Fluorescent rapide In Situ Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec d'immunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la dynamique de l’ARN non codant long et sa modification épigénétique associée lors de l’inactivation du chromosome X en utilisant une hybridation in situ fluorescente rapide combinée à l’immunofluorescence. Ce protocole nécessite la préparation de cytosine de lames avec des cellules embryonnaires différenciatrices, qui sont imprégnées puis fixées pour la coloration. Ensuite, un marqueur fluorescent localisé par un anticorps contre l’histone H trois triméthyl lysine 27 s’accumule sur le chromosome X inactif.

La dernière étape utilise des sondes oligonucléotidiques qui contiennent une modification aminologique à cinq premiers et sont marquées avec un fluorophore réactif moyen AM pour effectuer l’existence. Poisson à ARN. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour montrer la localisation du nuage d’ARN existant et la modification des histones au cours de la différenciation des cellules E ES.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que nous utilisons plusieurs oligonucléotides uniques, qui sont marqués avec un seul fluoro quatre. Cela nous fournit une détection spécifique trans, ce qui réduit le bruit de fond, ce qui augmente également la pénétration dans le noyau et augmente ou augmente l’intensité des signaux. De plus, lorsque nous augmentons la concentration des sondes, nous pouvons réduire considérablement le temps nécessaire à la réalisation de cette expérience d’immuno-poisson.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la localisation de l’AR existant sur le chromosome ex inactif et de sa modification chromonomique associée. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes biologiques pour la détection des AR et sa modification épigénétique, sa localisation nucléaire et sa régulation transgénérationnelle associées. Pour préparer les sondes d’abord, obtenez plusieurs oligonucléotides de 20 à 30 longueurs nucléotidiques avec une température de fusion de 63 à 65 degrés Celsius, et qui contiennent une séquence antisens unique à un ARN existant et une modification aminologique à cinq primes.

Mettez en suspension ces oligonucléotides dans des quantités équimolaires de piscine d’eau pure des différents oligos pour un total de 4,5 microgrammes d’ADN. Ensuite, en suivant les instructions du fabricant, étiquetez les oligos avec un colorant fluorescent réactif am mean après l’étiquetage des oligos. Passez-les dans une colonne G 25.

Ensuite, à l’aide d’éthanol et d’acétate de sodium, précipitez les oligos. Cela nécessite une période d’une demi-heure à moins 80 degrés Celsius avant une rotation de 21 000 G à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez le granulé une fois avec de l’éthanol à 70 % après le lavage.

Resus met en suspension les oligos dans 50 microlitres d’eau sans nucléases ou tris EDTA à une concentration finale de 10 micromolaires d’ADN. Cela fait que la solution mère de la sonde pour utiliser la sonde la reconcentre à 250 nano molaires dans le tampon d’hybridation. Pour commencer, faites en sorte que les cellules différenciatrices ES ou EB se développent dans six boîtes de puits, aspirez le milieu de culture des puits, puis lavez les cellules à température ambiante.

PBS aspire complètement le PBS. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de solution de trypsine dans chaque puits et incubez la plaque pendant cinq à 10 minutes. Arrêtez la réaction de trébuchement en ajoutant cinq millilitres de milieu dans chaque puits et en les pipetant doucement.

Transférez ensuite les cellules dans un tube de 15 millilitres. Maintenant, faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 200 G à température ambiante, retirez tout le surnageant et remettez en suspension la palette de cellules dans deux millilitres de PBS. Comptez ensuite les cellules et diluez la suspension à 400 000 cellules par millilitre dans du PBS.

Maintenant, assemblez chaque lame à l’aide d’une carte de filtre, d’une chambre et d’un clip. Faites-en autant que nécessaire et positionnez-les dans le rotor d’une rotation cyto. Ajoutez 250 microlitres de suspension cellulaire à chaque lame et faites tourner les lames à 1500 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante.

Puis perme et fixer. Tout d’abord, transférez rapidement les lames sur du PBS glacé pendant cinq minutes comme étape de rinçage. Deuxièmement, transférez les lames dans un tampon CSK glacé pendant une minute pour gonfler, troisièmement, déplacez les lames dans un tampon CSKT pendant cinq minutes pour perméer les cellules.

Quatrièmement, lavez les cellules dans un tampon CSK glacé pendant une minute. Et enfin, fixez-les à température ambiante 4 % aldéhyde paraforme dans PBS pendant 10 minutes. Tout d’abord, retirez les lames de la solution PFA.

