Name: Multi-photon intracellulaire Imaging sodium Combiné avec uncaging focale médiation-UV de glutamate dans CA1 pyramidale neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Découvrez l'analyse des dynamiques sodiques dans les dendrites et épines des neurones hippocampiques CA1 par imagerie multi-photon combinée au déverrouillage UV focalisé de glutamate ciblé.

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Cette étude a été financée par une subvention de la Fondation allemande pour la science (DFG, Ro2327 / 6-1) à CRR Les auteurs tiennent à remercier S. Durry et C. Rodrigue pour l&#39;assistance technique d&#39;experts, et M. Dubbert (Laboratoire d&#39;Electronique, Institut de zoologie , Université de Cologne, Allemagne) pour l&#39;aider à mettre en œuvre le contrôleur de cellule de Pockels et le commutateur HF.

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêts. Les auteurs ont reçu un soutien financier permettant de publication ouverte d&#39;accès par Rapp optoélectronique (Wedel, Allemagne), qui produit un instrument utilisé dans l&#39;article de la vidéo. La société a été impliqué ni dans les expériences ni dans le traitement des données, ni dans l&#39;écriture de manuscrit.

La présente étude montre que SBFI est bien adapté pour l&#39;imagerie à deux photons des transitoires de sodium intracellulaire dans de petits compartiments cellulaires. Il doit être gardé à l&#39;esprit, cependant, que le rendement quantique de SBFI est plutôt faible et 15 par rapport l&#39;évolution de la concentration de sodium sont assez petites avec une activité physiologique. Ainsi, la mesure haute résolution des transitoires Na + dans les processus de qualité est une tâche relativement fastidieuse, et binning ou moyenne de plusieurs essais peuvent être nécessaires pour obtenir des signaux satisfaisants. En outre, la cinétique des phénomènes transitoires de sodium sont étonnamment faible, ce qui rend obligatoire à enregistrer pendant des périodes de temps prolongées. Cette observation correspond à ceux d&#39;études antérieures, où la pourriture monoexponentielle des transitoires de sodium dans les dendrites neuronales et dans les astrocytes a été caractérisée par de grandes constantes de temps de décroissance de l&#39;ordre de 10 secondes à la température ambiante 1,2,6. transitoires de sodium semblent donc exercer une coopérative de temps beaucoup plus lenturse et beaucoup plus grandes constantes de temps de décroissance par rapport à des transitoires de calcium 16. Mettez de côté ces inconvénients, l&#39;imagerie de sodium se révèle être un outil précieux pour l&#39;étude des propriétés physiologiques des sous-domaines neuronales. Par exemple, l&#39;imagerie de sodium peut servir à surveiller l&#39;activité synaptique excitatrice au niveau ou à proximité de synapses actives. Parce que le sodium est essentiellement non tamponnée 8,17, transitoires de sodium induite par l&#39;activité-sont liés de façon linéaire à un large éventail de la libération de glutamate synaptique ou exogène glutamate appliquées. Ils représentent donc des indicateurs directs et impartiaux sur l&#39;activité glutamatergique des neurones. En outre, l&#39;indicateur de sodium colorants présentent de haute K d (K le d de SBFI est de l&#39;ordre de 25 mM 1). Même à des concentrations de colorant intracellulaires relativement élevées utilisées pour obtenir suffisamment de luminosité (en général 0,5 à 1 mM), la K élevé d &#39;s impliquent que les colorants eux-mêmes n&#39;agissent pas comme des tampons pour sodieux. Par conséquent, ils ne faussent pas le cours de l&#39;amplitude, ni le temps de transitoires de sodium, qui est toujours un sujet de préoccupation quand colorants sensibles au calcium sont introduits dans les cellules 18. On peut donc supposer que les signaux détectés représentent un bon indicateur des changements «réels» en sodium intracellulaire. Leur évolution temporelle lente implique alors que la vitesse de diffusion de sodium intracellulaire dans les neurones est beaucoup plus faible que précédemment supposé 19. Une exigence essentielle pour la bonne exécution des expériences portant sur les propriétés de transmission et afflux de sodium voies synaptiques excitateurs dans les épines et les dendrites est l&#39;induction d&#39;une