Name: Fluorescent rapide In Situ Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec dimmunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Découvrez une méthode FISH fluorescente rapide combinée à l'immunofluorescence pour étudier la dynamique de l'ARN Xist et les modifications épigénétiques des histones lors de l'inactivation du chromosome X.

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Nous remercions Hongjae Sunwoo pour ses conseils utiles pour la conception d’oligonucléotides dans l’ARN FISH. Nous remercions également Serenity Curtis pour l’édition du manuscrit. N.Y. a été soutenu par une bourse postdoctorale pour la recherche à l’étranger de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS). Ce travail a été soutenu par le NIH (RO1-GM102184), la Fondation de recherche March of Dimes (#6-FY12-337), et le Fonds de développement et la subvention du fiduciaire du Centre médical de l’Hôpital pour enfants de Cincinnati à Y.O.

1. Préparation de la sonde <ol><li> Obtenir de multiples oligonucléotides uniques dans Xist (oligonucléotides 20-30 nucléotides de longueur, de 63 à 65 ºC température de fusion, tableau 1) avec une modification 5&#39;-amino et de suspendre dans l&#39;eau. </li><li> Piscine quantités équimolaires d&#39;oligonucléotides avec 5&#39;-amino modification (total 4,5 ug) et étiqueter avec colorant fluorescent amine réactive en suivant les instructions du fabricant. <ol><li> Dissoudre les oligonucléotides regroupés dans Final 5 pi d&#39;eau sans nucléase et ajouter 3 pl de 1 M de bicarbonate de sodium à la solution d&#39;oligonucléotide. </li><li> Ajouter 2 ul DMSO pour le flacon de colorant et vortex amine réactive brièvement. </li><li> Mélanger la solution d&#39;oligonucléotides avec le colorant réactif dans du DMSO et on incube le mélange à température ambiante pendant 1 heure dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> On purifie les sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence par colonne G-25 suivie d&#39;une précipitation à l&#39;éthanol. <ol><li&gt; Centrifugeuse colonne G-25 à 750 x g pendant 1 minute pour éliminer l&#39;excès de tampon de stockage. </li><li> Ajouter de l&#39;eau sans nucléase 40 pi au mélange d&#39;étiquetage produit dans l&#39;étape 1.2.3 et appliquer à la colonne G-25. Centrifuger à 750 g pendant 2 min. </li><li> Ajouter 50 ul d&#39;eau sans nuclease, 10 ul de 3 M d&#39;acétate de sodium (pH 5,2) et 250 ul d&#39;éthanol à la sonde purifiée de l&#39;étape 1.3.2. Conserver à -80 ° C pendant 30 min et centrifuger à 21 000 g pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Laver les oligonucleotides précipitées une fois avec 1 ml d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Remettre en suspension dans 50 pi d&#39;eau sans nuclease ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) à une concentration finale d&#39;environ 10 uM. </li></ol></li><li> Diluer les sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence à une concentration finale de 250 nM avec un tampon d&#39;hybridation (10% formamide; 2x SSC [NaCl 300 mM; citrate de sodium 30 mM]; 2 mg / ml de BSA; 10% de sulfate de dextrane). NOTE: Avec ce protocole FISH rapide, oligonucléotide ppeignoirs dans Xist ont été conçus et utilisés à une concentration supérieure à la normale protocole FISH en utilisant des sondes oligonucléotidiques dans le but de raccourcir le temps d&#39;incubation pour l&#39;hybridation. </li></ol> 2. Préparation de la lame REMARQUE: Les diapositives peuvent être préparé pour immuno-FISH utilisant souches de souris embryonnaires (ES) ou le corps embryoïdes (EB) la différenciation des cellules 20, 21 soit par leur culture