou sur sa capacité à améliorer l’élimination des agents pathogènes lors d’infections respiratoires aiguës.
<classe p='jove_content'>Le contrôle naturel de l’infection pneumococcique dans les poumons dépend en grande partie de l’activation efficace et rapide des défenses innées locales. Nous avons précédemment montré que l’augmentation de l’immunité innée des poumons par une dose intranasale unique de flagelline (FliC), un agoniste de TLR5 et NLRC4, protège 75 à 100 % des souris exposées à une dose létale d’un isolat clinique de Streptococcus pneumoniae sérotype 1. Il a été démontré que cette protection dépendait du recrutement local de cellules GR1+ (probablement des polynucléaires neutrophiles, PMN) et non des anticorps, cellules B ou T15. 
La flagelline est le composant structurel du flagelle bactérien. Dans sa forme monomère, il est reconnu par deux récepteurs de reconnaissance d’agents pathogènes (PRR), TLR5 qui détecte la fliC16 extracellulaire et l’inflammasome NLRC4/NAIP5 qui détecte la flagelline17,18 intracellulaire. Lorsque la FliC est détectée par les PRR, une réponse inflammatoire importante est déclenchée. Nous et d’autres avons démontré que l’instillation de FliC purifié de Salmonella enterica sérovar Typhimurium dans les poumons entraîne une production rapide de chimiokines et de cytokines, en particulier lorsqu’elles sont reconnues par l’épithélium des poumons qui, à leur tour, orchestrent le recrutement de cellules immunitaires dans les voies respiratoires, principalement les PMN15, 19-21. Bien que transitoire, l’infiltration substantielle de neutrophiles qui a lieu dans les voies respiratoires après l’administration nasale de FliC pourrait être une préoccupation si l’on s’oriente vers des thérapies cliniques à usage humain. Une inflammation excessive pourrait être préjudiciable à la fonction pulmonaire. De plus, il a été démontré que l’administration intranasale de molécules immunostimulantes peut provoquer une paralysie faciale et/ou une toxicité cérébrale22-24. 
L’immunothérapie sublinguale offre une alternative plus sûre pour moduler la réponse immunitaire dans les voies respiratoires par rapport à la voie intranasale. Il est non invasif, indolore, simple et a une bonne observance du patient25. De plus, comme mentionné précédemment, il peut induire des réponses protectrices dans la muqueuse respiratoire sans les risques associés à l’administration intranasale ou intrapulmonaire directe de formulations. La voie sublinguale pourrait également être utilisée pour délivrer des molécules qui ont des effets importants sur le système immunitaire des poumons, mais qui se sont avérées toxiques ou qui provoquent une grande inflammation lorsqu’elles sont administrées par voie intranasale. Outre ces avantages, les formulations pour l’immunothérapie sublinguale ont un coût de fabrication inférieur puisque des produits non stériles peuvent être administrés par cette voie et le choc endotoxique n’est pas un problème pour l’ITSL. D’autre part, il convient de noter que des doses plus élevées de composés immunostimulants par rapport à celles utilisées par voie intranasale ou parentérale sont nécessaires pour induire une réponse immunitaire dans les poumons ; Des solutions hautement concentrées sont également nécessaires lors de l’utilisation du modèle murin de SLIT, car le site anatomique où les formulations sont déposées est petit. 
Sur la base de nos données publiées précédemment, nous avons développé un modèle de protection en utilisant l’immunothérapie sublinguale avec la flagelline comme immunostimulant modèle. Nous avons démontré qu’une dose unique de flagelline induisait une survie de 60 % contre la pneumonie pneumococcique invasive causée par la souche de sérotype 1, tandis que toutes les souris du groupe témoin sont mortes de l’infection dans les 5 jours. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’un plus grand nombre de PMN sont recrutés dans les voies respiratoires des animaux protégés après un traitement sublingual à la flagelle, suggérant que ces cellules pourraient être impliquées dans le mécanisme de protection induit par l’immunothérapie sublinguale. 
Cette vidéo montre en détail comment effectuer une immunothérapie sublinguale et aussi comment récupérer les tissus pertinents de la muqueuse sublinguale, drainer les ganglions lymphatiques ainsi que les poumons et les voies respiratoires pour effectuer une analyse plus approfondie. De plus, il illustre la technique générale de préparation cellulaire pour l’analyse FACS et montre brièvement comment préparer des suspensions de Streptococcus pneumoniae et comment effectuer des infections intranasales chez la souris pour mettre en place le modèle d’infection aiguë.

