Name: Larvaire interférence de lARN dans le rouge de la farine Beetle, Tribolium castaneum (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Apprenez l'interférence ARN larvaire pour l'étude des gènes chez Tribolium castaneum. Cette méthode d'injection d'ARN double brin permet un knockdown efficace et durable à tout stade du développement.

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Nous remercions le Centre de bio-informatique et génomique fonctionnelle (CBFG) à l&#39;Université de Miami pour le support technique. Ce travail a été soutenu par l&#39;Université de Miami subvention de démarrage (YT) et la National Science Foundation (YT: IOS 0950964).

<ol><li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li>
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<li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29+for+analyzing+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li>
<li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10(2008).</li>
<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431(2012).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li>
<li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li>
<li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutio.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Tribolium+castaneum%2C+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li>
<li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5(2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+WM+%22Systemic+RNAi+in+C+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%22">Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1</a>. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li>
<li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest%2C+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%2C+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+%28II%29+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

<html> Il ya un certain nombre de questions importantes qui doivent être pris en compte pour garantir le succès de l&#39;ARNi, dont la longueur et la concentration des molécules d&#39;ARN double brin, la concurrence entre les différentes molécules d&#39;ARN double brin (lors de la tentative multiples abattre), et la possibilité de hors-cible Effets (OTE). ARNdb Longueur La longueur des molécules d&#39;ARNdb affecte l&#39;efficacité de la réponse systémique ARNi, avec un ARN double brin plus long étant plus efficace pour déclencher l&#39;ARNi 7,14,15 (bien que la limite plus d&#39;ARNdb est actuellement inconnue). La longueur d&#39;ARNdb a besoin d&#39;être plus longue que 50 pb pour induire l&#39;ARNi efficace en T. castaneum 7. ARNdb de 150 pb et 500 pb semble être idéale pour des expériences d&#39;ARNi. Bien que plus des molécules d&#39;ARN double brin peuvent également être utilisés, ils auront une plus grande chance de l&#39;OTE et l&#39;étape de gène clonage va devenir de plus en plus difficile. ARN double brin Concentration ve_content &quot;&gt; Différents degrés de knock-down de gènes peuvent être obtenues en fonction de la concentration de l&#39;ARN double brin. 1 ug / apparaît ul à une concentration de départ raisonnable, ce qui produit souvent un phénotype quasi-nulle (peut varier selon le gène (s) d&#39;intérêt ). ARNi peut être effectuée avec une concentration plus élevée (par exemple, 7-8 ug / ul), pour obtenir un fort phénotype ARNi. ARNi avec une dilution en série de l&#39;ARN double brin peut parfois être intéressant de réaliser une série de phénotypes hypomorphic de données supplémentaires (Tomoyasu et al., 2009 8, et Borràs-Castells, données inédites). ARNi concurrence Knockdown de gènes multiples peut être réalisé en T. castaneum en injectant plusieurs molécules d&#39;ARN double brin différents simultanément. Cependant, il est également connu que la présence de plusieurs molécules d&#39;ARNdb différents présents au sein de l&#39;organisme se traduit souvent par la compétition entre les ARN double brin pour l&#39;accès aux composants d&#39;ARNi <sjusqu&#39;à&gt; 7,14. Il est important d&#39;utiliser la même longueur et