Name: Les analyses toxicologiques pour Effets dessais dun médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Découvrez les effets du médicament épigénétique DZNep sur le développement, la fécondité et la survie des moustiques du paludisme. Cette méthode permet d'évaluer son potentiel pour le contrôle des populations de vecteurs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Victor Marquez d’avoir fourni DZNep.HCl et Scotty Bolling d’avoir fabriqué les alimentateurs de sang. Les souches Mopti et SUA2La d’An. gambiae ont été obtenues auprès du Centre de recherche sur le paludisme et de ressources sur les réactifs de référence (MR4). Ce travail a été soutenu par le Fralin Life Science Institute et la subvention des National Institutes of Health 1R21AI094289 à Igor V. Sharakhov.

NOTE: Les trois parties du protocole décrivent l&#39;exposition aqueuse du médicament DZNep à larves de moustiques, une exposition sur la base de sang de DZNep aux femelles adultes pour étudier son effet de la fécondité, et SAH hydrolase inhibition par DZNep mesurés en utilisant une technique colorimétrique simple. Une représentation schématique de ces essais est représenté sur la Figure 1. 1. immatures développement Mosquito et la survie dosages NOTE: Cette section explique l&#39;utilisation d&#39;un médicament soluble dans l&#39;eau qui affecte le développement des larves de moustiques et de survie. <ol><li> Hatch A. oeufs gambiae à 28 ° C dans l&#39;eau distillée (dH 2 O) et les larves arrière stade leur 2 ème. </li><li> Prenez une DNAse six puits, RNAse plaque de culture cellulaire et versez 10 ml dH 2 O dans chaque puits. </li><li> Sélectionnez larves de moustiques au 2 ème stade et ajouter 15 larves par puits. Avant d&#39;ajouter 2 ème stade larvaire à l&#39;assiette, put les sur une serviette de papier pour 2-3 sec pour enlever l&#39;excès d&#39;eau. </li><li> puits d&#39;étiquetage avec des bandes de couleur à randomisent expérience. Étiqueter deux puits par concentration d&#39;essai sur chaque plaque (Figure 2). </li><li> Préparer un chlorhydrate 1 mM DZNep (MW = 298,73) solution mère en dissolvant 0,3 mg DZNep dans 1 ml de dH 2 O. Ajouter solution stock de DZNep.HCl aux puits marqués pour atteindre une concentration finale de 0,5 uM et 5,0 uM. NOTE: La solution stock peut être conservé à 4 ° C pour le court terme (un jour à un mois) ou -20 ° C pour le long terme (plus d&#39;un mois). REMARQUE: Ajout de la solution de stock pour concentrations susmentionnées ne changera pas le volume d&#39;eau dans les puits de manière significative. Toutefois, en cas de concentrations beaucoup plus élevées, il est souhaitable de dissoudre le composé dans le milieu des larves pour éviter toute dilution inutile du composé. </li><li> Ajouter la même quantité de nourriture pour poissons en flocons à chaque puits. Recouvrir la plaques et les incuber à 28 ° C dans un incubateur. </li><li> Enregistrer le taux de mortalité pour les larves de moustiques DZNep-traités et non traités, après une période d&#39;exposition de 24 h. Retirez et jetez les larves morts. Répétez cet enregistrement tous les jours jusqu&#39;à ce que toutes les larves meurent ou se nymphoser et émerger comme adultes. Notez la taille des larves tous les deux jours, ce est à dire, le jour 0, 2, 4, 6, 8, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils se transforment en pupes. </li><li> Analyser les données de développement et de mortalité des larves en utilisant un logiciel statistique adéquate d&#39;analyse. NOTE: Un graphique à barres peut être utilisé pour représenter les données de mortalité dans Microsoft Excel. Analyse multidimensionnelle de la variance (MANOVA) réalisée avec un logiciel tel que JMP ou SPSS va révéler si des doses différentes du médicament entraîner la survie significativement différent des larves de moustiques. </li></ol> 2. Fécondité Assay en administrant des drogues Grâce Feeder artificielle à moustiques femelles NOTE: Cette section décrit l&#39;ajout de la drogue à un sange en