activation rapide et très localisée des structures post-synaptiques. Ceci peut être obtenu par l&#39;application rapide et locale de glutamate ou agonistes à proximité immédiate d&#39;une colonne vertébrale ou une dendrite par la photolyse flash de composés en cage. Photolyse éclair ne dama pas mécaniquementge le tissu, est libre d&#39;artefacts de mouvement et est bien établie pour l&#39;enquête de questions connexes (par exemple la signalisation calcique locale). Le diamètre de la tache uncaging était de 1,5 um dans le plan xy. Uncaging près d&#39;un des signaux de sodium épineux dendrites induites dans les deux épines et la dendrite mère. Alors que les signaux ont tendance à être plus grand dans les épines les plus proches de l&#39;endroit uncaging, les amplitudes dans la dendrite mère et les épines les plus éloignées étaient encore assez semblables à ceux à proximité directe de la place uncaging. Uncaging a été effectuée pour 300 ms au cours de laquelle courants entrants ont augmenté en amplitude. Glutamate Uncaged aurait diffusé dans le tissu au cours de la même période, l&#39;activation de récepteurs ionotropiques du glutamate et afflux de sodium sur les régions et les épines dendritiques plus loin de la place uncaging. Un problème intrinsèque qui se produit lors de l&#39;utilisation d&#39;un laser UV pour la photolyse de composés en cage administrés à travers la solution de bain de celluleest «filtrage interne. En raison de la vitesse de la cage d&#39;absorption élevée, une lumière UV est atténué fortement le long de la voie à partir de l&#39;objectif vers le site de stimulation 20,21. Une façon possible d&#39;éviter cela est perfusion locale de la cage qui est limité seulement au site de stimulation, ce qui réduit en outre la quantité de composé nécessaire pour une cage minimum. Par rapport à uncaging UV à balayage laser à médiation, proche infra-rouge à deux photons uncaging 22 est spatialement plus précise, principalement parce que la précision de la stimulation est augmentée dans l&#39;axe z. D&#39;autre part, en raison de la faible section des cages couramment utilisés pour des longueurs d&#39;onde utilisées comme avec excitation à deux photons, soit une forte concentration du composé en cage ou très élevée, des intensités de lumière potentiellement phototoxiques sont nécessaires. En outre, deux photons uncaging nécessite un investissement beaucoup plus élevé dans l&#39;équipement; entre autres, un laser IR supplémentaire en plus des composants optiques nécessaires, il faut. Les deux SBFI et MNI-glutamate sont excitables dans la gamme de longueur d&#39;onde identique. Cela peut conduire à une interdépendance involontaire du laser UV et uncaging SBFI laser ou d&#39;imagerie infrarouge et MNI-glutamate, ce qui entraîne le blanchiment de SBFI uncaging par le flash et / ou un uncaging continu de glutamate par les rayons infrarouges. Cependant, comme le montre la figure 6C, ni un flash UV par lui-même, ni d&#39;imagerie photonique plusieurs causé ces effets réciproques dans nos conditions expérimentales. Systèmes UV-flash similaires à celle décrite ici sont utilisées en routine dans de nombreux autres laboratoires et peuvent assez facilement être incorporés dans n&#39;importe quel multi-photons imagerie microscope existant. Il offre l&#39;avantage que le faisceau laser pour la photolyse peut être positionné librement dans le champ de vision. En outre, le système permet un repositionnement rapide et automatique du faisceau laser et le volume de sortie, respectivement, dans le champ de vision au cours de l&#39;expérience. Oumodification de r simplifie et améliore le positionnement précis de l&#39;endroit uncaging, de sorte que les images du logiciel d&#39;imagerie peuvent servir à ajuster imagerie et uncaging cadres congruente. L&#39;ensemble de cellule entière de patch-clamp et d&#39;imagerie de sodium à plusieurs photons dans les dendrites et les épines de neurones centraux, combiné avec un mode opératoire modifié pour uncaging induite par la lumière UV de glutamate, permet une activation fiable et focale des récepteurs du glutamate dans le tissu. Il peut donc servir à analyser les propriétés de la transmission synaptique excitatrice et de signaux de sodium dans les neurones post-synaptiques dans le tissu intact.