la même concentration pour tous les ARN double brin lors d&#39;une tentative knockdown de gènes multiples pour éviter un ARN double brin hors-compétition les autres (bien que d&#39;autres ajustements de la longueur ARN double brin et la concentration peuvent être nécessaires lorsque les niveaux d&#39;expression varient beaucoup les gènes cibles). Nous, ainsi que d&#39;autres, avons effectué avec succès knockdown double et triple (par exemple, Tomoyasu et al., 2005 16, Tomoyasu et al., 2009 17, et Yang et al., 2009 18). Bien que possible, quadruple ARNi (ou plus) pourrait être difficile, car il risquerait vraisemblablement de causer une réduction significative de l&#39;efficacité ARNi pour les quatre gènes cibles. Off-ciblage OTE est une préoccupation inhérente aux approches basées sur l&#39;ARNi. Une façon de minimiser OTE est d&#39;identifier les régions dans le gène cible qui partagent des séquences similaires avec d&#39;autres gènes et d&#39;éviter ces régions lors de la conception d&#39;ARNdb. Une analyse BLAST simple contre le T. castaneum prédit ensemble des gènes peut identifier ces régions. Plusieurs outils en ligne permettent également l&#39;évaluation du potentiel OTE (par exemple, E-ARNi 19). Exécution de l&#39;ARNi pour deux régions non chevauchantes du gène cible est un moyen facile et efficace pour éliminer la possibilité que les phénotypes observés sont causés par l&#39;OTE. La possibilité de l&#39;OTE est minimisé si l&#39;ARNi pour deux régions ne se chevauchent pas produire les mêmes phénotypes (à moins que les deux régions ne se chevauchent pas partager une séquence similaire). L&#39;évaluation de gène démontable par un moyen autre que les analyses phénotypique est souvent essentiel à des données liées à l&#39;ARNi effectivement présents. Deux principales façons d&#39;évaluer knockdown de gènes sont qRT-PCR et l&#39;analyse Western blot. qRT-PCR est un moyen commode pour mesurer le niveau de l&#39;ARNm cible, et a été utilisé dans de nombreuses études liées ARNi, y compris ceux de T. castaneum (voir Miller et al. 2012 7 par exemple). Howeveuh, il faut être prudent, comme nous l&#39;avons vu récemment des cas où le niveau d&#39;ARNm cible est régulée à la hausse par l&#39;ARNi (si le produit de protéine est régulée à la baisse) (Borràs-Castells données non publiées). Il est actuellement inconnu si cet ARNm ARNi induit une régulation peut être généralisée ou unique de certains gènes. L&#39;analyse Western blot est une autre façon de confirmer knockdown de gènes. Cette méthode est très fiable car il mesure la quantité du produit de la protéine finale. L&#39;exigence d&#39;un anticorps spécifique contre la protéine produite par le gène cible est un inconvénient de cette approche. Utilisation de plusieurs mesures indépendantes en plus à l&#39;analyse phénotypique augmentera la confiance des données phénotypiques obtenues par l&#39;analyse basée sur l&#39;ARNi. Depuis sa création en T. castaneum, l&#39;ARNi a principalement été utilisée pour étudier la fonction des gènes dans le développement et la formation de structures. Ces T. études sur le développement castaneum ont très bien réussi à caracterizing fonctions évolutives conservées et ont divergé de gènes (revue dans Denell 2008 1 et Klingler 2004 2). Études basées ARNi Cependant, dans T. castaneum ne sont pas limités à la biologie du développement. Par exemple, l&#39;ARNi peut être utilisée pour étudier la fonction des gènes dans un large éventail de réponses physiologiques et comportementales, y compris la tolérance au stress, la prédation, l&#39;agression, le choix du partenaire, les modèles d&#39;activité, et les mécanismes de défense. Une difficulté d&#39;appliquer l&#39;ARNi à ces contextes est la probabilité d&#39;effets pléiotropiques. Souvent, les gènes d&#39;intérêt ont une variété de fonctions à travers le T. Cycle de vie du castaneum, permettant ainsi la suppression des gènes sans effets phénotypiques involontaires difficiles. Cependant, la possibilité d&#39;effectuer facilement ARNi à des stades différents peut souvent être une stratégie