<table><tbody><tr><td>Solution de kétamine (50 mg/ml)</td><td>Pharma Service, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de xilacine (2 %)</td><td>Portinco S.A., Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue stérile de 1 ml</td><td>Modern, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguille stérile de 27 g</td><td>Modern, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>General Electric Health Care</td><td>E15885</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine Solution</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PBS stérile sans Ca2+/Mg2+</td><td>PAA</td><td>H21002</td><td></td></tr><tr><td>Type-I Collagenase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Déoxyribonucléase I (DNAse-I)</td><td>SIGMA</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 rat conjugué anti souris IgG2b anti CD11b</td><td>BD 550993</td><td></td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>APC hamster conjugué anti souris IgG1 anti CD11c</td><td>BD</td><td>550261</td><td>Clone HL3&nbsp ;</td></tr><tr><td>APC-Cy7 rat conjugué anti souris IgG2a anti Ly6G</td><td>BD</td><td>560600</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>Solution saline stérile</td><td>Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>BD Difco, France</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Sang de mouton défibriné</td><td>Biokey, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri stériles</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>p10 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000097</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipette</td><td>Capp</td><td>C200</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>Filtres stériles p10</td><td>Greiner</td><td>771288</td><td></td></tr> Pince à filtre <tr><td>stérile p200</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr> Pince à filtre <tr><td>stérile p1000</td><td>Greiner</td><td>750288</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BIOSAN</td><td>V1-plus</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pointe fine en acier inoxydable.</td><td>SIGMA</td><td>Z168785/Z168777</td><td>Courbée et droite</td></tr><tr><td>Pince à tissu de pansement</td><td>SIGMA</td><td>F4392</td><td>Longueur 8 pouces</td></tr><tr><td>Pince à micro-dissection</td><td>SIGMA</td><td>F4017</td><td>Droite&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pince à micro-dissection</td><td>SIGMA</td><td>F4142&nbsp ;</td><td>courbé</td></tr><tr><td>Ciseaux Mayo</td><td>SIGMA</td><td>Z265993&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>SAKIRA MEDICAL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopsie stérile Punch & Oslash ; 3mm</td><td>Stiefel Laboratories Ltd.</td><td>2079D</td><td>5 mm de diamètre peut également être utilisé</td></tr><tr><td>Tubes stériles 1,5 ml Deltalab</td><td></td><td>200400P</td><td></td></tr><tr><td>Tubes stériles 15 ml</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubes stériles 50 ml Tubes</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles 5 ml</td><td>Greiner</td><td>606160</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles 10 ml</td><td>Greiner</td><td>607160</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles 25 ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de sécurité biologique, classe II</td><td>série Thermo Scientific</td><td>1300, type A2</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Isolateur&nbsp ; Rack</td><td>RAIR&nbsp ; IsoSystem&nbsp ;</td><td>76144W</td><td>Super&nbsp ; Souris&nbsp ; 1800 AllerZone&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Heraeus</td><td>Biofuge-pico</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorval ST40R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur&nbsp ;</td><td>Modèle Thermo</td><td>Scientific&nbsp ; 3111</td><td></td></tr><tr><td>Stérile Pipettes pasteur à pointe fine</td><td>Deltalab</td><td>D210022</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes pasteur stériles</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Stérile à plaque 24 puits</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Compteur automatique de cellules - Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10227&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage cellulaire Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de cytométrie en flux</td><td>BD</td><td>343675</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux - FACS Canto-II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument de PCR en temps réel - Rotor Gene Q ou ABI 7900</td><td>Qiagen / Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Moléculaire Biologie Grade</td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Life Technologies</td><td>18068-015</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Grade DNAse-I Buffer 10X</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Biologie moléculaire Grade</td></tr><tr><td>EDTA 25 mM</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Eau ultra-pure</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td>Biologie moléculaire Grade</td></tr><tr><td>RNAse Out</td><td>Technologies de la vie</td><td>100000840</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Grade Amorces hexamères aléatoires</td> Technologies <td>de la vie</td><td>N8080127</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Tampon M-MLV-RT Life</td><td>Technologies</td><td>18057-018</td><td>Biologie moléculaire Grade</td></tr><tr><td>M-MLV-RT Enzime</td><td>Life Technologies</td><td>28025-021</td><td>Biologie moléculaire Grade</td></tr><tr><td>QuantiTect Syber Green Kit PCR</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Amorces spécifiques au grade&nbsp ;</td>Technologies <td></td><td>de la vie</td><td>Biologie moléculaire</td></tr></tbody></table>