Les améliorations récentes des techniques de microscopie optique telles que la microscopie multi-photons ont permis l&#39;étude des paramètres morphologiques et physiologiques de cellules du cerveau dans le tissu intact avec une résolution spatiale et temporelle. Combiné avec l&#39;électrophysiologie, ces techniques sont aujourd&#39;hui largement utilisés pour analyser les signaux électriques liés à l&#39;activité de neurones ainsi que des signaux de calcium concomitants dans de petits compartiments sous-cellulaires, à savoir dans les dendrites fines et épines dendritiques. En plus de transitoires de calcium, l&#39;activité synaptique induit également des signaux de sodium dans les dendrites et des épines, dont les propriétés sont en grande partie inexploré. De tels signaux peuvent être analysés par imagerie à deux photons de sodium intracellulaire ([Na +] i) qui permet la mesure en ligne de la [Na +] i transitoires pendant des périodes prolongées sans décoloration significative de colorant ou photo-endommagement 1,2. Pour l&#39;imagerie de i [Na +] </sub&gt;, à seulement quelques colorants indicateurs chimiques sont disponibles, par exemple Corona vert ou Asante Natrium vert 3,4. La sonde fluorescente le plus couramment utilisé pour Na + est de l&#39;isophtalate de benzofurane imagerie (SBFI) de liaison du sodium. C&#39;est un quotientométrique, excité-UV colorant similaire à la célèbre colorant sensible au calcium fura-2 et a été utilisé pour l&#39;imagerie conventionnelle Na + dans de nombreux types de cellules (par exemple 5,6). Il existe différentes possibilités d&#39;exciter le colorant et la perception de sa fluorescence. Si une haute résolution temporelle (ie un taux de rafraîchissement élevé d&#39;imagerie) est nécessaire en combinaison avec l&#39;information spatiale, SBFI peut être excité par une lampe à arc au xénon ou une diode (LED) dispositif émettant de la lumière de forte puissance et son émission détectée avec une charge à haute vitesse dispositif -coupled (CCD) de 7,8. Pour une résolution spatiale maximale en profondeur dans le tissu, la microscopie à balayage laser multi-photonique est la méthode de choix 9. La relativement faible véhicu quantiquence de SBFI nécessite des concentrations relativement élevées de colorant (0,5 à 2 mm), et un chargement direct de la forme de SBFI membrane imperméable par une forte microélectrodes 10 ou la pipette en patch 1. Utilisation SBFI, des travaux antérieurs effectués dans des tranches de tissu aigus de l&#39;hippocampe de rongeurs démontré transitoires de sodium liées à l&#39;activité dans les dendrites et les épines des neurones pyramidaux CA1 qui sont principalement causées par des afflux de sodium par ionotropique récepteurs NMDA 1,2. Pour l&#39;étude des propriétés de ces signaux locaux de sodium de façon plus détaillée, l&#39;activation spécifique des récepteurs post-synaptiques par application d&#39;agonistes du récepteur est un procédé bien adapté de choix. Pour imiter l&#39;activité présynaptique et la libération du transmetteur, l&#39;application devrait être relativement brève et ciblée pour permettre la stimulation locale. Ceci, toutefois, se révèle être très difficile dans le tissu intact. Application d&#39;une pression locale d&#39;agonistes des récepteurs à l&#39;aide d&#39;une pipette à pointe fine permet ap très focalplication, mais accueille le risque potentiel pour produire le mouvement de la structure d&#39;intérêt (par exemple, comme une dendrite ou épines dendritiques), et donc empêche l&#39;imagerie haute résolution. La pertinence de l&#39;ionophorèse de substances neuro-actif dépend de leurs propriétés électriques et amplitudes de courant élevées peut produire des artefacts cellulaires ainsi. Une façon de contourner ces obstacles est l&#39;emploi des composés photo-actif et leur photolyse flash. Fondamentalement, deux principes différents sont utilisés pour la photo-activation des substances en cage: I) grand champ photolyse éclair 11 et II) uncaging focale utilisant des modules de balayage en combinaison avec des lasers 12. Bien que grand champ photolyse éclair est utilisé pour activer les grandes régions d&#39;intérêt, par exemple une cellule entière, uncaging focal est utilisé pour stimuler spécifiquement les petits compartiments cellulaires. Dans la présente étude, nous démontrons une procédure de cellules entières de patch-clamp et multi-pimagerie de sodium dans Hoton dendrites et des épines de neurones centraux, combinée à une procédure modifiée pour uncaging induite à la lumière UV-de glutamate, ce qui permet l&#39;activation et fiable focal des récepteurs du glutamate dans le tissu.