efficace pour éviter ces effets pléiotropiques. Par exemple, effectuer l&#39;ARNi chez les adultes au lieu de larves ou de pupes pourrait nous permettre de contourner UNINtendance létalité provoquée par knockdown de gènes au cours du développement précoce. La flexibilité de la réponse d&#39;ARNi dans T. castaneum ce qui rendait ce modèle un choix attrayant pour adapter l&#39;ARNi à des expériences de la fonction des gènes dans les réponses physiologiques et comportementales. Le T. système de castaneum est également idéal pour une utilisation dans un laboratoire d&#39;enseignement. T. castaneum peut être facilement mis en culture sur un mélange de farine / levure à température ambiante (25 ° C) sans repiquage fréquentes, et des techniques d&#39;ARNi dans T. castaneum sont suffisamment simples pour être adapté à un laboratoire avec des jeunes, des scientifiques d&#39;apprentissage. Comme ARNi devient une technique essentielle dans une variété de domaines de la biologie, il est essentiel que les élèves sont exposés à cette technique. La nature straight-forward de la technique ARNi larvaire dans T. castaneum encourage également davantage d&#39;élèves à être impliqués dans la recherche, ce qui rend T. castaneum un candidat de choix pour une salle de classe orientée système génétique. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum, gagne en popularité dans divers domaines de la biologie en partie à cause de la facilité d&#39;effectuer l&#39;interférence ARN (ARNi) 1-3. Techniques de gènes knockdown base ARNi permettent aux scientifiques d&#39;effectuer perte de fonction analyse sans utiliser des méthodes génétiques complexes. T. castaneum montrer une réponse de RNAi systémique robuste, ce qui permet d&#39;effectuer l&#39;ARNi à tout moment par simple injection d&#39;ARN double brin (ARNdb) dans une cavité du corps de l&#39;insecte 4-6. Knockdown simultanée de plusieurs gènes est également possible en T. castaneum par injection de deux ou plusieurs molécules d&#39;ARN double brin différents dans le même temps 7,8. En outre, une série de phénotypes hypomorphic peut être généré par réduction de la concentration d&#39;ARNdb injecté 8. Ces caractéristiques font de techniques de génétique inverse à base ARNi des alternatives intéressantes à la génétique à terme traditionnels en T. castaneum. Comme la quasi-tout T. castaneum tissus sont sensibles à des molécules d&#39;ARNdb extracellulaires 9, cette technique permet aux chercheurs d&#39;étudier un grand nombre de tissus dans divers contextes. En outre, bien que ce rapport met l&#39;accent sur ​​l&#39;exécution de l&#39;ARNi dans T. castaneum, de nombreuses procédures décrites ici sont applicables à d&#39;autres insectes. Par conséquent, ce protocole est utile pour ceux qui souhaitent effectuer perte de fonction des analyses dans leur contexte d&#39;intérêt en T. castaneum, ainsi que pour les chercheurs qui souhaitent appliquer une technique basée sur l&#39;ARNi à d&#39;autres insectes. L&#39;injection de l&#39;ARN double brin dans les larves permet l&#39;analyse fonctionnelle à des stades différents de la vie de scarabée, dont la larve, et met en scène des adultes 4,5,10. Nous avons précédemment rapporté notre protocole de RNAi larvaire global, y compris les procédures de biologie moléculaire 11. Dans le présent rapport, nous nous concentrons sur la description des procédures d&#39;injection d&#39;ARN double brin, qui sont les mieux expliquées avec des aides visuelles. Nous fournissonsprocédures détaillées étape par étape injection ainsi que des exemples de bonnes et de mauvaises injection. Ce protocole visuelle complète notre protocole précédent, et lorsqu&#39;ils sont combinés, ils fournissent une vue plus complète des procédures ARNi larvaires dans T. castaneum. En outre, nous discutons de paramètres pour les molécules d&#39;ARN double brin qui pourraient affecter le succès de l&#39;ARNi, l&#39;application de tests basés sur l&#39;ARNi pour la recherche en physiologie, ainsi que l&#39;applicabilité du protocole d&#39;ARNi larvaire dans un laboratoire d&#39;enseignement.