l&#39;immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

La voie sublinguale a été largement utilisée pour délivrer de petites molécules dans la circulation sanguine et pour moduler la réponse immunitaire à différents endroits. Il a été démontré qu’il induit efficacement des réponses humorales et cellulaires aux sites systémiques et muqueux, à savoir les poumons et le tractus urogénital. La vaccination sublinguale peut favoriser la protection contre les infections des voies respiratoires inférieures et supérieures ; Il peut également favoriser la tolérance aux allergènes et améliorer les symptômes de l’asthme. La modulation de la réponse immunitaire pulmonaire par immunothérapie sublinguale (SLIT) est plus sûre que l’administration directe de formulations par voie intranasale, car elle ne nécessite pas l’administration de molécules potentiellement nocives directement dans les voies respiratoires. Contrairement à l’administration intranasale, les effets secondaires impliquant une toxicité cérébrale ou une paralysie faciale ne sont pas favorisés par l’ITSL. Les mécanismes immunitaires sous-jacents à l’ITSL restent insaisissables et son utilisation pour le traitement des infections pulmonaires aiguës n’a pas encore été explorée. Par conséquent, le développement de modèles animaux appropriés de SLIT est nécessaire pour explorer davantage ses avantages potentiels. 
Ce travail montre comment effectuer l’administration sublinguale d’agents thérapeutiques chez la souris pour évaluer leur capacité à protéger contre la pneumonie aiguë à pneumocoque. Les aspects techniques de la manipulation de la souris lors de l’inoculation sublinguale, de l’identification précise de la muqueuse sublinguale, du drainage des ganglions lymphatiques et de l’isolement des tissus, du lavage broncho-alvéolaire et des poumons sont illustrés. Les protocoles de préparation de la suspension de cellules uniques pour l’analyse FACS sont décrits en détail. D’autres applications en aval pour l’analyse de la réponse immunitaire sont discutées. Les aspects techniques de la préparation de l’inoculum de Streptococcus pneumoniae et de la provocation intranasale chez la souris sont également expliqués.
SLIT est une technique simple qui permet de cribler des molécules candidates pour moduler la réponse immunitaire des poumons. Les paramètres affectant le succès de l’ITLS sont liés à la taille moléculaire, à la sensibilité à la dégradation et à la stabilité des formulations hautement concentrées.

