Multi-photon intracellulaire Imaging sodium Combiné avec uncaging focale médiation-UV de glutamate dans CA1 pyramidale neurones

L’objectif global de cette procédure est d’évoquer et d’analyser la dynamique du sodium dans de petits compartiments cellulaires, tels que les épines et les dendrites des neurones centraux dans le tissu intact. Pour ce faire, il suffit d’abord de préparer une tranche aiguë d’hippocampe de souris, de charger un neurone pyramidal avec le colorant fluorescent sensible au sodium SBFI à l’aide d’une pipette patch et de visualiser la morphologie cellulaire à l’aide de l’excitation multiphotonique. Les prochaines étapes consistent à choisir une dendrite épineuse pour l’expérience et à injecter un composé photo-activé tel que le glutamate en cage à proximité de cette dendrite.

Un flash UV est ensuite appliqué sur le glutamate non mis en cage de Foley à l’aide d’un laser UV qui a été positionné avec précision pour cibler un petit volume près de la dendrite choisie. La dernière étape consiste à surveiller les changements résultants de la fluorescence SBFI dans la dendrite et à surveiller les changements résultants du sodium dans les épines adjacentes. Les courants membranaires qui l’accompagnent sont également enregistrés.

À terme, l’utilisation d’outils pharmacologiques appropriés, tels que les bloqueurs de récepteurs, permettra d’étudier les mécanismes générant les signaux sodiques intracellulaires évoqués. Cette méthode fournit un outil fiable pour l’étude des signaux sodiques intracellulaires dans les petits compartiments cellulaires et dans les tissus cérébraux intacts. Ici, nous combinons l’imagerie par patch clamp de cellule entière et l’imagerie au sodium multiphotonique avec une procédure modifiée pour le décageage induit par la lumière UV.

Cela nous permet de surveiller les réponses cellulaires lors d’applications précises et focales de composés neuroactifs. La procédure sera démontrée par Karl KA et par Kaan Kleinhans, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer la dissection du tissu, placez immédiatement le cerveau dans une boîte de Pétri avec dissection glacée, du liquide céphalo-rachidien cérébral artificiel ou un LCR et disséquez un hémisphère en effectuant une coupe sagittale le long de la ligne médiane.

Effectuez une deuxième coupe dans l’orientation souhaitée en tant que surface de blocage. Fixez-le ensuite à l’étape de coupe d’un vibram avec de la super colle. Après avoir sorti la chambre de coupe et l’élément de refroidissement du vibram du congélateur, placez l’étape de coupe avec la section du cerveau dans la chambre.

Ensuite, placez l’élément de refroidissement dans la chambre et immergez le tissu dans la dissection glacée A LCR. Coupe suivante de 250 micromètres d’épaisseur. Tranches para sagittales de l’hippocampe avec un viome.

Assurez-vous que les fluides d’un CS sont bullés à tout moment. Après le tranchage, gardez le tissu sur un filet dans un bécher avec un LCR A normal et incubez à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, conservez le tissu à température ambiante.

Cette expérience devrait être menée dans un environnement sombre, mais elle est montrée ici dans des conditions de faible luminosité à des fins de tournage. Pour préparer le matériel, allumez d’abord les composants du système multiphotonique et ajustez l’alignement du faisceau laser infrarouge comme décrit dans le protocole de texte. Ajustez ensuite la longueur d’onde du laser multiphotonique et l’intensité du faisceau en modifiant les paramètres de la cellule pcal et des photomultiplicateurs.

Ensuite, allumez et calibrez le système de désencage en plaçant une lame d’échantillon fluorescente sous la lentille de l’objectif. Démarrez la routine d’étalonnage du logiciel de contrôle de l’unité de décage. Réglez le laser UV sur plusieurs points dans sa plage de balayage pendant que la fluorescence est capturée avec une caméra CCD en cliquant sur le spot laser UV.

À chaque point, ajustez le positionnement des miroirs à balayage galvanique pour qu’il corresponde à une certaine coordonnée dans le logiciel. Le positionnement précis du point de décantage est obtenu en important une image du système d’imagerie via une connexion réseau entre les ordinateurs de décageage et d’imagerie. À l’aide d’un logiciel de capture d’écran, lisez en permanence les images du logiciel d’imagerie et ajustez l’imagerie.

Et une fois terminé, les images en cage exportent de manière congruente toutes les 10 images du logiciel d’imagerie en tant qu’image de référence dans le flash pour assurer un réglage correct pendant toute l’expérience. Ensuite, allumez les composants d’électrophysiologie des micromanipulateurs et le dispositif d’application de pression pour l’administration du composé en cage dans la région cible. Pipettes tirées pour une pince de patch de cellule entière et une profusion locale à l’aide de capillaires en verre boro silicate poli au feu.

