Les tranches, ou sections de tissus du cerveau sont une ressource riche pour étudier sa structure et son fonctionnement. Cependant, un cerveau non traité est un tissu visuellement uniforme, comme un canevas blanc. Le colorer est un moyen de « peindre » le cerveau pour visualiser clairement les composants cellulaires, structurels et moléculaires de l’organe. Bien que la plupart des colorants partagent des méthodes histologiques communes, chaque approche a une cible morphologique unique. Cette vidéo fournit une esquisse des principes généraux de l’histologie du cerveau, démontre des techniques communes de coloration et passe en revue quelques utilisations de ces méthodes dans les labos de neuroscience aujourd’hui.
Avant de présenter comment les procédures de coloration neurologique sont mises en œuvre, decrivons les objectifs de cette technique.
Les colorants histologiques sont communément utilisés pour créer un contraste, révélant ainsi les caractéristiques qui ne peuvent être distinguées dans des tissus non colorés. Par exemple, pour visualiser les corps cellulaires du neurone, ou soma, qui constituent la matière grise du système nerveux, de nombreux colorants sont disponibles. Les encres utilisées dans la coloration de Nissl s’attachent aux acides nucléiques, colorant le soma en violet et révélant l’organisation neuronale.
Alternativement, pour observer la matière blanche, vous pouvez teindre la myéline – l’acide gras enrobant les axones – avec des colorants comme le Bleu Luxol rapide. Une autre option est la coloration immunohistochimique qui peut mettre en évidence des cibles moléculaires trouvées sur des types spécifiques de cellules. Cette technique profite de la spécificité entre les anticorps et les cibles moléculaires appelées antigènes. L’utilisation d’anticorps fusionnés à des enzymes ou des composés fluorescents permet aux chercheurs de visualiser leurs sites de liaison en utilisant les réactions enzymatiques ou fluorescentes.
Maintenant que vous avez une idée de ce qu’est la coloration de sections, regardons les étapes histologiques habituelles qui précèdent la coloration des tissus et garantissent des conditions optimales pour la visualisation.
Pour préserver la structure du tissu, le cerveau est d’abord perfusé – c’est-à-dire que le sang est drainé hors du cerveau et le réseau vasculaire de l’animal est utilisé pour livrer une substance chimique fixative. Après dissection, le cerveau est totalement immergé dans un fixatif pour compléter le processus de conservation.
Ensuite, le prélèvement est intégré dans un milieu aux propriétés mécaniques similaires, comme la cire de paraffine. Après l’intégration, le cerveau est finement tranché en utilisant un microtome. Les tranches sont ensuite mises sur une plaque et laissées à sécher.
Vu que la plupart des colorants sont à base d’eau, le tissu a besoin d’être dé-ciré et réhydraté avant d’être coloré. Pour réaliser cela, les tranches sont rincées dans du xylène pour dissoudre la cire avant d’être réhydratées graduellement dans des bains d’éthanol de plus en plus dilués. Ce procédé devrait être mis en œuvre sous hotte tout en portant l’équipement de protection individuel approprié.
Une fois vos tissus de cerveau préparés, vous êtes maintenant prêts pour commencer la procédure de coloration.
La première étape, appelée blocage, réduit la coloration de fond provoquée par les liaisons non spécifiques d’anticorps. L’exposition de la tranche au sérum aura cet effet via l’introduction d’anticorps non labélisés qui se lient à des sites non cibles. Après un blocage allant de 30 minutes à toute la nuit, le tissu est prêt pour incubation avec l’anticorps primaire, qui se lie à des cibles moléculaires spécifiques.
Les anticorps sont habituellement dilués dans une solution de blocage contenant du détergent, ce qui perturbe les membranes cellulaires et permet aux anticorps d’entrer dans le cytoplasme.
Après une incubation au cours de la nuit, les anticorps primaires en excès sont retirés par un lavage bref en solution tampon. Ensuite, les anticorps secondaires, conjugués à des enzymes ou des fluorophores, sont introduits pour étiqueter spécifiquement les anticorps primaires. Plusieurs heures plus tard, les anticorps en excès sont retirés avec de multiples changements de tampon.
Maintenant que les cibles ont été étiquetées, voyons comment les détecter. Pour les anticorps secondaires conjugués aux enzymes, ceci est réalisé par l’introduction d’un substrat chromogénique. Lorsque le substrat interagit avec l’enzyme, un changement de couleur se produit, d’où le nom « chromogénique ». Une fois que la coloration désirée est réalisée, typiquement après 2 minutes, la réaction est arrêtée en immergeant rapidement les tranches dans l’eau.
Après la coloration de l’anticorps, une deuxième étape peut être nécessaire pour fournir un contexte neuroanatomique aux résultats. Par exemple, vous pouvez choisir d’améliorer le contraste en utilisant un colorant de Nissl. Cette procédure repose sur des colorants de base comme le violet de crésyle, qui interagit avec les acides nucléiques.