L'immunothérapie sublinguale peut être utilisé avec succès pour moduler la réponse immunitaire des poumons. Nous avons montré qu'une seule dose de la flagelline, l'agoniste et NLRC4 TLR5, peut induire une régulation à la hausse significative de l'ARNm codant pour la CXCL1 des chimiokines, CCL20 et la cytokine IL-6 par rapport à une solution saline traitée contrôles. Pliez induction de niveaux d'ARNm a culminé à 8 h après fente et revenir à des niveaux de base après 20 heures (Figure 1). Toutefois, lorsque SLIT a été effectuée 2 heures avant l'infection intranasale avec S. Pneumoniae, les niveaux de CXCL1 et IL6 ARNm demeurent significativement régulés à la hausse, même 24 heures après SLIT par rapport aux animaux non traités (figure 2). L'analyse des populations cellulaires dans le BAL et le tissu pulmonaire par FACS a montré que les animaux traités avec FliC par voie sublinguale ont augmenté le nombre de neutrophiles dans les voies respiratoires, mais pas dans les tissus des poumons (Figure 3). la figure 4, VSL avec flagelline promu protection et augmenté la survie contre la pneumonie à pneumocoques aigu. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6.7in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig1highresV2.jpg" width="680"> Figure 1: Cinétique de profil de transcription des poumons après l'immunothérapie sublinguale avec la flagelline. Des souris BALB / c âgées de huit à dix semaines (n = 4) ont été traités avec 10 pg de la flagelline ou une solution saline par voie sublinguale, sous anesthésie. Les poumons ont été prélevés à différents moments et on les place dans de conservation des acides nucléiques. Extraction de l'ARN total a été effectuée et l'ADNc a été synthétisé. les niveaux d'ARNm ont été évalués par PCR en temps réel utilisant des amorces spécifiques figurant dans Table 1. quantification relative a été réalisée selon la méthode ACt utilisant des niveaux d'ARNm ACTB pour la normalisation. Les résultats sont présentés comme multiplication par rapport à une solution saline groupe traité par la médiane ± SEM. Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (p &lt;0,05), calculée selon le test de Mann-Whitney. Les résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6.2in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig2highresV2.jpg" width="660"> Profil transcriptionnel de Figure 2 poumons pendant la pneumonie à pneumocoque après immunothérapie sublinguale avec la flagelline (n 7 n = 4 pour le groupe témoin et = pour le groupe traité). Huit à 10 semaines souris BALB / c ont été traités avec 10 mg de flagelline ou une solution saline par voie sublinguale, sous anesthésie. 2 heures plus tard souris ont été exposées par voie intranasale avec la dose létale minimale (DLM), provoquant 10Mortalité de 0% d'un isolat clinique de S. pneumoniae de sérotype 1 E1585, correspondant à 4x10 5 UFC / 50 pi. Les poumons ont été prélevés 24 heures après la provocation et stockés dans de préservation de l'acide nucléique jusqu'à ce que l'extraction d'ARN et synthèse d'ADNc ont été réalisées. PCR en temps réel a été effectuée (Voir la liste amorce dans le tableau 1) et la quantification relative a été réalisée selon la méthode ACt utilisant des niveaux d'ARNm ACTB pour la normalisation. Les résultats sont présentés comme multiplication par rapport à une solution saline groupe traité par la médiane ± SEM. Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (p &lt;0,05), calculée selon le test de Mann-Whitney. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig3highresV2.jpg" width="680"> Figure 3 Analyse des polynucléaires neutrophiles (PMN) le recrutement dans les tissus et les voies respiratoires des poumons après fente. Huit àDes souris BALB / c âgées de 10 semaines (n = 4) ont été traités avec 10 pg de la flagelline ou une solution saline par voie sublinguale, sous anesthésie. 2 heures plus tard souris ont été exposées par voie intranasale avec le MLD de S. pneumoniae de sérotype 1 E1585. 24 heures après la provocation, BAL a été effectuée et les poumons ont été traitées pour l'analyse FACS. PMN ont été identifiés comme CD11b cellules Ly6G haut / haut / CD11c négatifs et basé sur le profil FCS-SSC. Les résultats sont exprimés en tant que pourcentage de PMN à l'égard du nombre total de cellules dans le BAL et les poumons. Les barres représentent médiane ± SEM. Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (p &lt;0,05), calculée selon une voie test de Mann-Whitney. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5.3in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig4highresV2.jpg" width="530"> Figure 4 VSL avec flagelline protège les souris contre la pneumonie à pneumocoques aigu. S. pneumoniae de sérotype 1 E1585. La survie a été évaluée sur une base quotidienne. Les courbes de Kaplan-Meier ont été comparés selon log-rank (Mantel-Cox) test. Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (p &lt;0,05) .Résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes. <table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td> Nom </td><td> Séquence 5'-3 ' </td><td> PCR longueur du produit (pb) </td></tr><tr><td> mB-actin_F </td><td> GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT </td><td rowspan="2"> 68 </td></tr><tr><td> mB-actin_R </td><td> CGTCATCCATGGCGAACTG </td></tr><tr><td>mCCL20_F </td><td> TTTTGGGATGGAATTGGACAC </td><td rowspan="2"> 69 </td></tr><tr><td> mCCL20_R </td><td> TGCAGGTGAAGCCTTCAACC </td></tr><tr><td> mCXCL1_F </td><td> CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA </td><td rowspan="2"> 84 </td></tr><tr><td> mCXCL1_R </td><td> ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT </td></tr><tr><td> mIL-6_F </td><td> GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA </td><td rowspan="2"> 78 </td></tr><tr><td> mIL-6_R </td><td> AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA </td></tr><tr><td> mTNFalpha_F </td><td> CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA </td><td rowspan="2"> 63 </td></tr><tr><td> mTNFalpha_R </td><td> CCTCCACTTGGTGGTTTGCT </td></tr><tr><td> mCxcl2_F </td><td> CCCTCAACGGAAGAACCAAA </td><td rowspan="2"> 72 </td></tr><tr><td> mCxcl2_R </td><td> CACATCAGGTACGATCCAGGC </td></tr></tbody></table> Le tableau 1 liste d'amorces utilisés pour l'analyse par PCR en temps réel. Des séquences d'amorces spécifiques utilisées pour l'analyse qPCR. Amorces sens et antisens pour ACTB de la souris, Cccl20, CXCL1, IL6, TNFa et CXCL1 sont présentés comme des séquences 5'-3 'et la longueur de produit attendu est indiqué en paires de bases (pb).