directement sur ​​lame de poly-lysine-traité ou en utilisant cytospin avec suspension cellulaire. Ici, la préparation de lame par cytospin se affiche. <ol><li> Aspirer le milieu de culture dans une boîte de 6 puits. Laver avec du PBS (température ambiante), et aspirer à fond. </li><li> Ajouter 0,5 ml de trypsine dans le plat à 6 puits, incuber pendant 5-10 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu et de disperser les cellules par pipetage doucement monter et descendre plusieurs fois. </li><li> Transférer les cellules dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 200 x g à température ambiante. </li><li> Jeter un moyenD délicatement les cellules en suspension dans 2 ml de PBS. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre, et on dilue la suspension de cellules à 4 x 10 5 cellules / ml en PBS. </li><li> Assembler un toboggan, une carte de filtre et une chambre avec un clip et placez-les dans les fentes appropriées dans le rotor de la cytospin. Ajouter 250 pi de chaque échantillon préparé à l&#39;étape 2.6 dans chaque chambre des unités assemblées dans le cytospin. Centrifuger à 1500 rpm pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Remplir trois bocaux de Coplin sur la glace avec 40 ml chacun de tampon PBS, CSK glacée (PIPES 10 mM, pH 6,8; NaCl 100 mM; mM de saccharose 300; 3 mM MgCl 2), et la zone tampon CSKT (tampon CSK avec 0,5% de Triton X-100), respectivement. </li><li> Après la cytospin est terminée, transférer rapidement le glissement vers PBS glacé et incuber pendant 5 min. </li><li> Placer les lames dans le tampon CSK glacée et incuber pendant 1 min. </li><li> Placer les lames dans le tampon CSKT glacée et incuber pendant 5 min. </li><li> Transférer le retomber dans glacée CSK buffert et incuber pendant 1 min. </li><li> Transférer la diapositive dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS et incuber pendant 10 min à température ambiante. </li></ol> 3. immunofluorescence <ol><li> Placer les lames dans une jarre de Coplin avec du PBST (1x PBS avec 0,1% de Tween-20) pour plusieurs sec. </li><li> Placer les lames à une inclinaison permettant tampon restant à se écouler sur le toboggan. Essuyez soigneusement l&#39;excès de liquide hors de la diapositive et placez-le dans une boîte pipette pointe vide avec de l&#39;eau. Superposez la lame avec 40 ul de la solution de blocage (PBS 1x, 1% de BSA, 0,1% de Tween-20), placer délicatement une lamelle, et incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer la lamelle, retirez la solution de blocage, et ajouter 40 ul de l&#39;anticorps primaire Histone H3K27me3 dilué à une concentration de 1: 500 dans une solution de blocage. Placer la lamelle couvre-objet sur la lame arrière et incuber pendant 30 min à température ambiante. REMARQUE: Un inhibiteur de RNase dans la solution de blocage peut être utile pour préserver l&#39;ARN dans cet ARN FISH protocole lorsque les anticorps polyclonaux sont utilisés. </li><li> Laver glisser deux fois dans des bocaux de Coplin remplis avec du PBST, pendant 5 minutes chacune, secouant doucement pendant le lavage. </li><li> Placer les lames à une inclinaison permettant tampon restant à se écouler sur le toboggan. Essuyez soigneusement l&#39;excès de liquide et placer la lame dans la boîte de pointe. Superposition avec 40 pi de l&#39;anticorps secondaire (1: 500) dilué dans une solution de blocage, placez une lamelle, et incuber pendant 15 minutes dans l&#39;obscurité. Pour les étapes suivantes, garder la lame dans l&#39;obscurité à tout moment. </li><li> Laver deux fois en COPLIN bocaux avec du PBST comme dans l&#39;étape 3.4. </li></ol> 4. ARN FISH avec sondes oligonucléotidiques <ol><li> Préchauffer une boîte pipette pointe vide avec de l&#39;eau au fond pour empêcher les glissements de sécher à 37 ° C pour l&#39;ARN FISH à l&#39;étape 4.3. </li><li> Placer les lames à une inclinaison permettant tampon restant à se écouler sur le toboggan. Essuyez soigneusement l&#39;excès de liquide de la lame de l&#39;étape 3.6 et placer la lame dans la boîte pipette pointe avec water au fond. Ajouter 500 ul de tampon de lavage FISH (10% de formamide dans du SSC 2x) sur la lame et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer la solution de lavage de FISH, ajouter 8 pi de sondes d&#39;oligonucléotides sur la diapositive, placez une lamelle, et transférer la diapositive à une boîte préchauffé pipette pointe avec de l&#39;eau au fond; incuber à 37 ° C pendant 1-2 h. </li><li> Placez trois bocaux de Coplin pré-chauffé dans un bain d&#39;eau à 37 ° C avec un tampon de lavage de poisson, tampon de lavage avec du DAPI, et 2x SSC. </li><li> Après 1-2 heures d&#39;incubation pour l&#39;ARN FISH, mettre la lame dans le tampon préchauffé lavage FISH. </li><li> Incuber la lame pendant quelques minutes jusqu&#39;à ce que la lamelle se détache de la diapositive. </li><li> Placer la lame de nouveau dans le tampon de lavage, et continuer l&#39;incubation pendant 5 min. </li><li> Transférer la diapositive à l&#39;autre bocal de Coplin avec un tampon de lavage FISH préchauffé avec 0,5 ng / ml DAPI et incuber pendant 5 min. </li><li> Transférer la diapositive à l&#39;autre bocal de Coplin avec 2x SSC préchauffé et incuber pendant 5 kmn. </li><li> Placer les lames à une inclinaison permettant tampon restant à se écouler sur le toboggan. Essuyez soigneusement l&#39;excès de liquide et placer la lame de nouveau dans une zone de la pointe sèche. Ajouter 4 pi de antifade avec DAPI sur la lame et placez une lamelle. </li><li> Sceller la lamelle avec du vernis à ongles et d&#39;observer sous un microscope. Le coulisseau peut être stocké à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant quelques mois. </li></ol>

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Dans cet article, nous avons présenté un rapide protocole immuno-FISH qui prend moins de 5 h pour compléter la préparation des lames, ARN Xist FISH, et l&#39;immunofluorescence pour H3K27me3. En comparaison avec l&#39;approche générale immuno-FISH pour les ARN Xist détection, qui a généralement besoin d&#39;une nuit d&#39;incubation pour l&#39;ARN FISH, ce protocole non seulement réduit considérablement le temps passé, mais améliore également la sensibilité du système immunitaire FISH utilisant des sondes oligonucléotid...

Mammalian inactivation du chromosome X (XCI) est une stratégie pour compenser le déséquilibre de dosage de gène lié à l&#39;X entre XX et XY, dans lequel l&#39;un des deux chromosomes X chez les femelles est transcriptionnellement 1 inactivé. Inactivation du chromosome X est un système modèle très longtemps ARN non codant (lncRNA) recherche. Inactivation du chromosome X est réglementée par de multiples lncRNAs, et a été largement étudiée au cours des dernières décennies à découvrir les mécanismes de diaphonie entre lncRNAs, la transcription, la structure de la chromatine et l&#39;organisation nucléaire 2, 3. Le centre d&#39;inactivation X (XIC) situé sur le chromosome X est un locus génétique complexe constitué d&#39;un certain nombre de gènes qui produisent des ARN non codants 4. X-inactive transcrit spécifique (Xist) lncRNA chez les mammifères euthériens est un de ces lncRNA qui joue un rôle crucial dans inactivation du chromosome X 5,6. transcriptions de Xist entourent l&#39;emplacement du future Xi pour lancer inactivation