La première étape est de filtrer la solution colorante pour retirer les cristaux non dissouts. Les tranches sont ensuite incubées dans le colorant jusqu’à ce que le contraste désiré soit atteint. Ensuite, lavez les tranches dans de l’eau renouvelée plusieurs fois pour arrêter la coloration.
Les tranches sont alors immergées dans une série d’alcools pour enlever l’excès de colorant et déshydrater les tranches. Après déshydratation, les tranches sont nettoyées au xylène, ce qui retire l’alcool et améliore l’imagerie car il a des propriétés de diffraction similaires à celles du tissu.
Pour préserver les sections teintes en vue de les analyser plus tard, couvrez les avec un média de montage permanent et laissez sécher au cours de la nuit.
Maintenant que nous avons exposé les procédures et les buts de la coloration, decrivons quelques utilisations.
Tout d’abord, la coloration histologique est habituellement utilisée pour visualiser les neurones individuels. A son tour, la visualisation est requise pour les techniques comme la microdissection au laser, dans laquelle les chercheurs utilisent un laser pour isoler des cellules spécifiques cultivées sur un film mince. Le matériel génétique peut être extrait depuis les cellules teintes et disséquées, permettant aux chercheurs d’étudier l’expression de gènes spécifiques au neurone.
La coloration peut aussi être employée pour caractériser les particularités morphologiques des neurones individuels. Dans cette expérience, une immunohistochimie est réalisée sur des cellules exprimant du GFP pour visualiser les dendrites des synapses en formation. La coloration est comparée entre les cellules normales et celles activées, révélant que les dendrites subissent de multiples changements en réponse aux stimuli d’activation.
Enfin, grâce à la spécificité de l’IHC, l’expression de protéines individuelles peut être utilisée pour identifier la localisation et l’identité des populations de cellules uniques dans le système nerveux. Par exemple, la coloration du cervelet de la souris avec des anticorps Zebrin-2 révèle la localisation de neurones spécialisés appelés cellules de Purkinje.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE sur la coloration ciblée de tranches de cerveau. Dans cette vidéo, nous avons montré les méthodes et buts généraux de la coloration, en plus des procédures spécifiques pour la coloration par IHC et Nissl. Merci de nous avoir regardés!
En vue d’examiner la disposition cellulaire, structurelle et moléculaire des tissus et organes, les chercheurs utilisent une méthode appelée coloratio…
Les tranches, ou sections de tissus du cerveau sont une ressource riche pour étudier sa structure et son fonctionnement. Cependant, un cerveau non traité est un tissu visuellement uniforme, comme un canevas blanc. Le colorer est un moyen de « peindre » le cerveau pour visualiser clairement les composants cellulaires, structurels et moléculaires de l’organe. Bien que la plupart des colorants partagent des méthodes histologiques communes, chaque approche a une cible morphologique unique. Cette vidéo fournit une esquisse des principes généraux de l’histologie du cerveau, démontre des techniques communes de coloration et passe en revue quelques utilisations de ces méthodes dans les labos de neuroscience aujourd’hui.
Avant de présenter comment les procédures de coloration neurologique sont mises en œuvre, decrivons les objectifs de cette technique.
Les colorants histologiques sont communément utilisés pour créer un contraste, révélant ainsi les caractéristiques qui ne peuvent être distinguées dans des tissus non colorés. Par exemple, pour visualiser les corps cellulaires du neurone, ou soma, qui constituent la matière grise du système nerveux, de nombreux colorants sont disponibles. Les encres utilisées dans la coloration de Nissl s’attachent aux acides nucléiques, colorant le soma en violet et révélant l’organisation neuronale.
Alternativement, pour observer la matière blanche, vous pouvez teindre la myéline – l’acide gras enrobant les axones – avec des colorants comme le Bleu Luxol rapide. Une autre option est la coloration immunohistochimique qui peut mettre en évidence des cibles moléculaires trouvées sur des types spécifiques de cellules. Cette technique profite de la spécificité entre les anticorps et les cibles moléculaires appelées antigènes. L’utilisation d’anticorps fusionnés à des enzymes ou des composés fluorescents permet aux chercheurs de visualiser leurs sites de liaison en utilisant les réactions enzymatiques ou fluorescentes.
Maintenant que vous avez une idée de ce qu’est la coloration de sections, regardons les étapes histologiques habituelles qui précèdent la coloration des tissus et garantissent des conditions optimales pour la visualisation.
Pour préserver la structure du tissu, le cerveau est d’abord perfusé – c’est-à-dire que le sang est drainé hors du cerveau et le réseau vasculaire de l’animal est utilisé pour livrer une substance chimique fixative. Après dissection, le cerveau est totalement immergé dans un fixatif pour compléter le processus de conservation.
Ensuite, le prélèvement est intégré dans un milieu aux propriétés mécaniques similaires, comme la cire de paraffine. Après l’intégration, le cerveau est finement tranché en utilisant un microtome. Les tranches sont ensuite mises sur une plaque et laissées à sécher.