Le présent travail illustre la commodité de l’utilisation de l’immunothérapie sublinguale pour stimuler la réponse immunitaire innée dans les poumons et conférer une protection contre la pneumonie pneumococcique aiguë chez la souris.

L&#39;immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser l’immunothérapie sublinguale pour stimuler la réponse immunitaire innée dans les poumons et la protection contre la pneumonie pneumococcique mortelle. Chez la souris, la première étape consiste à administrer une solution avec le drapeau de l’agent immunostimulant dans la muqueuse sublinguale de la souris anesthésiée. Ensuite, une suspension contenant une dose létale d’une souche génique de pneumonie à streptocoques est instillée par racine intranasale à des souris anesthésiées préalablement traitées avec une ligne plate ou une solution saline comme témoin.Le lage broncho-bilaire est effectué pour analyser la sous-population infiltrant les voies respiratoires et le tissu pulmonaire est traité pour obtenir une suspension unicellulaire pour la caractérisation phénotypique de la population cellulaire. La cytométrie en flux multiparamétrique mandibulaire, les ganglions lymphatiques mandibulaires accessoires ainsi que le tissu sublingual peuvent également être traités pour effectuer une cytométrie en flux ou d’autres analyses en aval. Populations cellulaires infiltrant les voies respiratoires.Les poumons ou la muqueuse sublinguale peuvent être identifiés par phénotypage immunitaire et cytométrie en flux multiparamétrique L’activation immunitaire dans différents tissus après une immunothérapie sublinguale peut également être analysée en étudiant le profil de transcription par PCR en temps réel. Bienvenue au Laboratoire de recherche sur les vaccins du Département de biotechnologie, nous allouons l’école de médecine, Université de U.L’un des principaux intérêts de notre laboratoire est de générer de nouvelles stratégies d’intervention immunitaire contre les infections respiratoires. La voie internasale a été utilisée avec succès pour l’administration d’agents immunostimulants pour traiter ou prévenir l’infection pulmonaire ou une autre théologie.Nous avons montré que l’administration intranasale, le composant du gel bactérien, peut être utilisée efficacement pour briser l’infection pulmonaire en cours causée par les souris STO. Bien que la racine intranasale nécessite normalement une faible dose de l’agent thérapeutique et induise une forte réponse dans les voies respiratoires, elle présente certains inconvénients tels que la possibilité d’une toxicité du système nerveux central et d’une paralysie faciale associée à l’absorption de composés immunostimulants à travers les nerfs oratoires. Par conséquent, nous avons mis en place un modèle d’immunothérapie UAL comme alternative pour induire une immunité protectrice contre la pneumonie à pneumocoque.L’immunothérapie sublinguale offre une alternative plus sûre par rapport à l’installation intranasale. Il est non invasif, indolore et simple. Bien qu’il puisse nécessiter des doses plus élevées d’un agent thérapeutique, il peut être utilisé pour administrer des produits NA ou pharmaceutiques afin de moduler la réponse immunitaire dans la durée.Nous allons maintenant vous montrer comment effectuer une administration sublinguale chez la souris en utilisant le flatteur comme agent thérapeutique. L’immunothérapie subine avec flatteur peut éventuellement protéger les souris contre une provocation intranasale mortelle avec une pneumonie à streptocoque en déclenchant une réponse immunitaire innée dans les poumons. Nous aborderons également la caractérisation de la longueur, de la réponse innée pendant l’infection et après l’immunothérapie sublinguale à l’aide de la géométrie fluide et de la PCR en temps réel.Enfin, nous vous montrerons comment prélever des ganglions lymphatiques locaux et des tissus sublinguaux pour une analyse plus approfondie. Après avoir préparé la solution de l’agent stimulant à tester, anesthésier les animaux en administrant 200 microlitres de la solution de kétamine OSI par injection interpéritonéale à Pet, la solution contenant l’immunostimulant dans un volume maximal de 10 microlitres. Prenez ensuite la souris avec votre main gauche et tenez-la à l’aide de votre pouce et de votre index avec votre main libre.Placez délicatement la pince fermée sous la langue et maintenez-la en place. À l’aide de votre majeur et de votre annulaire, prenez la pipette et administrez la solution sur le plancher de la bouche et la face dorsale de la