<table><tbody><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, épaisseur de paroi 0,3 mm</td></tr><tr><td>Caméra</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC Caméra compatible</td></tr><tr><td></td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre à fibre optique</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Spectromètre à fibre optique miniature</td></tr><tr><td>Tubes filtrants</td>Filtre central <td>VWR</td><td></td><td>, 0,2 & micro ; m</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, contrôleur</td> de puissance de faisceau IR Tiempo <td></td></tr><tr><td></td><td>Contrôle de</td><td>l’intensité du faisceau laser sur mesure + passage rapide à zéro en cas de retour via laser IR à cellule de pockels</td>SpectraPhysics Mai-Tai fs-pulsed Ti :Sa laser accordable (710 - 990 nm) ;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ATTENTION</td></tr><tr><td>Moniteur de puissance IR</td><td>Micromanipulateur sur</td><td></td><td></td>mesure</tr><tr><td></td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Système de microscope/imagerie</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Le microscope et les systèmes d’imagerie ont été fortement modifiés</td></tr><tr><td>Roue à filtres ND</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>Silice fondue UV, densité optique 0,05 - 2,0</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplificateur</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipettes</td><td>Narishige</td><td>Modèle PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Système pneumatique d’éjection de médicament</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Cellule Pockels</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, utilisé comme interrupteur rapide et pour le réglage de la puissance</td></tr><tr><td>Cellule Pockels pilote</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>Amplificateur différentiel haute tension</td></tr><tr><td>Obturateur</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF2 lames BeCu revêtues Contrôleur d’obturateur</td></tr><tr><td>Pilote d’obturateur</td><td></td> sur <td></td> mesure Vincent Associates Uniblitz VCM D1 <td></td></tr><tr><td></td><td></td> Trancheuse/Vibratome Thermo Scientific Microm HM 650 V <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de décageage</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + Laser UV NetCam</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm ; 10 mW ; ATTENTION</td></tr><tr><td>Système de balayage laser UV</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Système de balayage galvanométrique</td></tr><tr><td>Nom du composé</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments/ Description</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA receptor antagonist ; ATTENTION</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>antagoniste des récepteurs NMDA ; ATTENTION</td></tr><tr><td>SBFI K+ sel</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibiteur des canaux Na+ voltage-dépendants ; ATTENTION</td></tr><tr><td>NMI-caged-L-Glutamate</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Glutamate en cage libéré lors de l’absorption par UV</td></tr></tbody></table>

multi-photon intracellulaire imaging sodium combiné avec uncaging focale médiation-uv de glutamate dans ca1 pyramidale neurones

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon microscopie à fluorescence a permis l&#39;analyse de paramètres morphologiques et physiologiques des cellules du cerveau dans du tissu intact avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Combiné avec l&#39;électrophysiologie, il est largement utilisé pour étudier signaux calciques liées à l&#39;activité dans de petits compartiments sous-cellulaires tels que des dendrites et des épines dendritiques. En plus des transitoires calciques, l&#39;activité synaptique induit également des signaux de sodium post-synaptiques, dont les propriétés ne sont que peu compris. Ici, nous décrivons un procédé de cellule entière de patch-clamp et de l&#39;image combinée sodium multi-photons dans les domaines de la micro-cellulaires des neurones centraux. En outre, on introduit une procédure modifiée de l&#39;ultra-violet (UV) uncaging -light induite par du glutamate, qui permet une activation fiable et focale des récepteurs du glutamate dans le tissu. A cet effet, des enregistrements de cellules entières ont été effectués sur une subdivision corne d&#39;Ammon (CA1) des neurones pyramidaux dans des coupes tissulaires aiguës de l&#39;hippocampe de souris. Les neurones ont été remplis avec le colorant fluorescent SBFI sensible du sodium à travers le patch-pipette, et multi-photon excitation de SBFI permis la visualisation des dendrites et des épines adjacentes. Pour établir uncaging focal induite par les UV, de plusieurs paramètres, y compris l&#39;intensité de la lumière, le volume affecté par le faisceau de uncaging UV, le positionnement de la poutre ainsi que la concentration du composé en cage ont été testés et optimisés. Nos résultats montrent que la perfusion locale avec le glutamate cage (INM-glutamate) et son résultat uncaging-UV focal courants entrants et les transitoires de sodium dans les dendrites et des épines. Evolution dans le temps et l&#39;amplitude des deux courants entrants et des signaux de sodium sont en corrélation avec la durée de l&#39;impulsion uncaging. De plus, nos résultats montrent que les signaux de sodium intracellulaires sont bloquées, en présence d&#39;inhibiteurs de récepteurs ionotropiques du glutamate, ce qui montre qu&#39;ils sont médiés par l&#39;influx de sodium bien que cette voie. En résumé, notre méthode fournit un outil fiable pour larecherche de signaux de sodium intracellulaires induits par l&#39;activation du récepteur correspondant dans le tissu cérébral intact.