l&#39;amenant à moustiques femelles adultes en utilisant un système d&#39;alimentation artificielle. <ol><li> Mettre en place des cages de moustiques adultes avec le même nombre de moustiques mâles et femelles pour le contrôle et la cage de test. Fournir une solution sucrée à 10% trempé dans des boules de coton à la fois les cages jusqu&#39;à ce que les femmes sont prêtes pour l&#39;alimentation (3-5 jours est optimale pour Anopheles gambiae). </li><li> 2 heures avant le repas de sang, enlever les boules de coton pour assurer femelles ont faim. </li><li> Assembler deux dispositifs d&#39;alimentation sanguins artificiels qui se composent d&#39;un grand entonnoir inversé à fond de verre (diamètre = 50 mm, longueur = 70 mm) et une matière plastique entourant scellée avec de la colle industrielle. Fixez des tubes en plastique (diamètre = 7 mm) à deux sorties «mangeoires (diamètre = 10 mm) via des connecteurs pour entrées et sorties de l&#39;eau. Étiqueter les deux mangeoires que &quot;Control&quot; et &quot;5 uM DZNep.&quot; </li><li> En utilisant un élément de chauffage disponible dans le commerce, mis en place le programme pour l&#39;alimentation. Dans &quot;Menu&quot; Aller à &quot;Paramètres&quot;et sélectionnez &quot;Consignes&quot;; programmes préchargés apparaîtront. Sélectionnez &quot;SP1&quot; et régler la température de 37 ° C. NOTE: L&#39;élément chauffant se assure que le sang administré est maintenue à une température constante. Paramètres de programme supplémentaires peuvent être utilisés pour différentes espèces de moustiques ou d&#39;insectes. </li><li> Remplissez un seau avec de l&#39;eau et plongez l&#39;élément de chauffage dans l&#39;eau. </li><li> Coupez un morceau carré de Parafilm (50 mm x 50 mm) et l&#39;étirer de faire un film membraneuse mince. Couvrir le fond des mangeoires artificielles avec le Parafilm. Coupez un autre morceau de Parafilm (50 mm x 10 mm), l&#39;étirer et sceller les bords des mangeoires. </li><li> Assembler le système, la connexion des lignes d&#39;alimentation et l&#39;élément de chauffage par les tubes. Une fois terminé, basculer sur le système et sélectionnez &quot;SP1&quot;. Appuyez sur &quot;Entrée&quot; pour démarrer le système. REMARQUE: L&#39;eau va se échauffer à 37 ° C et maintenu à cette température. </li><li> Surveiller etempérature de l&#39;eau de e en utilisant un thermomètre dans le réservoir d&#39;eau. REMARQUE: Les connecteurs et tubes aident à maintenir une circulation constante de l&#39;eau à travers le système de sorte que la température du sang reste à 37 ° C. </li><li> Remplissez un bac à fond plat avec une solution d&#39;eau de Javel à 10% qui sera utilisé pour décontaminer tout déversement de sang. </li><li> Ajouter 2 ml de sang de mouton défibrillation à un tube à microcentrifugation. Nommez ce que &quot;Control&quot;. Répétez le processus pour le tube expérimentale étiquetés comme &quot;5 uM DZNep&quot; .Add 6 pi de solution stock DZNep (voir l&#39;étape 1.5) au tube expérimentale intitulée «5 uM DZNep&quot; Mélanger délicatement le sang et médicaments en inversant plusieurs fois. Incuber le tube 10 min à température ambiante. </li><li> En utilisant une pipette, ajouter 2 ml de contrôle et de test sanguin vers le haut de mangeoires étiquetés en conséquence. Jeter la pipette dans la solution d&#39;eau de Javel. Couvrir la cage avec un sac sombre et respirer de l&#39;air sur la cage périodiquement pour encourager females pour l&#39;alimentation. </li><li> Laissez les moustiques se nourrissent pendant environ 30 min. Une fois que l&#39;alimentation est terminée, éteignez l&#39;élément de chauffage, prendre les mangeoires et les dépouiller le Parafilm. Faire tremper le chargeur dans une solution d&#39;eau de Javel pour environ 5 min et bien rincer à l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Enlevez les mangeoires et de mettre des boules de coton avec de l&#39;eau de sucre sur les cages pendant 48 heures. Placer un plat d&#39;œufs contenant de l&#39;eau et le papier filtre