langue. Retirez la pince et laissez la bouche reposer pendant trois à cinq minutes avant de la remettre dans la cage.Les principales caractéristiques de cette technique sont le volume total utilisé pour traiter les animaux et l’anesthésie. La petite taille de la cavité buccale chez les souris limite le volume maximum pouvant être appliqué au rapport sublingual à 10 microlitres. Une fois la dose décidée, vous devez ajuster la concentration de l’échantillon à ce volume maximum.Des volumes plus importants pourraient entraîner une ingestion ou une aspiration indésirable de la solution. L’anesthésie est cruciale pour éviter l’ingestion et permettre la pénétration des substances à travers l’épithélium. Nous vous conseillons de ne pas utiliser l’inhalation sous anesthésie car les souris se réveilleront trop tôt.Notez que certains anesthésiques injectables peuvent induire la salivation chez la souris. Si cela se produit, utilisez un petit morceau d’ajustement ou de papier pour éliminer la salivation excessive avant d’appliquer la solution avec l’agent thérapeutique, la dose de l’agent thérapeutique doit être ajustée pour maximiser son effet et il est fortement recommandé de tester plusieurs doses. Si vous avez déjà utilisé votre composé par racine intranasale, une dose cinq à 10 fois plus élevée serait un bon point de départ pour tester.Testez votre agent thérapeutique par la racine sublinguale. Notez que l’absorption par l’épithélium sera limitée par la taille de la molécule décongélation Une aliquote du stock de travail préalablement préparé de la pneumonie à streptocoque de l’indice CFU bactérien connu centrifuge pendant cinq minutes à 2 500 G et jeter le supernat Suspendre dans un millilitre de sérum physiologique et centrifuger. Encore une fois, jetez le surnageant, puis mettez-vous au repos.Suspendre la pastille dans le volume approprié de solution saline stérile pour obtenir une suspension de quatre fois 10 à cinq UFC dans 50 microlitres, ce qui correspond à la dose bactérienne minimale du sérotype particulaire utilisé qui provoque une mortalité de 100 % dans le bulbe C.Les souris prennent 50 microlitres de la suspension bactérienne et instillent soigneusement le volume total dans les narines d’une souris préalablement anesthésiée. Tenez la souris à la verticale pendant deux minutes et laissez-la reposer en position dorsale pendant deux minutes supplémentaires. Après le défi, confirmation des numéros d’UFC dans la suspension bactérienne en effectuant une dilution en série de la suspension par dix et en les plaquant sur du sang.Plaque de gélose Incuber toute la nuit à 37 degrés avec 5 % de muco CO2. Les colonies d’ethno se distinguent par le vert alo caractéristique des bactéries alpha-hémolytiques. Compter les unités formant colonies et consigner l’utilisation de la dose de provocation.Après avoir euthanasié l’animal, ouvrez la cavité thoracique jusqu’au cou. Faites une incision le long des pattes avant pour exposer la trachée et la zone sublinguale. Identifiez les ganglions lymphatiques mandibulaires.Ceux-ci apparaissent généralement sous la forme de structures de forme ovale blanchâtre reposant sur les glandes salivaires. À l’aide de la pince à pointe fine, tirez doucement le tissu sublingual vers le haut et exposez la face dorsale du plancher de la bouche. Prélevez les ganglions lymphatiques mandibulaires en tirant doucement vers le haut avec la pince à pointe mince pour les libérer du tissu.Placez-les dans un tube contenant C-R-P-M-I ou une solution de conservation d’acide nucléique selon la procédure en aval. Cela serait fait plus tard. Identifiez maintenant les petits ganglions lymphatiques situés plus profondément des deux côtés de la gorge et retirez-les.Ce sont les ganglions lymphatiques mandibulaires accessoires. Ouvrez la cavité thoracique pour exposer le poumon et retirez le thymus. Coupez le binna CVA inférieur et retirez l’excès de sang avec un tissu absorbant pour effectuer le lavage broncho.Tout d’abord, exposez la trachée. Faites ensuite une petite incision avec un scalpel et introduisez une pointe fine. Transférez le peppe préalablement rempli d’un millilitre de PBS sans calcium et de magnésium plus un millimolaire d’EDA Instillez et aspirez soigneusement le volume total au moins trois fois.Ensuite, aspirez et transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Perfuser les poumons en injectant cinq millilitres de PBS sans calcium et magnésium plus un millimolaire d’EDTA dans le ventricule droit du cœur pour éliminer tous les globules rouges et les cellules immunitaires présents dans les vaisseaux sanguins des poumons. Si la perfusion a été effectuée correctement, la couleur des poumons passera du rose au blanc.Retirez le cœur, prenez les poumons perfusés et placez-les dans un milieu complet ou une solution de conservation d’acide nucléique en fonction de l’analyse en aval à effectuer. Si vous souhaitez analyser la population cellulaire de la muqueuse sublinguale, isolez la tête de l’animal et retirez les glandes salivaires et fixez les tissus mous. Faites une incision de chaque côté de la bouche jusqu’à ce qu’elle atteigne l’articulation de la mandibule et séparez la mâchoire inférieure de la langue et le plancher de la bouche.