Dans la présente étude, nous démontrons une procédure pour la microscopie multi-photons de la dynamique de sodium cellulaires avec le colorant fluorescent de SBFI dépendant du sodium dans les neurones pyramidaux CA1 de la souris aiguë des coupes de tissu hippocampique. En outre, nous montrons comment combiner cette technique d'imagerie avec uncaging basé à balayage laser de composés neuro-actif (par exemple le glutamate en cage) et son ciblage précis de micro-domaines cellulaires. Chargement en cours neurones avec SBFI par le patch-pipette permis la visualisation de l'ensemble de la cellule, y compris des dendrites et des épines fines adjacentes en employant multi-photon excitation (figure 6A, B, D et figure 7A). <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500"> Figure 6 signaux de sodium et les courants synaptiques induites par photolyse éclair de glutamate cage. (A) Maximde projection d'image d'un neurone al pyramidale CA1 chargé avec SBFI via la pipette de patch (PP). La boîte de montre, à un grossissement de la zone dans B. LP indique la position et l'orientation de la pipette de perfusion locale de glutamate cage (B). Haute puissance de projection maximale d'un empilement de coupes optiques d'une dendrite d'épines dendritiques adjacents. Les piles de sections optiques ont subi z-alignement et déconvolution. La croix rouge indique la région cible du faisceau uncaging. La ligne en pointillés d'orange délimite la région d'intérêt à partir de laquelle l'émission de fluorescence a été enregistré. La boîte indique la zone indiquée élargie dans D. (C) A gauche: signal de sodium (rangée du haut) et somatique courant entrant (rangée du bas) induite par photolyse éclair de glutamate cage (indiqué par le flash jaune). La ligne rouge représente un ajustement des données expérimentales. La zone grise représente la période pendant laquelle le flash uncaging (300msec) obstrué l'imagerie de SBFI fluorescence droite:. Sans pré-perfusion avec du glutamate en cage, même UV-flash ni évoqué un changement de SBFI émission, ni un courant vers l'intérieur (D) à gauche:. l'image de haute puissance de la dendrite et à proximité épines délimitées dans B. Parallèlement, la même image avec des valeurs de gris inversés. Les lignes pointillées indiquent les régions d'intérêt dans lequel l'émission de fluorescence a été enregistré. La croix rouge indique la localisation du faisceau uncaging droite:. Transitoires sodium induites par UV-flash photolyse de glutamate cage. Bleu trace: signaux sodium dans la dendrite; trace rouge: réponse moyenne de trois épines adjacentes à la place uncaging; trace verte: réponse moyenne de trois épines éloignés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour une version plus grande de cette figure.</a> Après perfusion locale avec en cageglutamate, l'application d'un rayonnement UV-flash à proximité d'une dendrite a entraîné une diminution transitoire dans l'émission de fluorescence de SBFI, ce qui reflète une augmentation de la concentration de sodium intracellulaire (Figure 6C, D et figure 7B). Dans le même temps, un courant vers l'intérieur a été observée à la soma (Figure 6C et la figure 7B). L'augmentation de la durée de l'éclair UV conduit à augmenter les amplitudes des deux courants vers l'intérieur du provoquée et les signaux de sodium (données non présentées), ce qui indique que le système est bien à l'intérieur de sa gamme dynamique et que les réponses cellulaires ni ni uncaging ont été saturés. L'application d'un rayonnement UV-éclair d'une durée identique ou plus pour des tranches qui n'ont pas été pré-perfusé avec du glutamate en cage, jamais provoqué des changements dans la fluorescence SBFI ni courants entrants, indiquant que ces signaux sont dus à la uncaging du glutamate (Figure 6C). De plus, ces résultats montrent qu'aucun des composants interdépendance Imaging- uncaging et on observe uelon nos conditions expérimentales. signaux de sodium peuvent également être détectés dans les épines dendritiques (figure 6D). Alors que nous n'avons pas cherché à obtenir une stimulation d'une seule colonne vertébrale qu'avec glutamate uncaging, les amplitudes maximales ont tendance à être légèrement