Coloration histologique du tissu neural

Histological Staining of Neural Tissue

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Neuroscience

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Histological Staining of Neural Tissue

1.5: Rodent Stereotaxic Surgery

1.15: An Introduction to Developmental Neurobiology

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08:55 min

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April 30, 2023

Overview

En vue d’examiner la disposition cellulaire, structurelle et moléculaire des tissus et organes, les chercheurs utilisent une méthode appelée coloration histologique. Dans cette technique, un tissu d’intérêt est préservé en utilisant des produits chimiques fixatifs et ensuite sectionné, ou découpé en tranches très fines. Une variété de techniques de coloration est alors appliquée pour fournir un contraste aux sections visuellement uniformes. Dans l’étude de neuroanatomie, les techniques histologiques sont fréquemment appliquées pour visualiser et étudier les tissus du système nerveux.

Cette vidéo se focalise sur les techniques de coloration histologique pour les tissus neuronaux. Une vue d’ensemble des méthodes habituelles de coloration est fournie, incluant celles qui marquent spécifiquement les corps de cellules neuronales, comme la coloration de Nissl, et celles qui mettent en évidence de manière sélective les axones myélinisés, comme la coloration au Bleu Luxol rapide. Les techniques immunohistologiques, qui profitent de l’interaction spécifique entre les anticorps et les protéines cellulaires uniques, sont aussi présentées. Ensuite, la préparation des échantillons de cerveau pour la coloration est décrite, incluant les étapes basiques de fixation, d’intégration, de découpe et de réhydratation des tissus. La présentation fournit aussi une procédure pas à pas pour la coloration immunohistologique suivie par une coloration de Nissl, en plus d’utilisations pratiques de ces techniques.

Procedure

Les tranches, ou sections de tissus du cerveau sont une ressource riche pour étudier sa structure et son fonctionnement. Cependant, un cerveau non traité est un tissu visuellement uniforme, comme un canevas blanc. Le colorer est un moyen de « peindre » le cerveau pour visualiser clairement les composants cellulaires, structurels et moléculaires de l’organe. Bien que la plupart des colorants partagent des méthodes histologiques communes, chaque approche a une cible morphologique unique. Cette vidéo fournit une esquisse des principes généraux de l’histologie du cerveau, démontre des techniques communes de coloration et passe en revue quelques utilisations de ces méthodes dans les labos de neuroscience aujourd’hui.

Avant de présenter comment les procédures de coloration neurologique sont mises en œuvre, decrivons les objectifs de cette technique.

Les colorants histologiques sont communément utilisés pour créer un contraste, révélant ainsi les caractéristiques qui ne peuvent être distinguées dans des tissus non colorés. Par exemple, pour visualiser les corps cellulaires du neurone, ou soma, qui constituent la matière grise du système nerveux, de nombreux colorants sont disponibles. Les encres utilisées dans la coloration de Nissl s’attachent aux acides nucléiques, colorant le soma en violet et révélant l’organisation neuronale.

Alternativement, pour observer la matière blanche, vous pouvez teindre la myéline – l’acide gras enrobant les axones – avec des colorants comme le Bleu Luxol rapide. Une autre option est la coloration immunohistochimique qui peut mettre en évidence des cibles moléculaires trouvées sur des types spécifiques de cellules. Cette technique profite de la spécificité entre les anticorps et les cibles moléculaires appelées antigènes. L’utilisation d’anticorps fusionnés à des enzymes ou des composés fluorescents permet aux chercheurs de visualiser leurs sites de liaison en utilisant les réactions enzymatiques ou fluorescentes.

Maintenant que vous avez une idée de ce qu’est la coloration de sections, regardons les étapes histologiques habituelles qui précèdent la coloration des tissus et garantissent des conditions optimales pour la visualisation.

Pour préserver la structure du tissu, le cerveau est d’abord perfusé – c’est-à-dire que le sang est drainé hors du cerveau et le réseau vasculaire de l’animal est utilisé pour livrer une substance chimique fixative. Après dissection, le cerveau est totalement immergé dans un fixatif pour compléter le processus de conservation.

Ensuite, le prélèvement est intégré dans un milieu aux propriétés mécaniques similaires, comme la cire de paraffine. Après l’intégration, le cerveau est finement tranché en utilisant un microtome. Les tranches sont ensuite mises sur une plaque et laissées à sécher.

Vu que la plupart des colorants sont à base d’eau, le tissu a besoin d’être dé-ciré et réhydraté avant d’être coloré. Pour réaliser cela, les tranches sont rincées dans du xylène pour dissoudre la cire avant d’être réhydratées graduellement dans des bains d’éthanol de plus en plus dilués. Ce procédé devrait être mis en œuvre sous hotte tout en portant l’équipement de protection individuel approprié.