dans les cages de nuit pour faciliter la ponte. Étiqueter chaque plat d&#39;œufs avec la concentration d&#39;essai ou de contrôle respective. </li><li> Retirez le plat d&#39;œufs lendemain et examiner le nombre et la structure des œufs sous un microscope stéréo. Obtenir des images en utilisant le logiciel Q-colors5. Comptez le nombre d&#39;œufs. Analyser différence dans le nombre d&#39;œufs obtenus à partir de tests et de contrôle des cages. REMARQUE: Un test t non apparié peut être utilisé pour déterminer si le nombre d&#39;oeufs sont significativement différentes (p ≤0.05). </li></ol> 3. biochimique Dosage de Mosquito Inhibition enzymatiquepar médicaments NOTE: Cette section décrit un dosage de l&#39;activité de l&#39;enzyme en utilisant DTNB comme indicateur pour déterminer l&#39;effet de DZNep sur SAH hydrolase inhibition chez les mâles adultes et les moustiques femelles. <ol><li> Préparer un M de Na 2 HPO 4 (phosphate de sodium dibasique) solution à 0,1 par addition de 14,19 g de Na 2 HPO 4 à 1 L de dH 2 O. Ensuite, préparer un M NaH 2 PO 4 (phosphate de sodium monobasique) solution à 0,1 par addition de 13,79 g de NaH 2 PO 4 à 1 L de dH 2 O. </li><li> Titrer le M Na 2 HPO 4 solution à 0,1 avec le 4 solution à 0,1 M NaH 2 PO à pH 8,5. NOTE: Ce sera la solution de travail des stocks de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Préparer une solution d&#39;homogénéisation de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) par addition de 0,3% de Triton X-100. NOTE: La solution d&#39;homogénéisation peut être conservé à 4 o C. </li><li> Prepare une SAH 1,6 mM (PM = 384,4) solution en dissolvant 6,15 mg de SAH dans 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Préparer une mM DTNB 1,6 (PM = 396,4) solution en dissolvant 6,3 mg de DTNB dans 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Conserver la solution de DTNB frais sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer un mM DZNep.HCl 1 (MW = 298,73) solution en dissolvant 0,3 mg de DZNep dans 1 ml dH 2 O. Ensuite, diluer la solution 1 mM DZNep en une série de concentrations allant de 1,000 pM à 0,002 pM dans dH 2 O. </li><li> Pour mesurer la SAH hydrolase inhibition par DZNep, préparer un extrait d&#39;enzyme brute de moustiques: Homogénéiser 10 moustiques adultes non gorgés dans 1 ml de glace-froid 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contenant 0,3% de Triton X- 100, en utilisant un homogénéiseur de tissu de verre. Transférer le broyat dans un tube de 1,5 ml à centrifuger. </li><li> Centrifuger l&#39;homogénat pendant 5 min à 10 000 xg à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un environnement propre1,5 ml de tube à centrifuger. Utiliser le surnageant comme source d&#39;enzyme pour le dosage biochimique SAH. </li><li> Pour le traitement à blanc (ce est à dire, pas DZNep, aucune enzyme), ajouter 50 ul de 1,6 mM de SAH, 50 ul de 1,6 mM de DTNB, et 100 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) dans les puits individuels d&#39;un 96 puits, microplaque à fond plat. </li><li> Pour le contrôle (ce est à dire, pas DZNep), ajouter 50 ul mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 ul, 50 ul de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) et 50 ul enzyme (SAH hydrolase obtenue à partir d&#39;extrait brut) à la personne puits. </li><li> Pour les traitements DZNep, ajouter 50 ul mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 pi, 50 pi et 50 pi enzyme concentration choisie DZNep à des puits individuels. Préparer 4 répétitions par traitement et de contrôle. </li><li> Lire la densité optique (DO) des échantillons d&#39;enzyme SAH à 405 nm pendant 5 min à 20 secondes d&#39;intervalle en utilisant un lecteur de microplaques de 96 puits. </li><li> Soustraire la DO du contrôle d&#39;une viergee traitement OD obtenue à partir de chaque puits. Calculer le pour cent restants activité hydrolase SAH utilisant l&#39;équation suivante:% d&#39;activité résiduelle = (Traitement OD / contrôle OD) x 100. </li></ol>

