L'expression de protéines fluorescentes en Branchiostoma lanceolatum Par injection dans l'ARNm non fécondés ovocytes

L’objectif global de cette procédure est d’introduire de l’ARNm, codant pour une protéine fluorescente dans les ovocytes de bronchos stoma lancia, latam pour permettre l’imagerie fluorescente in vivo des embryons en développement. Ceci est accompli en induisant d’abord la ponte des amfi ais, mâles et femelles mûrs par un choc thermique de 24 heures. Suite au choc thermique, les femelles et les mâles sont placés dans des gobelets de ponte individuels, permettant la collecte respectivement des ovocytes et du sperme.

Une fois que les cytes sont alignés dans un plat recouvert de polylysine, une aiguille de micro-injection spécialement préparée est utilisée pour injecter la solution à l’intérieur du noyau du cyte. La dernière étape est la fécondation du cyte avec une à cinq gouttes de spermatozoïdes. En fin de compte, le balayage laser à deux photons.

La microscopie est utilisée pour montrer l’expression ubiquitaire des protéines fluorescentes produites à partir de l’ARNm micro-injecté. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de micro-injection sont difficiles à apprendre en raison des compétences techniques requises qui sont impossibles à détailler et à couvrir dans l’impression. Pour commencer, préparez les plats enrobés de polylysine utilisés pour immobiliser les cytes lors de l’injection.

Pour chaque boîte de Pétri de culture cellulaire de 35 millimètres, couvrez le fond avec une solution de polylysine et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, transférez la solution de polylysine dans un autre plat et incubez à nouveau à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez la solution et laissez sécher les boîtes de Pétri à l’envers à température ambiante pendant deux heures.

Une fois sec, conservez la vaisselle enrobée enveloppée dans une pellicule plastique à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Pour préparer les plats enrobés d’aros utilisés pour la culture d’embryons injectés, la fabrication d’eau de mer artificielle et d’eau osmosée. Ensuite, dissoudre l’aros à une concentration de 1 % dans un SW filtré a rapidement versé la solution chaude d’aros d’une boîte de Pétri dans une autre pour assurer une très fine couche d’aros de la boîte.

Enveloppez les plats enrobés dans du film Saran et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Tout d’abord, préparez le mélange d’injection dans des ARN et du phénol d’eau sans ADN. Le rouge colore la solution et permet d’identifier les embryons injectés avec succès.

Ensuite, centrifugez le mélange pour granuler les cristaux et conservez-le sur de la glace jusqu’au moment de l’utiliser. Lorsque vous êtes prêt, chargez une pipette de 10 microlitres avec 0,5 microlitre du mélange d’injection, en évitant le fond du tube où les cristaux ont été granulés. Remplissez l’aiguille d’injection en pipetant la goutte d’injection de 0,5 microlitre.

Mélanger dans la grande ouverture de l’aiguille. Préparez deux aiguilles au cas où l’une d’entre elles se briserait pendant l’injection. Conservez les aiguilles dans un bocal avec de l’eau au fond pour éviter l’évaporation de l’injection.

Mélangez et placez à quatre degrés Celsius. Laissez le mélange d’injection se déplacer lentement jusqu’à l’extrémité de l’aiguille d’injection pendant au moins une heure pour minimiser la création de bulles. Pour commencer la collecte d’ovocytes et de spermatozoïdes, les mâles et les femelles sont choqués dans un SW pendant 24 heures, puis transférés dans des tasses individuelles une à deux heures avant la ponte.

Lors de la ponte, collectez immédiatement des spermatozoïdes et des cytes. Veillez à ne pas effrayer les adultes lors de la collecte. Un mouvement supplémentaire peut dissiper et donc diluer à la fois les spermatozoïdes et les cytes après le prélèvement.

Conservez les spermatozoïdes sur de la glace dans un tube de 1,5 millilitre et transférez les cytes dans un SW filtré dans des boîtes de Pétri pré-rincées. Transférez 100 à 500 cytes dans une autre boîte de Pétri de 35 millimètres pour effectuer les injections. Enfin, fertilisez le reste de la couvée cytaire comme contrôle de la qualité des spermatozoïdes et des cytes ou pour d’autres expériences.