Une fois vos tissus de cerveau préparés, vous êtes maintenant prêts pour commencer la procédure de coloration.

La première étape, appelée blocage, réduit la coloration de fond provoquée par les liaisons non spécifiques d’anticorps. L’exposition de la tranche au sérum aura cet effet via l’introduction d’anticorps non labélisés qui se lient à des sites non cibles. Après un blocage allant de 30 minutes à toute la nuit, le tissu est prêt pour incubation avec l’anticorps primaire, qui se lie à des cibles moléculaires spécifiques.

Les anticorps sont habituellement dilués dans une solution de blocage contenant du détergent, ce qui perturbe les membranes cellulaires et permet aux anticorps d’entrer dans le cytoplasme.

Après une incubation au cours de la nuit, les anticorps primaires en excès sont retirés par un lavage bref en solution tampon. Ensuite, les anticorps secondaires, conjugués à des enzymes ou des fluorophores, sont introduits pour étiqueter spécifiquement les anticorps primaires. Plusieurs heures plus tard, les anticorps en excès sont retirés avec de multiples changements de tampon.

Maintenant que les cibles ont été étiquetées, voyons comment les détecter. Pour les anticorps secondaires conjugués aux enzymes, ceci est réalisé par l’introduction d’un substrat chromogénique. Lorsque le substrat interagit avec l’enzyme, un changement de couleur se produit, d’où le nom « chromogénique ». Une fois que la coloration désirée est réalisée, typiquement après 2 minutes, la réaction est arrêtée en immergeant rapidement les tranches dans l’eau.

Après la coloration de l’anticorps, une deuxième étape peut être nécessaire pour fournir un contexte neuroanatomique aux résultats. Par exemple, vous pouvez choisir d’améliorer le contraste en utilisant un colorant de Nissl. Cette procédure repose sur des colorants de base comme le violet de crésyle, qui interagit avec les acides nucléiques.

La première étape est de filtrer la solution colorante pour retirer les cristaux non dissouts. Les tranches sont ensuite incubées dans le colorant jusqu’à ce que le contraste désiré soit atteint. Ensuite, lavez les tranches dans de l’eau renouvelée plusieurs fois pour arrêter la coloration.

Les tranches sont alors immergées dans une série d’alcools pour enlever l’excès de colorant et déshydrater les tranches. Après déshydratation, les tranches sont nettoyées au xylène, ce qui retire l’alcool et améliore l’imagerie car il a des propriétés de diffraction similaires à celles du tissu.

Pour préserver les sections teintes en vue de les analyser plus tard, couvrez les avec un média de montage permanent et laissez sécher au cours de la nuit.

Maintenant que nous avons exposé les procédures et les buts de la coloration, decrivons quelques utilisations.

Tout d’abord, la coloration histologique est habituellement utilisée pour visualiser les neurones individuels. A son tour, la visualisation est requise pour les techniques comme la microdissection au laser, dans laquelle les chercheurs utilisent un laser pour isoler des cellules spécifiques cultivées sur un film mince. Le matériel génétique peut être extrait depuis les cellules teintes et disséquées, permettant aux chercheurs d’étudier l’expression de gènes spécifiques au neurone.

La coloration peut aussi être employée pour caractériser les particularités morphologiques des neurones individuels. Dans cette expérience, une immunohistochimie est réalisée sur des cellules exprimant du GFP pour visualiser les dendrites des synapses en formation. La coloration est comparée entre les cellules normales et celles activées, révélant que les dendrites subissent de multiples changements en réponse aux stimuli d’activation.

Enfin, grâce à la spécificité de l’IHC, l’expression de protéines individuelles peut être utilisée pour identifier la localisation et l’identité des populations de cellules uniques dans le système nerveux. Par exemple, la coloration du cervelet de la souris avec des anticorps Zebrin-2 révèle la localisation de neurones spécialisés appelés cellules de Purkinje.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE sur la coloration ciblée de tranches de cerveau. Dans cette vidéo, nous avons montré les méthodes et buts généraux de la coloration, en plus des procédures spécifiques pour la coloration par IHC et Nissl. Merci de nous avoir regardés!

Transcript

Slices, or sections, of brain tissue are a rich material for studying the structure and function of the brain. However, untreated brain is a visually uniform tissue, like a blank canvas. Staining is a way of “painting” the brain to clearly visualize the cellular, structural, and molecular components of the organ. While most stains share common histological methods, each approach has a unique morphological target. This video will provide an outline of the general principles of brain histology, demonstrate some common staining techniques, and review a few applications of these methods in neuroscience labs today.