<ol><li>CDC Report. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/malaria">http://www.cdc.gov/malaria</a> (2010).</li>
<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+International+Journal+of+Organic+Evolution%22%5BJournal%5D)">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li>
<li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li>
<li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147(2009).</li>
<li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li>
<li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Cancer+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Direct%22%5BJournal%5D)">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless%2FdSetDB1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li>
<li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster%3A+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li>
<li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMA-1%2C+a+Mutant+p53+Reactivator%2C+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+%28DZNep%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962(2014).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Deazaneplanocin+A+%28DZNep%29%2C+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase%2C+promotes+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li>
<li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li>
<li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40(2011).</li>
<li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).</li>
<li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li>
<li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+repressive+complex+2+%28PRC2%29+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il ya plusieurs étapes essentielles à la bonne application de ce protocole. Pour le dosage des larves, il faut prendre soin d&#39;étiqueter correctement et de reproduire chaque concentration d&#39;essai. Randomisation échantillons d&#39;essai et en ajoutant le montant désigné de médicament à des puits d&#39;essai respectifs est une partie importante de ce dispositif expérimental mis en place. Avant d&#39;ajouter 2 ème stade larvaire des moustiques à une microplaque de 96 puits, chaque larve peut être mis sur ...

Le paludisme est responsable pour le plus grand nombre de décès liés à insectes dans le monde. Quelque 219 millions de cas se produisent chaque année dans le monde, entraînant environ 660 000 décès, principalement en Afrique 1. Malgré les efforts concertés, les programmes de lutte contre le paludisme sont confrontés à plusieurs défis. Bien que les moustiquaires imprégnées d&#39;insecticides à effet rémanent dans les composants et sous forme de pulvérisation de clés du programme, la résistance aux insecticides chez les populations locales entravent ces efforts 2. L&#39;augmentation rapide des populations de moustiques résistants aux insecticides est largement attribuable à la capacité des moustiques vecteurs du paludisme se adapter rapidement aux changements dans leur environnement et d&#39;exploiter différentes niches 3,4,5. Pour surmonter les mécanismes existants de la résistance aux insecticides, l&#39;exploration de nouvelles cibles d&#39;insecticide et des composés de la prochaine génération est justifiée. Un protocole simple, étape par étape pour déterminer l&#39;efficacité des insecticides expérimentaux sur les différentes étapes de la vie de paludisme mosquitoes pourrait considérablement améliorer ces efforts. Les études pharmacologiques des effets du médicament sur des lignées cellulaires et des modèles animaux ont établi l&#39;utilisation de médicaments épigénétiques comme un outil utile pour moduler la génétique et de la physiologie des cellules et des organismes. méthylation de l&#39;ADN et de modification des histones sont deux mécanismes épigénétiques qui affectent