Placez ensuite la tranche dans le bain expérimental et pour la fixer avec une grille, placez le bain à la platine du microscope et perfuser durablement la tranche avec un LCR A. Commencez le clampage du patch sur cellules entières en chargeant la pipette patch avec une solution intracellulaire ou un ICS contenant du SBFI, puis chargez la pipette de perfusion locale avec un composé en cage. Fixez les pipettes aux micromanipulateurs correspondants et placez l’électrode de référence dans le bain.

Choisissez une cellule pyramidale CA avec un soma situé de 30 à 70 micromètres sous la surface de la coupe pour assurer une morphologie cellulaire intacte ainsi qu’une faible diffusion et atténuation du faisceau de décage. Approchez-vous de cette cellule à l’aide d’une pipette patch utilisant la vidéomicroscopie IR DIC. Appliquez une aspiration douce jusqu’à l’obtention d’un giga étanchéité.

Compense la capacité rapide. Ensuite, brisez la membrane et ouvrez la cellule pour obtenir une configuration cellulaire. Enfin, évaluez la viabilité des cellules en mode pince de courant.

Injectez un courant dépolarisant et vérifiez l’activité de pointe résultante pour effectuer l’imagerie et la stimulation. Tout d’abord, ajoutez tetro DOIND à un LCR pour empêcher l’activation des canaux sodiques voltage-dépendants et la génération de potentiels d’action. Visualisez la morphologie cellulaire à l’aide de l’excitation multiphotonique et de la fluorescence SBFI résultante.

Choisissez une dendrite épineuse pour l’expérience. Zoomez pour obtenir des images à une résolution plus élevée et placez une zone de délimitation autour de la dendrite. Placez ensuite la pipette avec le composé en cage près de la dendrite.

Positionnez la pipette de manière à permettre une perfusion locale efficace de la dendrite de votre choix. Ajustez le laser de décageage pour positionner le point de décage, près de la structure d’intérêt. Ensuite, définissez les régions d’intérêt sur la dendrite choisie et les épines adjacentes à l’aide d’un logiciel d’imagerie.

Approchez-vous de la zone d’intérêt et injectez le composé en cage pendant plusieurs secondes avec des enregistrements de patch de démarrage à basse pression, de pince et de fluorescence via le signal de déclenchement. Lors de la profusion locale du composé en cage, le faisceau d’excitation est complètement atténué pour éviter le blanchiment. Ensuite, arrêtez la profusion locale du composé en cage.

Augmentez ensuite l’intensité du laser à deux photons pour permettre une excitation efficace du SBFI et appliquez un flash UV pour initialiser sur le moniteur de cage les changements de fluorescence SBFI ainsi que le courant somatique procéder à l’arrêt de l’enregistrement une fois que la fluorescence SBFI est revenue à la ligne de base. Pour obtenir la morphologie, enregistrez une pile XY, Z de la région de la boîte de clip définie pour les mesures effectuées. Assurez-vous que cette pile est suréchantillonnée spatialement pour permettre une déconvolution optimale de l’image et pour augmenter la qualité et la résolution de l’image.

Le chargement des neurones avec SBFI à travers la pipette patch a permis de visualiser l’ensemble de la cellule, y compris les dendrites fines et les épines adjacentes en utilisant l’excitation multiphotonique après perfusion locale avec du glutamate en cage. L’application d’un flash UV à proximité d’une dendrite a entraîné une diminution transitoire de l’émission fluorescente de SBFI, reflétant une augmentation de la concentration intracellulaire de sodium. Dans le même temps, un courant entrant a été enregistré lors de l’application SOMA d’un flash UV sur des tranches, qui n’avaient pas été pré-imprégnées de glutamate en cage.

N’a jamais provoqué de changements dans la fluorescence SBFI ni de courants entrants indiquant que ces signaux sont dus à la mise en cage du glutamate. Les amplitudes maximales étaient légèrement plus élevées dans les épines proches du point de décage, tandis que les motifs pour les autres épines ressemblaient à la dendrite parente. La voie d’influx de sodium dans les dendrites et les épines en réponse à la désencage du glutamate a été étudiée à l’aide d’inhibiteurs sélectifs pour les récepteurs ionotropiques du glutamate perméables au sodium, les signaux somatiques intracellulaires induits par le glutamate et les courants somatiques provoqués ont été omis en présence de ces bloqueurs.

Lors du lavage des bloqueurs, les signaux sont récupérés, démontrant que la désactivation du glutamate active les récepteurs cytotropes du glutamate sur environ un neurone pyramidal, ce qui entraîne des courants sodiques intracellulaires transitoires et entrants. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de choisir l’intensité la plus faible possible pour le laser infrarouge afin de minimiser les dommages à la préparation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des étapes critiques de notre approche expérimentale pour étudier la signalisation du sodium dans les micro-restes cellulaires Une fois maîtrisée, cette technique permet une imagerie à haute résolution de l’activité évoquée des signaux ioniques intracellulaires dans le tissu intact, qui est exempt d’artefacts de mouvement comme introduit par d’autres techniques.