<table><tbody><tr><td>Farine de blé entier biologique&nbsp ;</td><td>Heartland Mill Inc. Kansas</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>Brewer' s levure</td><td>MP Biomedicals</td><td>2903312</td><td>Tamiser la levure avec le tamis en acier inoxydable #35 avant utilisation. Portez un masque de protection et couvrez le tamis d’une pellicule plastique, car la levure tamisée est une particule fine et un danger respiratoire.</td></tr><tr><td>6 oz en plastique Drosophila bouteilles en stock</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-888</td><td></td></tr><tr><td>Tamis</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>04-881N</td><td>8 po de diamètre x 2 po D. Utilisation #25 (Ouverture nominale 710 &micro ; m) pour les larves, les pupes et les adultes.</td></tr><tr><td>Tamis</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>04 881 10P</td><td>8 po. diamètre #35 (Ouverture nominale : 600 &micro ; m)&nbsp ; Tamis en acier inoxydable, 8 po. dia. x 2 po.D. Ce tamis est idéal pour éliminer les grumeaux de la poudre de levure.</td></tr><tr><td>Récepteur de tamis</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>04-866B</td><td>Bac</td></tr><tr><td>d’échantillonnage à bec de 8 po de diamètre 1,5 pinte&nbsp ;</td><td>Équipement Seedburo Co.</td><td>Modèle 33</td><td>bac de collecte</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>BioCold Environmental Inc</td><td>BC26-IN</td><td>Gardez-le 30 &deg ; C avec 70 % d’humidité.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>S374500</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Colorant alimentaire&nbsp ;</td><td>Kroger</td><td></td><td>verte, bleue ou rouge de préférence</td></tr><tr><td>Lame de verre de microscope.</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Tack-It Over& Sur</td> la colle repositionnable <td>d’Aleene pour les diapositives</td><td></td><td>collantes. Le ruban adhésif double face peut être utilisé comme alternative, cependant, nous avons constaté que l’adhérence varie.</td></tr><tr><td>Boîtier CD en plastique</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boroslilicate verre capillaire</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-15</td><td>D.E. 1 mm, D.I. 0,5 mm, 15 cm. Sans filament</td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-87 ou P-97&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Mastic de montage amovible&nbsp ;</td><td>Loctite Fun-Tak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plumeau à gaz comprimé</td><td>OfficeMax</td><td>OM96091</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>11231-30</td><td>Dumoxel #3 (pour manipuler les coléoptères)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science</td><td>Tool 11252-20</td><td>INOX #5 (pour casser les pointes d’aiguille)</td></tr><tr><td>Éther éthylique, anhydre&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Maille de nylon</td><td>Flystuff/Genessee Scientific</td><td>57-102</td><td>120 &micro ; </td></tr><tr><td>Flacon de média, 100 ml</td><td>VWR</td><td>89000-926</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V12. Microscope à injection.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Fisher/Zeiss</td><td>12-070-513&nbsp ;</td><td>Stemi2000. Utilisez-le pour casser l’aiguille et placer les larves sur la lame collante.</td></tr><tr><td>Platine mécanique X-Y&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>4354600000000000</td><td></td></tr><tr><td>Platine mécanique X-Y&nbsp ;</td><td>Microscopenet.com</td><td>A512</td><td>Manipulateur alternatif bon marché</td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Narishige</td><td>GJ-1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Support capillaire en verre</td><td>Narishige</td><td>IM-H1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Seringue jetable 30 ml</td><td>Seringue BD</td><td>309650</td><td>BD Luer-Lok</td></tr><tr><td>Tip Robinet d’arrêt à quatre voies&nbsp ;</td><td>Cole-Parmer Instrument Co.</td><td>EW-30600-03</td><td>Robinets d’arrêt avec raccords Luer ; 4 voies ; glissement mâle</td></tr><tr><td>Pinceau Art</td><td></td><td>Pinceau à huile et acrylique Amazon Art Advantage Ensemble de pinceaux à huile et acrylique, 24 pièces</td><td>N’importe quel pinceau général fera l’affaire.</td></tr></tbody></table>