l&#39;expression génique dans des organismes multicellulaires, sans changer la séquence d&#39;ADN sous-jacente 6. Les modifications post traductionnelles telles que la méthylation jouent un rôle crucial dans le maintien de l&#39;intégrité cellulaire et l&#39;expression des gènes, et peuvent affecter plusieurs processus fondamentaux 7,8,9. Recherche dans certaines espèces d&#39;insectes ont souligné l&#39;importance de l&#39;épigénétique dans des procédés impliquant l&#39;ovogenèse et endiguer la maintenance de la cellule 10, ainsi que la compensation de dosage 11. Toutefois, ces aspects dans les vecteurs de maladies sont encore à explorer. L&#39;utilisation d&#39;un composé à moduler ce système chez les moustiques peut nous fournir ensites dans les nouvelles voies de cibles d&#39;insecticide. 3-déazaneplanocine A (DZNep) est un inhibiteur d&#39;histone méthylation connu, qui ont un impact sur ​​les différents types de cancers ont été étudiés 12,13,14,15,16. DZNep est un médicament soluble dans l&#39;eau stable qui inhibe indirectement épigénétique histone lysine N -méthyltransférase (EZH2), un composant du complexe répressif 2 Polycomb (PRC2) dans des cellules de mammifères. PRC2 joue un rôle important dans la régulation de la croissance des cellules souches dans les organismes multicellulaires, et la méthylation des histones est un aspect clé de la médiation PRC2 silençage génique. Chez les souris immunodéprimées, les cellules pré-traitées avec DZNep ont été montré pour être moins tumorigène 17. Ce médicament est de plus utilisée pour étudier d&#39;autres maladies, telles que la non-alcoolisées maladie du foie gras, dans lequel est impliqué EZH2 18. DZNep est un S -adenosylhomocysteine ​​établie (SAH) hydrolase inhibiteur de 19, 20. L&#39;inhibition de la SAH-hydrolase résultats dans unaccumulation de SAH et, à son tour, conduit à l&#39;inhibition de l&#39;activité méthyltransférase en limitant disponibles groupes donneurs de méthyle. SAH est un dérivé d&#39;acide aminé utilisé par de nombreux organismes, y compris les insectes, dans leurs voies métaboliques. Une étude récente a montré que DZNep à faibles doses peut affecter diapause et retarder le développement chez les insectes 21. Ici, un protocole robuste pour étudier les effets d&#39;un composé soluble dans l&#39;eau sur les différentes étapes de la vie de moustiques est développé. Les trois parties de ce protocole comprennent des instructions pour examiner les effets d&#39;un composé soluble dans l&#39;eau sur les moustiques femelles adultes immatures, de sang-alimentation et de l&#39;activité enzymatique de mâles adultes et les moustiques femelles. Premièrement, DZNep est dissous dans l&#39;eau pour étudier le développement de moustiques immatures et la survie. Ceci est réalisé à deux concentrations de comparer les différences résultant de dix fois plus de l&#39;exposition au médicament. Pour explorer l&#39;effet de la drogue sur les moustiques femelles adultes, DZNepest ajoutée au sang de mouton défibrillation et nourris artificiellement le sang aux femmes. Par la suite, les résultats de la drogue sur la fécondité est examinée. Enfin, un dosage de l&#39;activité enzymatique est réalisée en utilisant l&#39;acide 5,5&#39;-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB), comme indicateur pour déterminer l&#39;effet de la SAH-hydrolase sur DZNep inhibition chez le mâle adulte et les moustiques femelles. Bien que ce protocole est développé avec un moustique vecteur du paludisme, Anopheles gambiae, il peut être facilement adapté à l&#39;étude des effets des composés d&#39;intérêt sur ​​les espèces de moustiques ou d&#39;autres insectes. Les techniques décrites dans le présent protocole ne peuvent être efficacement appliquées à un médicament avec une solubilité limitée ou pas dans l&#39;eau ou des milieux aqueux.