À l’aide d’une paire de pinces à dents de rat émoussées, tirez la langue vers le haut et faites une incision à l’endroit où la base de la langue rencontre le plancher de la bouche. Cette zone constitue la muqueuse sublinguale. Coupez et retirez la langue à l’aide d’un poinçon de biopsie, d’une pince et de ciseaux.Découpez le tissu muqueux sublingual et placez-le dans un tube propre. Transférez les poumons dans une plaque de 24 puits et signifiez-les avec une paire de ciseaux propres. Ajouter un millilitre de milieu de digestion en pipetant plusieurs fois de haut en bas et incuber à 37 degrés et 5 % de CO2 pendant 40 minutes après l’incubation.Tournez à nouveau la pipette de haut en bas pour vous assurer que la plupart des cellules ont été libérées du tissu. Transférez la suspension cellulaire sur une crépine de 40 micro-mailles et lavée avec cinq millilitres de PBA. Centrifugeuse EDTA de cinq millimolaires à 2 500 GS cinq minutes.Reus suspendent les cellules dans un millilitre de fax EDTA composé de PBS sans calcium et de magnésium, un millimolaire d’EDTA et 1 % de sérum de boing fœtal. Prenez un QU et faites une double dilution des cellules avec trip et bleu et comptez Reus en suspension des cellules à une concentration de deux fois 10 à sept cellules par millilitre et ajoutez 50 microlitres par tube. Ajoutez 50 microlitres d’un mélange d’anticorps deux fois dans chaque tube pour une analyse immunophénotypique.Incuber pendant 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité après s’être lavé trois fois avec des faits. EDTA remettre en suspension les cellules dans 200 microlitres de faits EDTA et analyser dans un cytomètre la même procédure peut être utilisée pour analyser la population cellulaire dans le tissu sublingual en utilisant des milieux de digestion contenant cet espace. L’immunothérapie sublinguale par la collagénase et la DS one à l’aide d’une flatline purifiée, un agoniste de TLR cinq et LC quatre, a induit une régulation positive significative des niveaux d’ARNm des chimiokines et des cytokines impliquées dans le recrutement des neutrophiles dans les poumons.Cela a également été observé pendant l’infection. Le recrutement de PMN dans les poumons a été confirmé par cytométrie en flux. Le traitement sublingual par cinq agonistes du TLR était corrélé à une survie accrue des animaux et à une protection contre la pneumonie à pneumocoque.Nous avons montré que l’immunothérapie sublinguale est un moyen efficace d’induire une protection dans les lignes contre la pneumonie pneumococcique invasive PNE. Cela a été réalisé par l’installation sublinguale de lain, un tailleur à cinq agonistes qui n’est pas produit par une pneumonie histologique. L’installation sublinguale de lain a induit une régulation positive de la chimiokine C Xcl L one dans les lignes, ainsi que l’infiltration de neutrophiles.Un type de cellules cruciales pour l’élimination du pneumocoque, l’immunothérapie sublinguale avec des agonistes du TLR pourrait être utilisé pour traiter les infections seules ou en combinaison avec les thérapies actuelles comme l’antibiothérapie afin de prévenir la dissémination bactérienne et le développement de formes graves d’infection. La racine sublinguale peut également être utilisée pour administrer le vaccin et elle s’est avérée efficace pour induire une immunité protectrice muqueuse et systémique. Cette stratégie est particulièrement intéressante dans le cas des infections respiratoires et en particulier pour les pneumonies de bro car elle pourrait non seulement prévenir la maladie de base, mais aussi la colonisation assale bloquant la bactérie au niveau du sport d’entrée.Dans l’ensemble, nous pensons que la voie sublinguale est une alternative intéressante pour développer de nouvelles stratégies de traitement ou de prévention des infections respiratoires. Nous vous encourageons à essayer cette technique.