Pour commencer la procédure d’injection, installez l’aiguille sur le micromanipulateur à un angle de 50 degrés par rapport au plan horizontal sous une lunette de dissection fluorescente avec 25 oculaires, transférez 30 cytes dans une boîte recouverte de polylysine et filtrez un SW pour aider à garder une trace des cytes injectés. Déposez-les le long d’une ligne de manière ordonnée. Injectez toujours de petits nombres pour minimiser l’exposition.

Temps à la polylysine, qui a tendance à déformer les embryons en développement. Utilisez l’éclairage en fond noir pour rendre les cytes aussi translucides que possible. Ensuite, à l’aide du bouton de mouvement grossier, approchez l’aiguille d’injection d’un cyte à l’aide d’une pince fine. Couper.

Ouvrez l’aiguille au niveau où la pointe commence à se courber en pulsant avec l’injecteur. Vérifiez que le mélange d’injection rouge s’écoule de l’aiguille à un grossissement de 200 x. Et à l’aide du bouton de mouvement fin, déplacez doucement l’aiguille d’injection à l’intérieur du noyau du cyte.

Si elle est insérée deux fois superficiellement, la solution injectée ne restera pas à l’intérieur du site UO. S’il est inséré trop loin, le site UO sera détruit. Injectez avec une à trois impulsions.

Si l’aiguille est suffisamment fine, injectez avec un débit continu à pression constante. Veiller à ce que le volume d’injection corresponde à un cinquième à un tiers du volume d’un seul ovocyte après l’injection. Retirez rapidement l’aiguille pour éviter les fuites.

Vérifiez que la solution injectée reste dans le cyte et qu’après quelques secondes, la solution injectée se répand dans tout le cyte. Passez au cycle suivant en ligne. Conservez quelques embryons injectés de chaque série comme contrôles négatifs pour estimer la fluorescence de fond lors du balayage des embryons injectés, fécondez les ovocytes dès que la série a été injectée.

Parce que la qualité des ovocytes diminue avec le temps, injectez et fécondez les cytes dans l’heure. Après la ponte. En fonction de la concentration de spermatozoïdes, ajoutez une à cinq gouttes de spermatozoïdes dans l’UY et faites tourner la boîte.

L’enveloppe de fécondation doit devenir apparente sur les embryons. Après environ une minute, laissez les embryons se détacher de la boîte recouverte de polylysine tout en injectant une autre série d’ovocytes. Une fois détachés, transférez les embryons dans une boîte de Pétri enrobée d’aros.

Retirez les embryons de la boîte recouverte de polylysine si possible. Avant l’étape à deux cellules. Au stade de deux à quatre cellules, sélectionnez les embryons injectés avec succès à l’aide d’une lunette de dissection fluorescente.

Avec un filtre DSR, une injection réussie est indiquée par une morphologie normale qui présente un signal fluorescent rouge dérivé du rouge de phénol. Conservez les embryons et filtrez un SW dans des boîtes de Pétri enrobées d’agros à 19 degrés Celsius jusqu’au stade souhaité pour l’imagerie in vivo, ces images représentatives d’embryons de bronchos stoma lancia lato ont été prises après micro-injection d’ARNm et de protéines fluorescentes d’enrobage. Cette première image montre que l’expression de l’EGFP nucléaire obtenue par micro-injection d’une construction H deux B-E-G-F-P peut être détectée dans les embryons dès le stade de 16 cellules.

Cet embryon au stade gastro est un exemple de co-expression ubiquitaire de l’EGFP nucléaire et membranaire. Le signal nucléaire résulte de la micro-injection d’une construction de cerise H deux BM tandis que la fluorescence au niveau des membranes cellulaires est obtenue par micro-injection d’une construction de boîte EEG FP CAAX. Une coupe optique de cet embryon au stade gastro montre comment les noyaux et les contours cellulaires sont mis en évidence respectivement par le mCherry ciblé par le nucléaire et l’EGFP associé à la membrane.

La démonstration visuelle de cette technique de micro-injection soutiendra les chercheurs dans le développement évolutif de la communauté biologique afin d’améliorer et de développer de nouvelles approches pour l’imagerie individuelle, la manipulation spécifique des gènes et la stabilité in afi, un modèle important pour comprendre l’évolution animale.