<table><tbody><tr><td>Microplaque à 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>Une autre centrifugeuse peut être utilisée</td></tr><tr><td>Rouleaux de ruban coloré</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>Gobelets</td><td></td><td></td><td></td>à œufs</tr><tr><td>Papiers filtres</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Mangeoires en verre</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td><td></td><td></td><td></td>de tissus en verre</tr><tr><td>Élément chauffant</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>Un autre incubateur peut être utilisé</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation, 2&nbsp ; ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation, 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre&nbsp ;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>magasin à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

les analyses toxicologiques pour effets d&#39;essais d&#39;un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Résistance insecticide pose un problème majeur pour les programmes de lutte contre le paludisme. Les moustiques se adapter à un large éventail de changements dans l&#39;environnement rapidement, faire du paludisme contrôler un problème omniprésent dans les pays tropicaux. L&#39;émergence de populations résistantes aux insecticides justifie l&#39;exploration de nouvelles voies de cibles de médicaments et composés pour le contrôle des moustiques vecteurs. Médicaments épigénétiques sont bien établis dans la recherche sur le cancer, mais pas beaucoup est connu au sujet de leurs effets sur les insectes. Cette étude fournit un protocole simple d&#39;examiner les effets toxicologiques de 3-déazaneplanocine A (DZNep), un médicament épigénétique expérimental pour le traitement du cancer, sur le vecteur du paludisme, Anopheles gambiae. Une augmentation dépendante de la concentration de la mortalité et de diminution de la taille a été observée chez les moustiques immatures exposés à DZNep, alors que le composé réduit la fécondité des moustiques adultes par rapport au témoin traitements. En outre, on observe une diminution de toxicomanes en S -adénosylhomocystéine (SAH) activité hydrolase chez les moustiques après une exposition à DZNep rapport à contrôler traitements. Ces protocoles prévoient le chercheur avec une procédure simple, étape par étape pour évaluer plusieurs paramètres toxicologiques pour un médicament expérimental et, à son tour, de démontrer une approche unique multi-broches pour explorer les effets toxicologiques des médicaments ou composés de épigénétiques solubles dans l&#39;eau intérêts contre les moustiques vecteurs et autres insectes.

La figure 1 est une représentation schématique des essais; il décrit les différentes étapes de la procédure indiquée dans cet article. Comme le protocole est basé sur les différents stades de vie des moustiques, il n'y a pas séquence particulière à suivre pour les expériences détaillées ici. L'utilisateur peut choisir d'effectuer un ou plusieurs tests en même temps, en fonction de la disponibilité des échantillons. La Figure 2 montre la plaque mis en ...

Un protocole est développé pour examiner les effets d’un médicament épigénétique DZNep sur le développement, la fécondité et la survie des moustiques. Nous décrivons ici les procédures d’exposition aqueuse de DZNep aux moustiques immatures et d’exposition sanguine de DZNep aux moustiques adultes, en plus de mesurer l’inhibition de l’hydrolase de l’HSA.

Les analyses toxicologiques pour Effets d&#39;essais d&#39;un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’examiner les effets d’un médicament épigénétique sur les différents stades de la vie des moustiques du paludisme. Ceci est réalisé en dissolvant le médicament dans l’habitat des moustiques immatures afin de déterminer ses effets sur les larves, la survie et la taille du corps. Le médicament est également ajouté au sang de mammifères et donné aux moustiques femelles adultes, qui testeront l’effet du médicament sur la reproduction.Enfin, un test enzymatique est effectué afin de tester l’inhibition de l’enzyme moustique par le médicament. Les résultats montrent les effets des changements épigénétiques sur la survie du moustique du paludisme et pour Conti, sur la base de l’analyse des essais biologiques, nous avons d’abord eu l’idée de ce protocole. Lorsque nous apprenons que la dine est développée en tant que médicament épigénétique anticancéreux prometteur, ce médicament induit la mort apoptotique dans les cellules cancéreuses humaines en tant que mécanismes de modification de histo sont des animaux hormonaux conservés, nous goûtons en quelque sorte comme une application d’effection sur le moustique du paludisme.Pour commencer, sélect

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette interview, Georges Dimopoulos se concentre sur les mécanismes physiologiques utilisés par les moustiques pour combattre les infections à Plasmodium falciparum et de virus de la dengue. Explication n'est donnée pour combien de gènes clés réfractaires, ces gènes conférant une résistance aux agents pathogènes vecteurs, sont identifiés dans le moustique et comment cette connaissance peut être utilisé pour générer des moustiques transgéniques qui sont incapables de porter le parasite du...

Bâtir un meilleur moustique: l&#39;identification des gènes de résistance Activation fièvre malaria et la dengue chez A. gambiae et A. aegypti

Dans cette vidéo, nous démontrons le test topique pour déterminer la toxicité d’un insecticide potentiel sur les moustiques femelles adultes. À l’aide d’un antagoniste des récepteurs de la dopamine qui provoque une inhibition létale de la neurotransmission chez les moustiques, cette méthode décrit une façon d’évaluer les effets toxiques des insecticides lors de l’application topique.