du chromosome X, et apparaît comme un nuage quand visualisées en utilisant l&#39;ARN FISH; cette formation est appelé le &quot;Xist Couverture&quot; 7. Étant donné que l&#39;ARN Xist interagit avec diverses enzymes de modification de la chromatine, la co-localisation des nuages ​​Xist avec différentes modifications épigénétiques de la chromatine et la transcription silencieux répressif est observée au cours de l&#39;inactivation du chromosome X-8. Par exemple, l&#39;ARN Xist interagit avec polycomb complexe répressive 2 (PRC2) qui est responsable de H3K27me3 et induit un état ​​de la chromatine répressive 9. L&#39;apparition du nuage de Xist sur ​​le Xi et son co-localisation avec la modification H3K27me3 intensive représente un paysage de hétérochromatine facultative du Xi 10,11. Techniques cytogénétiques, comme l&#39;ADN / ARN FISH ont parcouru un long chemin de la méthode traditionnelle en utilisant des sondes radiomarquées 12 aux techniques récentes et avancées avec une sensibilité accrue etl&#39;imagerie de fluorescence en utilisant plusieurs sondes oligonucléotidiques 13,14. ADN / ARN FISH couplé avec immunofluorescence a été régulièrement utilisé comme un outil cytologique de comprendre l&#39;organisation spatio-temporelle nucléaire, localisation d&#39;ARN, la structure de la chromatine et modifications. La préparation de sonde la plus standard pour ARN FISH implique l&#39;utilisation de plasmide ou de chromosomes artificiels (BAC) clones bactériens et leur étiquetage ultérieure soit avec translation de coupure ou amorçage aléatoire 15. Cependant, près de 70% des gènes chez la souris et 40% des gènes chez l&#39;homme montrent un chevauchement des sens et antisens transcriptions 16, donc nécessitant une méthode de FISH spécifique de brin afin de distinguer sens et antisens transcriptions. In vitro des sondes d&#39;ARN transcrits (ribosonde ) sont souvent utilisés pour spécifique de brin ARN FISH 17,18; Toutefois, il se agit de la préparation d&#39;un clone de plasmide ou d&#39;un produit PCR avec T7, SP6, ou le promoteur de T3 et ribosondes de synthèse. En outre, des ribosondes dérivé de génomeic ADN ou ADNc contiennent souvent des régions non-spécifiques et les éléments répétitifs, qui se traduisent par un bruit de fond élevé. Un autre problème est que ribosondes, qui sont à quelques centaines de nucléotides de long et contiennent plusieurs fluorophores, ne peuvent pas pénétrer efficacement dans le noyau. Pour éviter cela, plusieurs sondes oligonucléotidiques courtes marqués avec un fluorophore unique à la fin ont été développées qui ont une bonne sensibilité, la puissance du signal uniforme, et la facilité de purification et de manipulation 14. En outre, les oligonucleotides d&#39;ADN sont généralement plus stables que les ARN. Nous avons appliqué une stratégie similaire en utilisant des oligonucléotides ARN Xist dans FISH 19 avec immunofluorescence de comprendre la dynamique de l&#39;Xi épigénétiques induites par Xist lncRNA pendant le processus d&#39;inactivation du chromosome X. Ce protocole décrit la création de sondes oligonucléotidiques et une bonne préparation des cellules, ainsi que l&#39;utilisation de l&#39;immunofluorescence et l&#39;ARN FISH. ARN Xist FISH utilisant oligonucle multiplesotides est approche rentable à long terme si ARN Xist FISH est effectuée régulièrement dans son laboratoire. Cette technique peut être utilisée pour identifier lncRNAs dans les cellules tout en traçant simultanément son co-localisation avec des modifications ou des facteurs épigénétiques. Un avantage majeur du protocole est la possibilité de modifier facilement pour l&#39;adapter à ses intérêts de recherche.