larvaire interférence de l'arn dans le rouge de la farine beetle, tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum, propose un répertoire d&#39;outils expérimentaux pour les études génétiques et de développement, y compris une séquence entièrement annotée du génome, transgénèse à base de transposons, et l&#39;interférence ARN efficace (ARNi). Parmi ces avantages, les techniques de gènes knockdown basés sur l&#39;ARNi sont au cœur de la recherche Tribolium. T. castaneum montrer une réponse de RNAi systémique robuste, ce qui permet d&#39;effectuer l&#39;ARNi à n&#39;importe quelle étape de la vie par simple injection de l&#39;ARN double brin (ARNdb) dans une cavité du corps de l&#39;insecte. Dans ce rapport, nous présentons un aperçu de notre technique ARNi larvaire dans T. castaneum. Le protocole comprend: (i) l&#39;isolement de la phase appropriée de T. larves de castaneum pour injection, (ii) la préparation pour le réglage de l&#39;injection, et (iii) l&#39;injection de l&#39;ARN double brin. Larvaire ARNi est une technique simple, mais puissant qui nous permet d&#39;accéder rapidement à phenotyp perte de fonctiones, dont plusieurs phénotypes knockdown de gènes ainsi que d&#39;une série de phénotypes hypomorphic. Comme pratiquement tous les T. tissus castaneum sont sensibles à extracellulaire ARN double brin, la technique ARNi larvaire permet aux chercheurs d&#39;étudier une grande variété de tissus dans divers contextes, y compris la base génétique des réponses organismales à l&#39;environnement extérieur. En outre, la simplicité de cette technique stimule plus la participation des étudiants à la recherche, ce qui rend T. castaneum un système génétique idéal pour une utilisation dans une salle de classe.

Une des étapes clés pour l'injection réussie est de faire une bonne aiguille. Comme décrit dans l'étape 6, la pointe de l'aiguille doit être cassé avant l'injection de T. castaneum. Des exemples de bonnes et de mauvaises aiguilles sont présentés dans la figure 1. Une bonne aiguille a une pointe acérée et rigide, avec un diamètre d'ouverture d'environ 0,05 mm (figure 1B). La figure 2 présente une injection réussie (Figures 2A et 2B), ainsi que plusieurs cas d'injections infructueuses (figures 2C-2F). Avec une aiguille d'injection de taille appropriée, la pointe de l'aiguille pénètre dans la cuticule des larves avec une résistance minimale (figure 2A), et la solution d'ARNdb (vert) s'écoule dans les larves sans fuite (figure 2B). Ne pas sur injection, car il provoquer un débordement de la solution ARNdb même avec une aiguille d'injection de taille appropriée (Figure2C). Si la pointe de l'aiguille est trop mince, la pointe de l'aiguille échoue souvent à pénétrer la cuticule et coudes larvaire, ce qui rend difficile l'injection (figure 2D). Si cela se produit, tailler la pointe de l'aiguille est parfois utile. Les aiguilles sont souvent encore utilisables, mais avec quelques difficultés à pénétrer la cuticule larvaire (figure 2E). Cependant, une grande quantité de la solution ARNdb est facilement poussée hors de l'aiguille même avec une légère pression sur la seringue d'injection, ce qui entraîne souvent un trop-plein de la solution d'ARNdb (figure 2F). Lors de l'ARNi, il est important d'avoir un contrôle positif pour déterminer que l'ARNi fonctionne correctement, et un témoin négatif pour vérifier que l'effet observé n'est pas un effet non spécifique de l'ARN double brin ou une suite de procédures d'injection (tels que le dommage causé par