Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

L’objectif global de cette procédure est d’étudier le remodelage du système lysosomal final par des bactéries intracellulaires en utilisant des nanoparticules fluorescentes comme traceurs. Pour ce faire, il faut d’abord ensemencer des cellules heela dans une lame de chambre à huit puits et les incuber pendant la nuit. La deuxième étape consiste à infecter les cellules avec de la salmonelle et de la tarica.

Ensuite, un marquage par chasse d’impulsions des cellules hôtes infectées est effectué par incubation avec des nanoparticules d’or BSA Rumine. La dernière étape consiste à observer les altérations du système endosomal de la cellule hôte par microscopie confocale. En fin de compte, la quantification de la distribution intracellulaire des nanoparticules est effectuée à l’aide du progiciel MRS.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunomicroscopique, est que n cellules infectées sont analysées avec la méthode, peut fournir un aperçu du mode de vie intracellulaire de terica. Cependant, il peut également être appliqué à d’autres agents pathogènes intracellulaires tels que l’espèce Gaia, Ella Prolia ou mycobacterium tuberculosis. Il peut également être appliqué à d’autres types de cellules hôtes telles que le micro feh, les lignées cellulaires ou les cellules primaires.

La synthèse de nanoparticules d’or nanométriques ou NPS nécessite deux solutions solution solution A et solution B.To préparer la solution A, ajouter deux millilitres de chlorure d’or aqueux à 1 % dans 160 millilitres d’eau milli Q. Préparez la solution B en ajoutant huit millilitres de citrate trisodique dihydraté à 1 % et 160 microlitres d’acide tannique à 1 % dans 32 millilitres d’eau milli Q. Réchauffez les solutions A et B à 60 degrés Celsius, puis mélangez-les en remuant.

Une couleur bleu foncé doit être observée immédiatement après environ 15 minutes. La solution doit devenir rouge à ce stade. Chauffez la solution à 95 degrés Celsius.

Maintenez-le à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez la solution à température ambiante. Préparez la pièce dorée pour l’enrobage et l’étiquetage en ajoutant 900 microlitres de MPS doré dans un tube einor de 1,5 millilitre et en la centrifugant à 15 000 G pendant 30 minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 900 microlitres d’eau MQ stérilisée.

Ajoutez 100 microlitres de solution A BSA et mélangez sur un vortex à 800 tr/min pendant 30 minutes. Éliminer l’excès de BSA en centrifugeant la préparation à 15 000 Gs pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez en suspension l’or BSA NPS et 125 microlitres de PBS.

Ajouter 12,5 microlitres d’une molaire de bicarbonate. La solution d’ester de R domine n hydroxy CIN ou NHS est préparée dans du DMSO immédiatement avant. Utiliser à 15 microlitres de la solution R DOMINE N-H-S-D-M-S-O pour 0,5 millilitres de suspension d’or BSA NP.

Incuber la réaction pendant deux heures à température ambiante tout en mélangeant à 800 tr/min et en évitant l’exposition à la lumière. Ensuite, purifier l’or BSA rumine NPS par dialyse contre PBS à quatre degrés Celsius avec cinq changements de tampon sur une période de 36 à 48 heures après la purification, stabiliser le NPS en ajoutant 10 microlitres de B-S-A-P-B-S dans chaque millilitre d’or BSA RUMINE NPS pour retirer la centrifugeuse BSA Rumine libre ou libérée à 15, 000 GS pendant 16 minutes à quatre degrés Celsius. Resus suspend la pastille en deux milligrammes par millilitre de B-S-A-P-B-S après avoir mesuré la densité optique à 520 nanomètres ou OD cinq 20.

Stockez l’or BSA Rod Domine NPS à quatre degrés Celsius, en évitant l’exposition à la lumière, les cellules pour cette expérience expriment en permanence une protéine fluorescente verte marquée à glycoprotéine lysosomale lampe une GFP et sont cultivées dans DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone ensemencer les cellules à une densité de 50, 000 par puits dans une lame de chambre à huit puits et incuber pendant la nuit. La bactérie qui infecte les cellules hela est l’agent pathogène gastro-intestinal humain, la salmonelle et la tarica. À titre de comparaison, deux souches mutantes sont utilisées.

Les trois souches hébergent un plasmide pour l’expression constitutive de la GFP améliorée et sont cultivées dans un bouillon LB avec les antibiotiques appropriés pour maintenir les plasmides pour chaque souche. Inoculez une seule colonie de bactéries dans trois millilitres de bouillon LB avec l’antibiotique approprié et cultivez pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Dans des conditions d’agitation pour l’aération le lendemain, diluez chaque culture de un à 31 dans du bouillon LB frais et continuez à croître pendant trois heures et demie.

Pour commencer cette procédure, mesurez la DO 600 des bactéries de la sous-culture et diluez à une DO 600 de 0,2. Dans un millilitre de PBS, ajoutez des quantités appropriées de bactéries aux cellules hela dans la lame A 12 chamber pour obtenir une multiplicité d’infection de 100. Incuber pendant 30 minutes dans l’incubateur cellulaire.