Before discussing how neurological staining procedures are carried out, lets review the goals of these techniques.

Histological stains are commonly used to provide contrast, thereby revealing features that cannot be distinguished in unstained tissue. For instance, to visualize the neuron cell bodies, or somata, that make up the gray matter of the nervous system, multiple stains are available. The dyes used in Nissl stains attach to nucleic acids, coloring the somata purple and revealing neuronal organization.

Alternatively, to look at white matter, you can stain myelin – the fatty acid sheath surrounding axons – with dyes like Luxol Fast Blue. Alternatively, immunohistochemical staining can highlight molecular targets found on specific cell types. This technique takes advantage of the specificity between antibodies and molecular targets known as antigens. The use of antibodies fused to enzymes or fluorescent compounds allows researchers to visualize their binding sites using enzymatic reactions or fluorescence.

Now that you’ve been introduced to the idea of staining sections, lets look at the common histological steps that precede brain tissue staining and ensure optimal conditions for visualization.

To preserve tissue structure, the brain is first perfused – meaning the blood is drained from the brain and the animal’s vasculature is used to deliver a chemical fixative. After dissection, the brain is fully immersed in fixative to complete the preservation process.

Next, the specimen is embedded in a medium with similar mechanical properties to brain tissue, like paraffin wax. After embedding, the brain is thinly sectioned using an instrument known as a microtome. The slices are then mounted on slides and allowed to dry.

Since most dyes are water-based, the tissue needs to be dewaxed and rehydrated before staining can begin. To accomplish this, the slides are rinsed in xylene to dissolve the wax prior to gradual rehydration through a series of increasingly diluted ethanol. This process should be carried out in a fume hood while wearing the appropriate personal protective equipment.

Having prepared your brain tissue, you are now ready to begin the staining procedure.

The first step, known as blocking, reduces background staining caused by nonspecific antibody binding. Exposing the section to serum accomplishes this by introducing unlabeled antibodies that bind to non-target sites. After a 30-minute to overnight block, the tissue is ready for incubation with primary antibody, which binds to specific molecular targets.

Antibodies are usually diluted in a blocking solution containing detergent, which disrupts cell membranes and allows antibodies to enter the cytoplasm.

After an overnight incubation, excess primary antibodies are removed by brief washes in buffer. Next, the secondary antibodies, conjugated to enzymes or fluorophores, are introduced to specifically label the primary antibodies. Several hours later, excess antibodies are removed with multiple changes of buffer.

Now that the targets have been labeled, let’s talk about how to detect them. For enzyme-conjugated secondaries, this is accomplished by introduction of a chromogenic substrate. When the substrate interacts with the enzyme, a color change occurs, hence the term “chromogenic”. Once the desired staining is achieved, typically after about 2 minutes, the reaction is stopped by quickly immersing the sections in water.

After antibody staining, a second step may still be required to provide some neuroanatomical context to the results. For example, you may choose to enhance tissue contrast using a Nissl stain. This procedure relies upon on basic dyes like Cresyl violet, which interact with nucleic acids.

The first step is to filter the dye solution to remove undissolved crystals. The slides are then incubated in stain until the desired contrast is achieved. Then, wash the sections in multiple changes of water to stop the staining.

The slides are then immersed in a series of alcohol to clear excess stain and dehydrate the slices. After dehydration, the slices are cleared with xylene, which removes the alcohol, and improves imaging since it has light diffraction properties similar to those of the tissue.

To preserve the stained sections for later analysis, coverslip with a permanent mounting medium and let dry overnight.

Now that we have outlined the procedures and goals of staining lets look at some applications.

First off, histological staining is routinely used to visualize individual neurons. In turn, visualization is required for techniques like laser capture microdissection, in which researchers use a laser to isolate specific cells grown on a thin film. Genetic material can be extracted from the stained and dissected cells, allowing researchers to investigate neuron-specific gene expression.

Staining may also be employed to characterize morphological features of individual neurons. In this experiment, immunohistochemistry is performed on cells expressing GFP to visualize synapse-forming dendrites. Staining is compared between normal and activated cells, revealing that dendrites undergo multiple changes in response to activating stimuli.

Finally, thanks to the specificity of IHC, the expression of individual proteins can be used to identify the location and identity of unique cell populations in the nervous system. For example, staining of the mouse cerebellum with zebrin 2 antibodies reveals the location of specialized neurons known as Purkinje cells.

You’ve just watched JoVE’s introduction to targeted staining of brain slices. In this video we have demonstrated the general methods and goals of staining, in addition to specific procedures for IHC and Nissl staining.

Thanks for watching!

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