injection, ou une anomalie de etherisation). L'injection d'ARNdb ciblant EYFP peut servir d'bon contrôle positif lors de l'utilisation de la pu-11 souche 5,7. Lorsque EYFP ARNdb est injecté dans le dernier stade larvaire, une réduction significative de signal de EYFP dans les futures primordia des ailes peut être observée dès une post-injection de jours (Figure 3A). Le knockdown de EYFP est terminée deux jours après l'injection de l'ARN double brin EYFP (figure 3B) et ce knockdown persiste à travers le stade de pupe (figures 3C et 3D) et tout au long de la vie de l'insecte si la concentration ARNdb est suffisamment élevée (par exemple 1 ug / ul) 7. EYFP ARNdb peut également être utilisé en tant que contrôle négatif comme il s'agit d'une séquence d'un gène non endogène et ne doit pas provoquer des perturbations morphologiques et physiologiques (figures 3A-3D). Nous avons fourni des images de larves ARNi pour résiduelle (VG), un gène de l'aile critique 12, comme un autre exemple de la façon efcaces cette technique ARNi basée injection est en T. castaneum. Lorsque l'ARN double brin pour vg est injecté dans les larves de avant-dernière étape (une étape avant le dernier stade larvaire), une perte complète des structures d'ailes peut être observée au stade de pupe (figures 3E et 3F). L'adulte résultant manque aussi complètement des structures d'ailes (figures 3G et 3H). Le résultat ARNi pour vg illustre à la fois la robustesse et la nature systémique de l'ARNi dans T. castaneum. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500"> Figure 1: (A) Exemples d'aiguilles non brisées, bonnes et mauvaises (B) La pointe d'une bonne aiguille bien cassé (C) La pointe d'une aiguille brisée qui est trop grand et pointu (D) La pointe... d'une faillite aiguille de n qui est trop mince. Les barres d'échelle (rouge) sont de 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500"> Figure 2:... (A) une aiguille d'injection de taille appropriée insérée dans le dernier stade larvaire (B) Larve injecté de manière appropriée avec la solution vert ARNdb (C) de débordement de la solution de l'ARN double brin au niveau du point causée par la sur-injection injection (D ) d'une aiguille fine pour ne pas pénétrer dans la cuticule des larves. (E) Une grande aiguille d'injection insérée dans le dernier stade larvaire. (F) Larve injecté avec une aiguille, entraînant le débordement et la fuite de la solution d'ARNdb. Les flèches indiquent les aiguilles.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "&gt; S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500"> Figure 3: Exemples de réussite ARNi dans T. castaneum. (AD) Dernière injection larvaire des résultats EYFP ARN double brin dans une réduction de l'expression de EYFP. (A) Les larves un jour après l'injection. (B) Les larves deux jours après l'injection. (C) pupes de contrôle. (D) chrysalides résultant de injection larvaire EYFP ARN double brin. Les témoins négatifs sont l'injection de la mémoire tampon (A, B) et l'introduction d'ARNdb DsRed (C, D). Pointes de flèches et des flèches indiquent l'expression de EYFP ou son absence dans les ébauches et les yeux aile, respectivement. (EH) Penultime larvaire ARNi pour vg. (E) de type sauvage chrysalide. (F) vg ARNi chrysalide. Le manque de structures d'ailes est déjà visible au stade de pupe (flèche). G) de type sauvage adulte. (H) vg ARNi adulte. structures d'ailes liées sont complètement absentes (flèche). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

l&#39;interférence ARN (ARNi) techniques de gènes knockdown-based sont au cœur de la recherche Tribolium. Ici, nous donnons un aperçu de notre technique ARNi larvaire dans Tribolium castaneum. Larvaire ARNi est une technique simple, mais puissant qui permet d&#39;accéder rapidement à des phénotypes perte de fonction, ce qui permet aux chercheurs d&#39;étudier les fonctions des gènes dans divers contextes.