Lavez les cellules hela trois fois avec du PBS pour éliminer les bactéries non internalisées. Ce point temporel est défini sur zéro heure après l’infection ou zéro heure pi. Ajoutez 300 microlitres de milieu de culture frais contenant 100 microgrammes par millilitre de gentamicine dans les cellules et maintenez pendant une heure.

Au bout d’une heure. Remplacez le milieu par un support d’imagerie contenant 10 microgrammes par millilitre de gentamicine. Ajouter de l’or BSA rumine NPS aux cellules hela pour obtenir une concentration finale de OD cinq 20 de 0,1.

Incuber pendant une heure après une heure. Retirez le milieu et lavez-le trois fois avec du PBS. Enfin, ajoutez 300 microlitres de support d’imagerie frais contenant 10 % de FCS et 10 microgrammes par millilitre de gentamicine.

Pour le reste du temps d’incubation, l’imagerie à haute résolution des cellules à différents points temporels est réalisée à l’aide d’un système d’imagerie confocale tel qu’un microscope confocal à balayage laser ou un microscope à disque rotatif avec une chambre à environnement humidifié, allumez le système de contrôle de la température et attendez qu’il soit stable. Optimisez les paramètres d’imagerie tels que le balayage par agrandissement, la résolution de la vitesse et la taille du pas Z. Utilisez les paramètres d’émission d’excitation appropriés pour la GFP et la BSA aurifère rumine NPS aux points de temps indiqués après l’infection.

Montez la lame A 12 contenant des cellules infectées sur la platine du microscope et enregistrez des images pour analyser les images et étudier le remodelage du système endosomal par la salmonelle intracellulaire. Utilisez un logiciel d’analyse d’images. Ouvrez les données en cliquant sur Ouvrir et en choisissant le fichier dans la barre d’outils des objets de la vue Surpass.

Cliquez sur l’icône pour ajouter un nouvel élément de surface. Pour analyser une région d’intérêt ou un retour sur investissement, sélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt, puis cliquez sur Suivant en tant que canal source. Sélectionnez le canal trois.

Cochez l’option de lissage pour configurer le lissage de la zone résultante. Définissez une valeur manuellement ou acceptez la valeur générée automatiquement. Pour seuil.

Sélectionnez l’option d’intensité absolue pour le réglage du seuil. Sélectionnez l’option manuelle et définissez une valeur dans la zone d’affichage. Un aperçu du seuil de surface s’affiche en gris.

Cliquez sur suivant dans l’onglet Classifie les surfaces. La surface résultante peut être filtrée selon différents critères. Un filtre par défaut est un nombre de trous en V supérieur à 10, d’autres filtres peuvent également être inclus en cliquant sur ajouter.

Dans cet exemple, le filtre par défaut est utilisé pour terminer la création de la surface. Cliquez sur terminer dans la liste des objets. Décochez la case du volume de l’article.

Une nouvelle surface créée est maintenant affichée dans la zone d’affichage. En rouge, exportez les statistiques dans un fichier Excel en cliquant sur Enregistrer. Les NPS d’or synthétisés par ce protocole étaient de forme quasi sphérique et d’une taille d’environ 10 nanomètres.

Le revêtement BSA et le marquage rho domine n’ont pas influencé leur morphologie ou leur taille. Étudier le remodelage du système endosomal cellulaire de l’hôte par la salmonelle intracellulaire. Les cellules Hela ont été faussement infectées ou infectées par des salmonelles de type sauvage ou deux souches mutantes et un pouls chassé avec de l’or de 10 nanomètres.

La tige de BSA domine n pois dans les cellules non infectées, le NPS uniformément distribué dans les endosomes tardifs ou les lysosomes. En revanche, les NPS dans les cellules infectées par des salmonelles de type sauvage ont été largement réarrangées huit heures après l’infection. Un réseau stabilisé de filaments ou de tamis induits par la salmonelle s’est formé, et la plupart des mp se sont accumulés dans les structures tubulaires.

Les souches mutantes ont présenté des comportements distincts huit heures après l’infection. La souche mutante SSAV était confinée à l’intérieur de la salmonelle contenant des VAE ou des SCV. Bien qu’aucun tamis n’ait été formé, la majorité des mps étaient toujours situés dans des endosomes tardifs libres ou des lysosomes pour le sif.

Une souche mutante de salmonelle s’est échappée dans le cytoplasme et aucune association entre les NPS et les bactéries n’a été observée. Lorsque l’accessibilité du système lysosomal final à diverses phases de l’infection à Salmonella a été examinée, les résultats montrent que dans tous les cas, la plupart des NPS internalisés se sont accumulés dans le SCV ou les SIFs suivant cette procédure. D’autres méthodes, transmission du cou microscopique peuvent être effectuées.

Cela pourrait répondre à d’autres questions telles que l’ultrastructure ou les compartiments membranaires dans certaines cellules hôtes nano-infectées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des nanoparticules fluorescentes. Ceux-ci peuvent être utilisés pour marquer les compartiments hôtes modifiés par la salmonelle intracellulaire.