Ensuite, transférez-les dans un bocal coplan avec PBST pendant plusieurs secondes, puis placez-les sur une pente pour les égoutter. Ensuite, chargez une boîte de pointes de pipette vide avec de l’eau sous l’insert du porte-pointe. Essuyez ensuite le verso des diapositives et transférez-les dans cette boîte.

Recouvre maintenant chaque lame de 40 microlitres de solution de blocage et recouvre doucement les lames avec des lamelles. Laissez-les incuber dans la boîte pendant 10 minutes sur le banc. Retirez ensuite les lamelles et placez les glissières sur une inclinaison.

Ajoutez maintenant 40 microlitres de la solution d’anticorps primaires. Replacez les lamelles et laissez les lames incuber sur le banc pendant 30 minutes après une demi-heure. Retirez les anticorps non liés en lavant les lames deux fois dans du PBST dans des bocaux Coplan.

Secouez doucement et laissez aller chaque lavage pendant cinq minutes. Remettez ensuite les lames en inclinaison et laissez le PBST s’écouler. Poursuivez en essuyant l’excès de solution à l’arrière des lames, puis en remettant les lames dans la boîte.

Appliquez maintenant 40 microlitres d’une à 500 solutions d’anticorps secondaires sur chaque lame. Couvrez les lames avec des lamelles et laissez-les incuber sur la paillasse pendant 15 minutes à l’abri de la lumière qui avance. Les lames doivent toujours être protégées de la lumière.

Retirez les anticorps à l’aide du PBST comme précédemment, puis placez les lames sur une inclinaison pour les égoutter. Lors de l’immunofluorescence, préchauffez une boîte contenant de l’eau à 37 degrés Celsius. Après avoir essuyé le tampon de lavage à l’arrière des diapositives, placez-les dans une boîte à pointes de pipette avec de l’eau de température et appliquez 500 microlitres de tampon de lavage pour poisson sur chaque lame.

Laissez-les incuber pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, aspirez la solution des lames à côté de chaque lame à huit microlitres de la sonde de travail à température ambiante et appliquez une lamelle. Transférez maintenant les lames dans la boîte de préchauffage et incubez-les pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, baignez les lames dans un tampon de lavage de poisson dans un bocal coplan à 37 degrés Celsius. Lorsque les lamelles tombent, ce qui prend généralement quelques minutes, retirez-les et laissez les lamelles incuber pendant cinq minutes. Transférez ensuite les lames dans un bocal contenant un tampon de lavage de poisson avec 0,5 nanogramme de teinture par millilitre, également à 37 degrés Celsius.

Laissez les lames incuber dans cette solution pendant cinq minutes. Maintenant, lavez la diapositive en deux XSSC cinq minutes à 37 degrés Celsius. Pour finir, placez les lames sur un drain incliné en excès de deux XSSC.

Essuyez-les et montez-les avec quatre microlitres de solution Antifa contenant du dpi. Des poissons immunologiques rapides ont été utilisés pour observer la localisation de l’ARN existant et la modification des histones. Dans la différenciation des cellules EB féminines, l’ARN ressemble à un nuage vert couvrant toute la longueur du chromosome X inactivé Dans ces cellules, la modification de l’histone H trois triméthyl lysine 27 est visualisée en rouge et les noyaux sont contre-colorés par DPI en bleu.

Les cellules EB de souris femelles en différenciation ont été traitées au 12e jour de différenciation. À ce moment-là, plus de 90 % des cellules ont montré un nuage existant dans les cellules Les noyaux de courtes sondes oligonucléotidiques ont été capables de pénétrer efficacement, ce qui a entraîné la coloration de presque tous les signaux de l’histone H trois triméthyl lysine 27 Avec des nuages d’ARN existants dans 150 noyaux, 97 % des signaux d’ARN existants se sont trouvés co-localisés avec ces histones méthylées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinq heures pour compléter une légère préparation de préparation.

L’immuno-immunofluorescence pour son est de trois trimestres en 27 et existent PR. Si nous avons bien performé, ce protocole immuno-poisson peut être appliqué à d’autres modifications épigénétiques de l’ARN et protéines d’intérêt. Afin d’appliquer ce protocole à un système biologique différent, vous aurez peut-être besoin d’une optimisation. Bonne chance dans vos expériences.