<table><tbody><tr><td>oligonucléotides avec modification 5'-amino</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Colorant réactif</td><td>Life Technologies</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin G-25 colonnes</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine, biologie moléculaire Qualité (pour tampon d’hybridation)</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10715859103</tr><tr><td>Histone H3K27me3 anticorps</td><td>Active Motif</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Chèvre Anti-souris, hautement adsorbé</td><td>croisé Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold réactif anti-décoloration</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent rapide in situ protocole hybridation pour arn xist combinée avec d'immunofluorescence histone modification dans inactivation du chromosome x

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combinant ARN hybridation fluorescente in situ (FISH) avec immunofluorescence (immuno-FISH) crée une technique qui peut être utilisé au niveau de la cellule unique pour détecter les dynamiques spatiales de localisation d&#39;ARN avec perspicacité simultanée dans la localisation de protéines, les modifications épigénétiques et autres détails qui peut être mis en évidence par immunofluorescence. Inactivation du chromosome X est un paradigme de longue ARN non codant (lncRNA) silençage génique médiée. transcrit spécifique (Xist) accumulation de lncRNA X-inactive (appelé un nuage Xist) sur l&#39;un des deux chromosomes X chez les femelles-mammifères est une étape critique pour initier inactivation du chromosome X. ARN Xist interagit directement ou indirectement avec diverses enzymes de modification de la chromatine et introduit paysages épigénétiques distinctes au chromosome X inactif (Xi). Une des caractéristiques de l&#39;épigénétique connu Xi est l&#39;histone H3 lysine triméthyl-27 (H3K27me3) modification. Ici, nous décrivons un immuno-FISH simple et rapideprotocole pour la détection de l&#39;ARN Xist en utilisant l&#39;ARN FISH avec plusieurs sondes d&#39;oligonucléotides couplés avec immunofluorescence de H3K27me3 d&#39;examiner la localisation des ARN Xist et des modifications épigénétiques associées. Utilisant des sondes oligonucléotidiques se traduit par un temps d&#39;incubation plus courte et une détection plus sensible de l&#39;ARN Xist rapport au transcrit in vitro des sondes d&#39;ARN (des ribosondes). Ce protocole fournit un outil puissant pour comprendre la dynamique de lncRNAs et sa modification épigénétique associé, la structure de la chromatine, organisation nucléaire et la régulation transcriptionnelle.

Des images représentatives de rapide immuno-FISH sont présentés dans la figure 1A. Co-localisation du nuage et H3K27me3 signaux ARN Xist sur le Xi a été détecté dans la différenciation des cellules femelles. Au jour 12 lors de la différenciation, plus de 90% des cellules EB avait un nuage Xist (figure 1B). Des sondes oligonucléotidiques courtes efficacement pénétré dans le noyau, ce qui conduit à une visualisation de la quasi-totalité des signaux H3K27me3 co-localisée avec l'ARN Xist <s...

Nous avons développé un protocole d’hybridation in situ fluorescente (FISH) spécifique au brin facilement personnalisable combiné à l’immunofluorescence. Cela permet un examen détaillé de la dynamique de l’ARN avec un aperçu simultané de la structure de la chromatine, de l’organisation nucléaire et de la régulation transcriptionnelle au niveau de la cellule unique.