plus élevé dans les épines à proximité de la place uncaging, tandis que les épines plus loin ont montré des changements de fluorescence pratiquement identiques à celles de la dendrite mère (Figure 6D). Enfin, nous avons étudié la voie pour l'entrée de sodium dans les dendrites et des épines en réponse à uncaging de glutamate. Pour ce faire, nous avons utilisé CNQX et APV, qui sont sélectifs pour les bloqueurs sodium-perméable, récepteurs ionotropiques du glutamate et de la AMPA- sous-type NMDA, respectivement. Nos résultats montrent que les signaux de sodium intracellulaire induites par le glutamate et les courants somatiques provoquées ont été omises dans la présence de ces bloqueurs (figure 7B). Lors de wash-out des bloqueurs, les signaux sont repris. Ceci démontre that uncaging de glutamate active récepteurs ionotropiques du glutamate sur les neurones pyramidaux CA1, qui interviennent dans l'afflux de sodium dans les dendrites et des épines, ce qui transitoires de sodium intracellulaire et courants entrants. <img alt="Figure 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600"> Figure 7 profil pharmacologique des signaux de sodium évoqués et courants entrants. (A) remplie SBFI neurone CA1 pyramidale avec la pipette en patch (PP) fixé à la soma (B) gauche:. Courant transitoire de sodium et somatique induite par photo-activation du glutamate dans une cage de dendrites et des épines attachés Center. Perfusion avec la les bloqueurs des récepteurs ionotropiques du glutamate et CNQX APV inhibe à la fois le signal de sodium et le courant entrant induit par uncaging Droit:. Après lavage par des bloqueurs, les signaux sont restitués. Les représen ligne rougect un ajustement des données expérimentales. La zone grise représente la période pendant laquelle le flash uncaging (300 ms) obstrué l'imagerie de fluorescence SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour une version plus grande de cette figure.</a>

Nous décrivons la combinaison de l&#39;effet des UV focal photo-activation de composés neuro-actif avec la cellule entière de patch-clamp et de l&#39;imagerie multi-photons de transitoires de sodium intracellulaire dans les dendrites et les épines de neurones de l&#39;hippocampe dans les tranches de tissu aiguë du cerveau de la souris.

Multi-photon intracellulaire Imaging sodium Combiné avec uncaging focale médiation-UV de glutamate dans CA1 pyramidale neurones

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

L’objectif global de cette procédure est d’évoquer et d’analyser la dynamique du sodium dans de petits compartiments cellulaires, tels que les épines et les dendrites des neurones centraux dans le tissu intact. Pour ce faire, il suffit d’abord de préparer une tranche aiguë d’hippocampe de souris, de charger un neurone pyramidal avec le colorant fluorescent sensible au sodium SBFI à l’aide d’une pipette patch et de visualiser la morphologie cellulaire à l’aide de l’excitation multiphotonique. Les prochaines étapes consistent à choisir une dendrite épineuse pour l’expérience et à injecter un composé photo-activé tel que le glutamate en cage à proximité de cette dendrite.Un flash UV est ensuite appliqué sur le glutamate non mis en cage de Foley à l’aide d’un laser UV qui a été positionné avec précision pour cibler un petit volume près de la dendrite choisie. La dernière étape consiste à surveiller les changements résultants de la fluorescence SBFI dans la dendrite et à surveiller les changements résultants du sodium dans les épines adjacentes. Les courants membranaires qui l’accompagnent sont également enregistrés.