Test topique : Technique permettant d’évaluer le potentiel insecticide des antagonistes des récepteurs de la dopamine sur les moustiques femelles adultes par application topique

Cette vidéo montre un test d’alimentation sanguine permettant d’évaluer la mortalité et la fécondité de composés d’essai ayant de nouveaux modes d’action sur des moustiques femelles. Cette technique permet de sélectionner de nouvelles classes d’insecticides pour tuer la population résistante de moustiques et contrôler la propagation des maladies.

Essai d’alimentation des moustiques : méthode d’évaluation des effets des composés d’essai sur la mortalité et la fécondité des moustiques femelles adultes

En raison des similitudes frappantes entre le cycle de vie et la biologie des parasites du paludisme des rongeurs et les parasites du paludisme chez l'homme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ici, nous avons normalisé certaines des techniques les plus importantes utilisées dans l'analyse phénotypique des espèces de paludisme de rongeurs de type sauvage et transgénique.

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

Les protocoles sont décrits pour évaluer la toxicité des chimies de moustiques adultes et immatures pour développement en tant que de nouvelles classes de larvicides et adulticides, endectocides. Les protocoles permettent à haut débit stable des chimies multiples à la dose de monopoint et évaluation ultérieure par dosage réponse dose pour déterminer la toxicité au contact ou par ingestion.

Protocoles pour tester la toxicité des nouvelles chimies insecticides aux moustiques

Décrit est une méthode permettant de gagner du temps et de l’espace pour compter les œufs et déterminer les taux d’éclosion des moustiques individuels à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire dans les puits, ce qui peut augmenter considérablement l’échelle et la vitesse des essais de fécondité et de fertilité.

Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)

Nous décrivons la méthodologie et l’importance de l’essai biologique d’application topique pour mesurer la sensibilité aux insecticides chez les moustiques et les mouches des fruits. Le test présenté est à haut débit, utilise la masse d’insectes - permettant ainsi de calculer une dose létale relativisée en masse au lieu de la concentration - et a probablement une variabilité plus faible que d’autres méthodes similaires.

Essai biologique d’application topique pour quantifier la toxicité des insecticides pour les moustiques et les mouches des fruits

Le test standard d’alimentation membranaire (SMFA) est considéré comme l’étalon-or pour l’évaluation et l’identification de composés antipaludiques potentiels. Ce système d’alimentation artificiel est utilisé pour infecter les moustiques afin d’évaluer davantage les effets de ces composés sur l’intensité et la prévalence du parasite Plasmodium falciparum .

Dosage standard d’alimentation par membrane pour la détection de l’infection à Plasmodium falciparum chez les moustiques vecteurs anophèles

Compte tenu de leur anatomie simple, les testicules d’anophèles offrent un bon modèle cytologique pour l’étude de la spermatogenèse. Ce protocole décrit l’hybridation in situ par fluorescence complète, une technique utilisée pour étudier ce processus biologique, ainsi que le phénotype des souches transgéniques présentant des mutations dans les gènes impliqués dans la production de spermatozoïdes.

Hybridation in situ par fluorescence complète pour étudier la spermatogenèse chez le moustique anophèle

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Le développement sexuel de Plasmodium se produit dans l’intestin moyen du moustique. Cibler les stades sexuels du parasite est une stratégie prometteuse pour bloquer la transmission. Nous avons développé Ookluc, un P. berghei transgénique exprimant la nanoluciférase après la formation de zygotes, permettant un criblage à haut débit de composés bloquant la transmission. Cet article détaille les méthodes de dépistage à l’aide d’Ookluc.

Ookluc : une ligne de Plasmodium berghei pour l’identification des composés bloquant la transmission

Découvrez les effets du médicament épigénétique DZNep sur le développement, la fécondité et la survie des moustiques du paludisme. Cette méthode permet d'évaluer son potentiel pour le contrôle des populations de vecteurs.

Les analyses toxicologiques pour Effets dessais dun médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques (Vidéo) | JoVE Journal

Les analyses toxicologiques pour Effets d'essais d'un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

Explorer plus de vidéos