Fluorescent rapide In Situ Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec d'immunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la dynamique de l’ARN non codant long et sa modification épigénétique associée lors de l’inactivation du chromosome X en utilisant une hybridation in situ fluorescente rapide combinée à l’immunofluorescence. Ce protocole nécessite la préparation de cytosine de lames avec des cellules embryonnaires différenciatrices, qui sont imprégnées puis fixées pour la coloration. Ensuite, un marqueur fluorescent localisé par un anticorps contre l’histone H trois triméthyl lysine 27 s’accumule sur le chromosome X inactif.La dernière étape utilise des sondes oligonucléotidiques qui contiennent une modification aminologique à cinq premiers et sont marquées avec un fluorophore réactif moyen AM pour effectuer l’existence. Poisson à ARN. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour montrer la localisation du nuage d’ARN existant et la modification des histones au cours de la différenciation des cellules E ES.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que nous utilisons plusieurs oligonucléotides uniques, qui sont marqués avec un seul fluoro quatre. Cela nous fournit une détection spécifique trans, ce qui réduit le bruit de fond, ce qui augmente également la pénétration dans le noyau et augmente ou augmente l’intensité des signaux. De plus, lorsque nous augmentons la concentration des sondes, nous pouvons réduire considérablement le temps nécessaire à la réalisation de cette expérience d’immuno-poisson.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la localisation de l’AR existant sur le chromosome ex inactif et de sa modification chromonomique associée. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes biologiques pour la détection des AR et sa modification épigénétique, sa localisation nucléaire et sa régulation transgénérationnelle associées. Pour préparer les sondes d’abord, obtenez plusieurs oligonucléotides de 20 à 30 longueurs nucléotidiques avec une température de fusion de 63 à 65 degrés Celsius, et qui contiennent une séquence antisens unique à un ARN existant et une modification aminologique à cinq primes.Mettez en suspension ces oligonucléotides dans des quantités équimolaires de piscine d’eau pure des différents oligos pour un total de 4,5 microgrammes d’ADN. Ensuite, en suivant les instructions du fabricant, étiquetez les oligos avec un colorant fluorescent réactif am mean après l’étiquetage des oligos. Passez-les dans une colonne G 25.Ensuite, à l’aide d’éthanol et d’acétate de sodium, précipitez les oligos. Cela nécessite une période d’une demi-heure à moins 80 degrés Celsius avant une rotation de 21 000 G à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez le granulé une fois avec de l’éthanol à 70 % après le lavage.Resus met en suspension les oligos dans 50 microlitres d’eau sans nucléases ou tris EDTA à une concentration finale de 10 micromolaires d’ADN. Cela fait que la solution mère de la sonde pour utiliser la sonde la reconcentre à 250 nano molaires dans le tampon d’hybridation. Pour commencer, faites en sorte que les cellules différenciatrices ES ou EB se développent dans six boîtes de puits, aspirez le milieu de culture des puits, puis lavez les cellules à température ambiante.PBS aspire complètement le PBS. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de solution de trypsine dans chaque puits et incubez la plaque pendant cinq à 10 minutes. Arrêtez la réaction de trébuchement en ajoutant cinq millilitres de milieu dans chaque puits et en les pipetant doucement.Transférez ensuite les cellules dans un tube de 15 millilitres. Maintenant, faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 200 G à température ambiante, retirez tout le surnageant et remettez en suspension la palette de cellules dans deux millilitres de PBS. Comptez ensuite les cellules et diluez la suspension à 400 000 cellules par millilitre dans du PBS.Maintenant, assemblez chaque lame à l’aide d’une carte de filtre, d’une chambre et d’un clip. Faites-en autant que nécessaire et positionnez-les dans le rotor d’une rotation cyto. Ajoutez 250 microlitres de suspension cellulaire à chaque lame et faites tourner les lames à 1500 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante.Puis perme et fixer. Tout d’abord, transférez rapidement les lames sur du PBS glacé pendant cinq minutes comme étape de rinçage. Deuxièmement, transférez les lames dans un tampon CSK glacé pendant une minute pour gonfler, troisièmement, déplacez les lames dans un tampon CSKT pendant cinq minutes pour perméer les cellules.Quatrièmement, lavez les cellules dans un tampon CSK glacé pendant une minute. Et enfin, fixez-les à température ambiante 4 % aldéhyde paraforme dans PBS pendant 10 