À terme, l’utilisation d’outils pharmacologiques appropriés, tels que les bloqueurs de récepteurs, permettra d’étudier les mécanismes générant les signaux sodiques intracellulaires évoqués. Cette méthode fournit un outil fiable pour l’étude des signaux sodiques intracellulaires dans les petits compartiments cellulaires et dans les tissus cérébraux intacts. Ici, nous combinons l’imagerie par patch clamp de cellule entière et l’imagerie au sodium multiphotonique avec une procédure modifiée pour le décageage induit par la lumière UV.Cela nous permet de surveiller les réponses cellulaires lors d’applications précises et focales de composés neuroactifs. La procédure sera démontrée par Karl KA et par Kaan Kleinhans, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer la dissection du tissu, placez immédiatement le cerveau dans une boîte de Pétri avec dissection glacée, du liquide céphalo-rachidien cérébral artificiel ou un LCR et disséquez un hémisphère en effectuant une coupe sagittale le long de la ligne médiane.Effectuez une deuxième coupe dans l’orientation souhaitée en tant que surface de blocage. Fixez-le ensuite à l’étape de coupe d’un vibram avec de la super colle. Après avoir sorti la chambre de coupe et l’élément de refroidissement du vibram du congélateur, placez l’étape de coupe avec la section du cerveau dans la chambre.Ensuite, placez l’élément de refroidissement dans la chambre et immergez le tissu dans la dissection glacée A LCR. Coupe suivante de 250 micromètres d’épaisseur. Tranches para sagittales de l’hippocampe avec un viome.Assurez-vous que les fluides d’un CS sont bullés à tout moment. Après le tranchage, gardez le tissu sur un filet dans un bécher avec un LCR A normal et incubez à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, conservez le tissu à température ambiante.Cette expérience devrait être menée dans un environnement sombre, mais elle est montrée ici dans des conditions de faible luminosité à des fins de tournage. Pour préparer le matériel, allumez d’abord les composants du système multiphotonique et ajustez l’alignement du faisceau laser infrarouge comme décrit dans le protocole de texte. Ajustez ensuite la longueur d’onde du laser multiphotonique et l’intensité du faisceau en modifiant les paramètres de la cellule pcal et des photomultiplicateurs.Ensuite, allumez et calibrez le système de désencage en plaçant une lame d’échantillon fluorescente sous la lentille de l’objectif. Démarrez la routine d’étalonnage du logiciel de contrôle de l’unité de décage. Réglez le laser UV sur plusieurs points dans sa plage de balayage pendant que la fluorescence est capturée avec une caméra CCD en cliquant sur le spot laser UV.À chaque point, ajustez le positionnement des miroirs à balayage galvanique pour qu’il corresponde à une certaine coordonnée dans le logiciel. Le positionnement précis du point de décantage est obtenu en important une image du système d’imagerie via une connexion réseau entre les ordinateurs de décageage et d’imagerie. À l’aide d’un logiciel de capture d’écran, lisez en permanence les images du logiciel d’imagerie et ajustez l’imagerie.Et une fois terminé, les images en cage exportent de manière congruente toutes les 10 images du logiciel d’imagerie en tant qu’image de référence dans le flash pour assurer un réglage correct pendant toute l’expérience. Ensuite, allumez les composants d’électrophysiologie des micromanipulateurs et le dispositif d’application de pression pour l’administration du composé en cage dans la région cible. Pipettes tirées pour une pince de patch de cellule entière et une profusion locale à l’aide de capillaires en verre boro silicate poli au feu.Placez ensuite la tranche dans le bain expérimental et pour la fixer avec une grille, placez le bain à la platine du microscope et perfuser durablement la tranche avec un LCR A. Commencez le clampage du patch sur cellules entières en chargeant la pipette patch avec une solution intracellulaire ou un ICS contenant du SBFI, puis chargez la pipette de perfusion locale avec un composé en cage. Fixez les pipettes aux micromanipulateurs correspondants et placez l’électrode de référence dans le bain.Choisissez une cellule pyramidale CA avec un soma situé de 30 à 70 micromètres sous la surface de la coupe pour assurer une morphologie cellulaire intacte ainsi qu’une faible diffusion et atténuation du faisceau de décage. Approchez-vous de cette cellule à l’aide d’une pipette patch utilisant la vidéomicroscopie IR DIC. Appliquez une aspiration douce jusqu’à l’obtention d’un giga étanchéité.Compense la capacité rapide. Ensuite, brisez la membrane et ouvrez la cellule pour obtenir une configuration cellulaire. Enfin, évaluez la viabilité des cellules en mode pince de courant.Injectez un courant dépolarisant et