Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d'imagerie

La procédure présentée ici montre une méthode simple de préparation des lipides soutenus par MICA par des couches adaptées à l’imagerie à haute résolution, telles que les études de suivi de molécules uniques. La surface MICA est préparée en divisant un sandwich d’une seule feuille de MICA collée entre la lame de microscope en verre et la lamelle de recouvrement à l’aide d’un adhésif optique qui a exposé une surface de mica frais plate et extrêmement mince. En montant une petite chambre en plastique fabriquée à partir d’un flacon d’un millilitre et demi, le volume de vésicules lipidiques nécessaire à la formation de deux couches peut être aussi bas que 30 microlitres.

Dans un premier temps, prenez la feuille multicouche de MICA telle qu’elle provient du fournisseur et coupez-la avec des ciseaux en petits morceaux. Al foliole en deux ou trois folioles plus fines à l’aide d’une lame de couteau fraîche. Maintenant, nettoyez soigneusement la housse dort.

Cela implique de placer une couverture de 0,17 millimètre. Dormit dans un bocal d’entraînement en verre chaque couvercle. Dormez dans une fente séparée et injectez du détergent pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius.

Lavez la housse. Dort 10 à 20 fois avec de l’eau mini clé et sèche au sèche-cheveux avec un jet d’air ou d’azote. Prenez une lame de verre de microscope et nettoyez-la avec de l’endroit.

Une petite goutte d’environ 15 microlitres d’optique de faible viscosité sur le sablage du microscope et le globe auparavant. Coupez le dépliant sur une boîte à lumière UV pendant quelques minutes. Utilisez du scotch pour décoller quelques couches de mica.

Les premières couches seront fragmentées, alors faites-le jusqu’à ce que vous voyiez que les couches sont attachées au scotch. Les bandes sont uniformes et entières. Couvrez le ruban.

Placez une goutte d’adhésif optique à haute viscosité sur Micah Surface. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air là-bas. Placez doucement une couverture de sommeil propre sur la gouttelette offensante.

À l’aide d’une pince à épiler, tapotez doucement le verre pour étaler l’aile. Encore une fois, polymérisez l’adhésif avec de la lumière UV pendant quelques minutes. À l’aide d’un couteau, fendre le sandwich en verre.

Glissez MICA et couvrez le sommeil. Dans la plupart des cas, seule une très fine couche de MICA restera collée à la housse de sommeil. Utilisez un microscope à dissection pour inspecter votre surface MICA en faisant de petites rayures avec la pointe d’une aiguille ou d’une pince à épiler.

Vous pouvez facilement dire si la surface est en fait du mica, où la surface est uniformément rayée, comme ici ou sur l’adhésif optique, comme ici où la surface est brillante. Prenez une tasse d’un flacon en verre d’un millilitre et demi, retirez l’équarri de gaz et collez le capuchon sur la surface MICA à l’aide de vernis à ongles. Laissez sécher quelques minutes.

Maintenant, vous pouvez préparer une réparation lipidique bicouche lipide par couche en utilisant un protocole standard ici. Une goutte de 30 microlitres de vésicules lipidiques est placée dans la chambre du bouchon du flacon et sera incubée pendant 60 minutes avant de laver votre tampon. Après le lavage, l’échantillon est prêt pour l’imagerie.

Dans ce cas, il est monté dans un porte-échantillon sur mesure. Des molécules uniques peuvent être facilement observées sur une telle surface MICA préparée. Ici, nous comparons A-D-O-P-C par couche supportée sur verre et mica.

Notez que le type de mouvement diffère considérablement entre ces deux surfaces. Le trajet des molécules uniques tracé en couleurs dans les panneaux de droite montre clairement que le comportement de diffusion sur MICA diffère de celui sur le verre. Il n’y a cependant pas de différence significative dans la qualité de l’imagerie.

Le tissage moyen de la fonction droite à la moitié de l’intensité maximale pour 20 spots est presque le même pour les deux substrats, ce qui indique que la surface MICA est entièrement pénétrable par la lumière sans introduire d’aberrations optiques notables. Dans l’ensemble, les fiches signalétiques montrent une différence évidente dans le comportement de diffusion. Cependant, dans chaque cas, deux populations de particules diffusant à des vitesses différentes peuvent être observées.

Deux coefficients de diffusion différents, rapide et lent, ont été extraits de l’alimentation exponentielle double à la probabilité cumulative de déplacement carré. Pour cette bicouche DOPC, les deux composants de diffusion sont plus rapides à la surface du MICA, les particules lentes sur le MICA sont environ 10 à 20 fois plus lentes que les particules rapides. La population lente sur verre, cependant, est proche d’être immobile ici.

Nous avons montré que ce type de surface pourrait faire une différence dans le comportement de diffusion des bicouches lipidiques. Ainsi, il faut être prudent lorsque l’on compare les résultats entre des études sur des bicouches supportées sur différents substrats tels que MICA et les bicouches d’imagerie en verre sur MICA est généralement assez difficile en raison de la préparation compliquée que nous avons montrée, cependant, un moyen simple mais efficace de préparer des surfaces de cette haute qualité.