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L'intubation trachéale à médiation (IMIT) instillation de réactifs est une excellente méthode non invasive pour l'étude de la maladie respiratoire, ainsi qu'un procédé pour inculquer réactifs thérapeutiques directement dans le poumon. Il est une méthode rapide et hautement reproductible qui est approprié pour des essais précliniques.

Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique

Il y a un manque général de connaissances sur le fonctionnement des vaccins. Ici, nous proposons l’utilisation combinée de la génétique inverse et de souris chimériques de la moelle osseuse pour mieux comprendre les réponses immunitaires précoces de l’hôte aux vaccins, en mettant l’accent sur les cellules dendritiques et l’immunité des lymphocytes T.

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Nous démontrons la procédure d’inoculation intra-trachéale d’Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures de souris. Il s’agit d’un outil très utile pour étudier les voies de signalisation qui régulent l’inflammation des voies respiratoires dans des modèles murins.

Administration intra-trachéale de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation

Nous détaillons ici la méthodologie suivie pour comparer l’efficacité protectrice et la réponse immunitaire pulmonaire induites par l’immunisation intranasale et sous-cutanée avec le BCG dans un modèle murin. Nos résultats montrent les avantages de la vaccination pulmonaire et suggèrent un rôle de la réponse médiée par l’IL17 dans la protection induite par le vaccin.

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l&#39;administration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris

Les procédures expérimentales pour l’extraction ultérieure des tissus lymphatiques pour tester l’activation des cellules dendritiques lymphoïdes sont décrites après traitement d’un nanomatériau immunostimulante.

Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation

Décrit est la préparation de nanoparticules LIPOSOMALES antigéniques et leur utilisation en stimulant cellules B activation in vitro et in vivo. Uniforme et robuste d’anticorps conduit à l’élaboration d’un nouveau modèle d’allergie à l’arachide. Le protocole pour générer des liposomes antigéniques peut être étendu à des antigènes différents et des modèles de vaccination.

Liposomes antigéniques pour la production d’anticorps spécifiques à certaines maladies

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Présenté ici est une procédure étape par étape pour induire des dommages aigus de poumon chez les souris par l'instillation intratracheal directe de lipopolysaccharide et pour effectuer l'analyse FACS des échantillons de sang, du fluide de lavage bronchoalveolar, et du tissu de poumon. L'invasivité minimale, la manipulation simple, la bonne reproductibilité, et la titration de la sévérité de la maladie sont des avantages de cette approche.

Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal

Cet article décrit et démontre l’administration de vaccins intranasaux et la collecte de lait de lapins en conctation (Oryctolagus cuniculus) comme moyen d’évaluer l’immunité muqueuse dans un modèle translationnelle approprié de vaccination maternelle.

Vaccination intranasale et collecte de lait dans les études sur l’immunisation maternelle chez le lapin blanc de Nouvelle-Zélande (Oryctolagus cuniculus)

Dans cette étude, une technique d’instillation endotrachéale non invasive a démontré le développement d’AL chez les rats à l’aide d’un laryngoscope basique pour garantir une livraison précise de LPS aux poumons. Le LPS est injecté via un tube endotrachéal à l’aide d’un laryngoscope. L’ampleur de la lésion pulmonaire est évaluée à plusieurs moments.

Administration endotrachéale non invasive de lipopolysaccharide pour induire une lésion pulmonaire aiguë chez les rongeurs

Découvrez l'immunothérapie sublinguale pour renforcer l'immunité innée pulmonaire chez la souris. Cette méthode protège contre la pneumonie pneumococcique létale et offre une alternative sûre à l'administration intranasale.

L'immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

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