vérifiez l’activité de pointe résultante pour effectuer l’imagerie et la stimulation. Tout d’abord, ajoutez tetro DOIND à un LCR pour empêcher l’activation des canaux sodiques voltage-dépendants et la génération de potentiels d’action. Visualisez la morphologie cellulaire à l’aide de l’excitation multiphotonique et de la fluorescence SBFI résultante.Choisissez une dendrite épineuse pour l’expérience. Zoomez pour obtenir des images à une résolution plus élevée et placez une zone de délimitation autour de la dendrite. Placez ensuite la pipette avec le composé en cage près de la dendrite.Positionnez la pipette de manière à permettre une perfusion locale efficace de la dendrite de votre choix. Ajustez le laser de décageage pour positionner le point de décage, près de la structure d’intérêt. Ensuite, définissez les régions d’intérêt sur la dendrite choisie et les épines adjacentes à l’aide d’un logiciel d’imagerie.Approchez-vous de la zone d’intérêt et injectez le composé en cage pendant plusieurs secondes avec des enregistrements de patch de démarrage à basse pression, de pince et de fluorescence via le signal de déclenchement. Lors de la profusion locale du composé en cage, le faisceau d’excitation est complètement atténué pour éviter le blanchiment. Ensuite, arrêtez la profusion locale du composé en cage.Augmentez ensuite l’intensité du laser à deux photons pour permettre une excitation efficace du SBFI et appliquez un flash UV pour initialiser sur le moniteur de cage les changements de fluorescence SBFI ainsi que le courant somatique procéder à l’arrêt de l’enregistrement une fois que la fluorescence SBFI est revenue à la ligne de base. Pour obtenir la morphologie, enregistrez une pile XY, Z de la région de la boîte de clip définie pour les mesures effectuées. Assurez-vous que cette pile est suréchantillonnée spatialement pour permettre une déconvolution optimale de l’image et pour augmenter la qualité et la résolution de l’image.Le chargement des neurones avec SBFI à travers la pipette patch a permis de visualiser l’ensemble de la cellule, y compris les dendrites fines et les épines adjacentes en utilisant l’excitation multiphotonique après perfusion locale avec du glutamate en cage. L’application d’un flash UV à proximité d’une dendrite a entraîné une diminution transitoire de l’émission fluorescente de SBFI, reflétant une augmentation de la concentration intracellulaire de sodium. Dans le même temps, un courant entrant a été enregistré lors de l’application SOMA d’un flash UV sur des tranches, qui n’avaient pas été pré-imprégnées de glutamate en cage.N’a jamais provoqué de changements dans la fluorescence SBFI ni de courants entrants indiquant que ces signaux sont dus à la mise en cage du glutamate. Les amplitudes maximales étaient légèrement plus élevées dans les épines proches du point de décage, tandis que les motifs pour les autres épines ressemblaient à la dendrite parente. La voie d’influx de sodium dans les dendrites et les épines en réponse à la désencage du glutamate a été étudiée à l’aide d’inhibiteurs sélectifs pour les récepteurs ionotropiques du glutamate perméables au sodium, les signaux somatiques intracellulaires induits par le glutamate et les courants somatiques provoqués ont été omis en présence de ces bloqueurs.Lors du lavage des bloqueurs, les signaux sont récupérés, démontrant que la désactivation du glutamate active les récepteurs cytotropes du glutamate sur environ un neurone pyramidal, ce qui entraîne des courants sodiques intracellulaires transitoires et entrants. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de choisir l’intensité la plus faible possible pour le laser infrarouge afin de minimiser les dommages à la préparation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des étapes critiques de notre approche expérimentale pour étudier la signalisation du sodium dans les micro-restes cellulaires Une fois maîtrisée, cette technique permet une imagerie à haute résolution de l’activité évoquée des signaux ioniques intracellulaires dans le tissu intact, qui est exempt d’artefacts de mouvement comme introduit par d’autres techniques.

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