Larvaire interférence de l'ARN dans le rouge de la farine Beetle, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

L’objectif global de cette procédure est d’éliminer un gène d’intérêt par interférence ARN dans le trium cadium du coléoptère à fleurs rouges en injectant une solution d’ARN double brin dans la cavité du corps larvaire. Pour ce faire, il suffit d’isoler d’abord le stade approprié des larves de la culture en tamisant la fleur de culture et en séparant les larves des autres stades des coléoptères sur un bac à graines. La deuxième étape consiste à préparer une aiguille d’injection en cassant la pointe de l’aiguille, en la plaçant sur un porte-aiguille et en chargeant frontalement une solution d’ARN double brin de la concentration souhaitée dans l’aiguille.Ensuite, autorisez les larves isolées et placez-les sur une lame de verre collant. La dernière étape consiste à injecter aux larves une solution d’ARN double brin sous un microscope à dissection. En fin de compte, les phénotypes liés à l’ARNi au stade souhaité sont analysés pour déterminer la fonction du gène ciblé.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la neurogenèse ou la transgenèse, est qu’une simple injection d’une solution d’ARN double brin dans la cavité corporelle du coléoptère peut induire une inactivation efficace et durable des gènes à n’importe quel stade souhaité du développement du bedo. Bien que le protocole décrit ici se concentre sur les larves de trium castin avec quelques modifications, les procédures d’injection peuvent être appliquées à d’autres stades de trium, de castin et d’autres insectes. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à fabriquer une bonne aiguille et à injecter la quantité appropriée de solution d’ARN double brin sans tuer les larves.La démonstration visuelle de cette technique est essentielle car les étapes d’injection d’ARN double brin et de préparation de l’aiguille sont difficiles à décrire et ne peuvent être apprises que par l’observation et la pratique. La souche de thé de choix comme détaillé dans le protocole de texte ci-joint. Videz immédiatement une bouteille de culture des coléoptères sur un tamis numéro 25 et tamisez agressivement pour recueillir les larves plus âgées, les pupi et les adultes.Transférez ensuite les coléoptères avec exus dans un bac à graines en tapotant pour empêcher les coléoptères de s’échapper. Maintenant, soufflez doucement sur le bac à graines pour retirer l’exus et les particules de fleur de la surface des coléoptères. Tapotez le bac à graines pour déposer.Le contenu. Attendez que les adultes les plus mobiles sortent du tas et retirez-les pour séparer l’angle des pupi, la casserole légèrement vers le bas. Frappez doucement pour rouler et retirer les pupi, en ne laissant que les larves sur le bac à graines.Placez maintenant les larves isolées dans une boîte de Pétri propre. Sélectionnez le stade larvaire souhaité pour l’injection au microscope et conservez-les dans une boîte de Pétri jusqu’à l’autorisation. Combinez les stades restants des coléoptères et remettez-les dans une bouteille de culture.Fixez une aiguille de verre tirée sur un microscope en verre. Diapositive sous un microscope à dissection. Localisez l’endroit où la pointe se plie.Saisissez légèrement la zone vers le côté de la pointe et tournez-la pour la casser pour une pénétration optimale de la cuticule larvaire, sélectionnez une aiguille avec une ouverture inclinée d’environ 0,05 millimètre de diamètre. Dévissez maintenant la pointe du porte-aiguille. Placez l’extrémité arrière de l’aiguille dans la pointe du support et le joint en caoutchouc sous la pointe du support.Insérez ensuite l’arrière de l’aiguille dans le support, en vous assurant que le joint en caoutchouc est inséré dans l’ouverture. Revissez l’embout sur le support. Placez maintenant le porte-aiguille assemblé sur le manipulateur d’aiguille.Ajustez la position de manière à ce que la pointe de l’aiguille soit centrée sous le champ de vision du microscope. Préparez la solution d’ARN double brin juste avant l’injection. Coupez l’embout d’une pointe de pipette jetable de 20 microlitres.Maintenant, pipetez 10 microlitres de la solution dans la pointe de pipette coupée. Retirez délicatement la pointe de la pipette tout en maintenant le fluide à la pointe en fournissant une contre-pression. Placez la pointe de la pipette avec la solution d’ARN double brin sur la platine du microscope.En regardant à travers le microscope, déplacez lentement la pointe chargée vers l’aiguille jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille se trouve juste à l’intérieur de la pointe de la pipette chargée et dans la solution. Ensuite, tirez doucement sur le piston de la seringue d’injection pour aspirer