minutes. Tout d’abord, retirez les lames de la solution PFA.Ensuite, transférez-les dans un bocal coplan avec PBST pendant plusieurs secondes, puis placez-les sur une pente pour les égoutter. Ensuite, chargez une boîte de pointes de pipette vide avec de l’eau sous l’insert du porte-pointe. Essuyez ensuite le verso des diapositives et transférez-les dans cette boîte.Recouvre maintenant chaque lame de 40 microlitres de solution de blocage et recouvre doucement les lames avec des lamelles. Laissez-les incuber dans la boîte pendant 10 minutes sur le banc. Retirez ensuite les lamelles et placez les glissières sur une inclinaison.Ajoutez maintenant 40 microlitres de la solution d’anticorps primaires. Replacez les lamelles et laissez les lames incuber sur le banc pendant 30 minutes après une demi-heure. Retirez les anticorps non liés en lavant les lames deux fois dans du PBST dans des bocaux Coplan.Secouez doucement et laissez aller chaque lavage pendant cinq minutes. Remettez ensuite les lames en inclinaison et laissez le PBST s’écouler. Poursuivez en essuyant l’excès de solution à l’arrière des lames, puis en remettant les lames dans la boîte.Appliquez maintenant 40 microlitres d’une à 500 solutions d’anticorps secondaires sur chaque lame. Couvrez les lames avec des lamelles et laissez-les incuber sur la paillasse pendant 15 minutes à l’abri de la lumière qui avance. Les lames doivent toujours être protégées de la lumière.Retirez les anticorps à l’aide du PBST comme précédemment, puis placez les lames sur une inclinaison pour les égoutter. Lors de l’immunofluorescence, préchauffez une boîte contenant de l’eau à 37 degrés Celsius. Après avoir essuyé le tampon de lavage à l’arrière des diapositives, placez-les dans une boîte à pointes de pipette avec de l’eau de température et appliquez 500 microlitres de tampon de lavage pour poisson sur chaque lame.Laissez-les incuber pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, aspirez la solution des lames à côté de chaque lame à huit microlitres de la sonde de travail à température ambiante et appliquez une lamelle. Transférez maintenant les lames dans la boîte de préchauffage et incubez-les pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius.Après l’incubation, baignez les lames dans un tampon de lavage de poisson dans un bocal coplan à 37 degrés Celsius. Lorsque les lamelles tombent, ce qui prend généralement quelques minutes, retirez-les et laissez les lamelles incuber pendant cinq minutes. Transférez ensuite les lames dans un bocal contenant un tampon de lavage de poisson avec 0,5 nanogramme de teinture par millilitre, également à 37 degrés Celsius.Laissez les lames incuber dans cette solution pendant cinq minutes. Maintenant, lavez la diapositive en deux XSSC cinq minutes à 37 degrés Celsius. Pour finir, placez les lames sur un drain incliné en excès de deux XSSC.Essuyez-les et montez-les avec quatre microlitres de solution Antifa contenant du dpi. Des poissons immunologiques rapides ont été utilisés pour observer la localisation de l’ARN existant et la modification des histones. Dans la différenciation des cellules EB féminines, l’ARN ressemble à un nuage vert couvrant toute la longueur du chromosome X inactivé Dans ces cellules, la modification de l’histone H trois triméthyl lysine 27 est visualisée en rouge et les noyaux sont contre-colorés par DPI en bleu.Les cellules EB de souris femelles en différenciation ont été traitées au 12e jour de différenciation. À ce moment-là, plus de 90 % des cellules ont montré un nuage existant dans les cellules Les noyaux de courtes sondes oligonucléotidiques ont été capables de pénétrer efficacement, ce qui a entraîné la coloration de presque tous les signaux de l’histone H trois triméthyl lysine 27 Avec des nuages d’ARN existants dans 150 noyaux, 97 % des signaux d’ARN existants se sont trouvés co-localisés avec ces histones méthylées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinq heures pour compléter une légère préparation de préparation.L’immuno-immunofluorescence pour son est de trois trimestres en 27 et existent PR. Si nous avons bien performé, ce protocole immuno-poisson peut être appliqué à d’autres modifications épigénétiques de l’ARN et protéines d’intérêt. Afin d’appliquer ce protocole à un système biologique différent, vous aurez peut-être besoin d’une optimisation. Bonne chance dans vos expériences.

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Fluorescent rapide In Situ Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec dimmunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X (Vidéo) | JoVE Journal

Fluorescent rapide In Situ Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec d'immunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X

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