lentement la solution dans l’aiguille sans surcharger l’aiguille. Lorsque l’extrémité de la solution d’ARN SD s’approche de la pointe de l’aiguille, ralentissez le rythme de traction et arrêtez de charger la solution avant que la pointe de l’aiguille n’atteigne l’air pour éviter une absorption rapide dans le porte-aiguille.Ouvrez le robinet d’arrêt pour éliminer la pression de la seringue d’injection et du porte-aiguille. Éloignez ensuite la pointe de la pipette de la pointe de l’aiguille. Soulevez maintenant l’aiguille vers le haut de la platine et retirez la pointe de pipette vide de la platine du microscope.Placez les larves dans le panier d’autorisation, puis placez le panier dans la bouteille d’éther et fermez le couvercle. Après trois minutes, vérifiez que les larves ne bougent pas. S’ils sont toujours en mouvement, remettez-les dans la bouteille d’éther pendant encore 30 secondes.Transférez les larves autorisées E du panier sur le bord antiadhésif d’une lame de verre collante. Transférez les larves séquentiellement sur la lame. Posez chacun latéralement.Tapotez doucement le corps de la tête à la queue avec une pince et étirez-le légèrement pour fixer les larves sur le toboggan. Positionnez maintenant la lame préparée sur la platine du microscope. Insérez doucement l’aiguille chargée d’ARN double brin dans la face dorsale des larves, en utilisant la platine pour déplacer les larves vers l’aiguille.Tirez ensuite légèrement l’aiguille vers l’arrière pour l’ARN DS. Pour pénétrer dans la cavité corporelle de la larve, appuyez doucement sur la seringue d’injection jusqu’à ce que les larves deviennent vertes et aient l’air étirées et pleines. Ensuite, retirez l’aiguille des larves tout en tirant légèrement sur la seringue d’injection.Injectez toutes les larves sur la lame. Assurez-vous d’éliminer les larves qui n’ont pas été injectées avec succès. Mettez les larves injectées de côté jusqu’à ce que toutes les larves se rétablissent de l’autorisation E.Maintenant, soulevez doucement les larves de la tête à la queue, transférez-les dans une boîte de Pétri propre et laissez-les au moins 10 minutes pour permettre à la plaie d’injection de coaguler. Puis culture, les larves injectées à 30 degrés Celsius avec 70 % d’humidité. Observez régulièrement les larves pour les phénotypes ARN.Ces exemples montrent des niveaux de succès variables d’injections avec une solution d’ARN double brin vert dans la larve du dernier stade avec une aiguille d’injection de taille appropriée. La pointe de l’aiguille pénètre dans la cuticule de la larve avec une résistance minimale, et la solution verte d’ARN DS s’écoule dans les larves sans aucune fuite. Dans la souche PU 11, la protéine fluorescente jaune améliorée peut servir de bon contrôle positif pour les expériences d’injection d’ARN double brin.Lorsque l’ARN DS de l’EYFP est injecté au dernier stade larvaire, une réduction significative du signal EYFP dans l’aile primordiale future peut être observée dès un jour après l’injection. L’inhibition de l’expression d’EYFP est généralement observable deux jours après l’injection, et si la concentration d’ARN SD est suffisamment élevée, elle persistera tout au long du stade pupillaire et tout au long de la vie du coléoptère. Étant donné que l’EYFP est une séquence génétique non endogène, ce gène peut également être utilisé comme contrôle négatif qui ne devrait pas provoquer de perturbations morphologiques ou physiologiques.Dans cette expérience, l’ARN double brin pour le vestigial, un gène critique de l’aile, a été injecté dans des larves de l’avant-dernier stade. Notez qu’une perte complète des structures de l’aile peut être observée au stade de la pupille. L’adulte qui en résulte est également complètement dépourvu de structures alaires.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures si elle est exécutée correctement Suite à cette procédure. D’autres méthodes telles que la PCR quantitative en temps réel, l’hybridation in situ ou l’immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que quels gènes sont régulés par le gène ciblé après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour effectuer une analyse de perte de fonction et des stades post-embryonnaires dans le traum casten sans utiliser de techniques génétiques complexes.La nature simple de cette méthode la rend également très applicable dans un cadre d’enseignement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sélectionner le stade approprié de l’amour pour l’injection, comment fabriquer une aiguille d’injection et effectuer avec succès l’injection autorisée d’ARN double standard. Ce protocole vous permettra d’évaluer la fonction du gène par le niveau RNI dans Trium.

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