Vu que la plupart des colorants sont à base d’eau, le tissu a besoin d’être dé-ciré et réhydraté avant d’être coloré. Pour réaliser cela, les tranches sont rincées dans du xylène pour dissoudre la cire avant d’être réhydratées graduellement dans des bains d’éthanol de plus en plus dilués. Ce procédé devrait être mis en œuvre sous hotte tout en portant l’équipement de protection individuel approprié.
Une fois vos tissus de cerveau préparés, vous êtes maintenant prêts pour commencer la procédure de coloration.
La première étape, appelée blocage, réduit la coloration de fond provoquée par les liaisons non spécifiques d’anticorps. L’exposition de la tranche au sérum aura cet effet via l’introduction d’anticorps non labélisés qui se lient à des sites non cibles. Après un blocage allant de 30 minutes à toute la nuit, le tissu est prêt pour incubation avec l’anticorps primaire, qui se lie à des cibles moléculaires spécifiques.
Les anticorps sont habituellement dilués dans une solution de blocage contenant du détergent, ce qui perturbe les membranes cellulaires et permet aux anticorps d’entrer dans le cytoplasme.
Après une incubation au cours de la nuit, les anticorps primaires en excès sont retirés par un lavage bref en solution tampon. Ensuite, les anticorps secondaires, conjugués à des enzymes ou des fluorophores, sont introduits pour étiqueter spécifiquement les anticorps primaires. Plusieurs heures plus tard, les anticorps en excès sont retirés avec de multiples changements de tampon.
Maintenant que les cibles ont été étiquetées, voyons comment les détecter. Pour les anticorps secondaires conjugués aux enzymes, ceci est réalisé par l’introduction d’un substrat chromogénique. Lorsque le substrat interagit avec l’enzyme, un changement de couleur se produit, d’où le nom « chromogénique ». Une fois que la coloration désirée est réalisée, typiquement après 2 minutes, la réaction est arrêtée en immergeant rapidement les tranches dans l’eau.
Après la coloration de l’anticorps, une deuxième étape peut être nécessaire pour fournir un contexte neuroanatomique aux résultats. Par exemple, vous pouvez choisir d’améliorer le contraste en utilisant un colorant de Nissl. Cette procédure repose sur des colorants de base comme le violet de crésyle, qui interagit avec les acides nucléiques.
La première étape est de filtrer la solution colorante pour retirer les cristaux non dissouts. Les tranches sont ensuite incubées dans le colorant jusqu’à ce que le contraste désiré soit atteint. Ensuite, lavez les tranches dans de l’eau renouvelée plusieurs fois pour arrêter la coloration.
Les tranches sont alors immergées dans une série d’alcools pour enlever l’excès de colorant et déshydrater les tranches. Après déshydratation, les tranches sont nettoyées au xylène, ce qui retire l’alcool et améliore l’imagerie car il a des propriétés de diffraction similaires à celles du tissu.
Pour préserver les sections teintes en vue de les analyser plus tard, couvrez les avec un média de montage permanent et laissez sécher au cours de la nuit.
Maintenant que nous avons exposé les procédures et les buts de la coloration, decrivons quelques utilisations.
Tout d’abord, la coloration histologique est habituellement utilisée pour visualiser les neurones individuels. A son tour, la visualisation est requise pour les techniques comme la microdissection au laser, dans laquelle les chercheurs utilisent un laser pour isoler des cellules spécifiques cultivées sur un film mince. Le matériel génétique peut être extrait depuis les cellules teintes et disséquées, permettant aux chercheurs d’étudier l’expression de gènes spécifiques au neurone.
La coloration peut aussi être employée pour caractériser les particularités morphologiques des neurones individuels. Dans cette expérience, une immunohistochimie est réalisée sur des cellules exprimant du GFP pour visualiser les dendrites des synapses en formation. La coloration est comparée entre les cellules normales et celles activées, révélant que les dendrites subissent de multiples changements en réponse aux stimuli d’activation.
Enfin, grâce à la spécificité de l’IHC, l’expression de protéines individuelles peut être utilisée pour identifier la localisation et l’identité des populations de cellules uniques dans le système nerveux. Par exemple, la coloration du cervelet de la souris avec des anticorps Zebrin-2 révèle la localisation de neurones spécialisés appelés cellules de Purkinje.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE sur la coloration ciblée de tranches de cerveau. Dans cette vidéo, nous avons montré les méthodes et buts généraux de la coloration, en plus des procédures spécifiques pour la coloration par IHC et Nissl. Merci de nous avoir regardés!
Les tranches, ou sections de tissus du cerveau sont une ressource riche pour étudier sa structure et son fonctionnement. Cependant, un cerveau non traité est un tissu visuellement uniforme, comme un canevas blanc. Le colorer est un moyen de « peindre » le cerveau pour visualiser clairement les composants cellulaires, structurels et moléculaires de l’organe. Bien que la plupart des colorants partagent des méthodes histologiques communes, chaque approche a une cible morphologique unique. Cette vidéo fournit une esquisse des principes généraux de l’histologie du cerveau, démontre des techniques communes de coloration et passe en revue quelques utilisations de ces méthodes dans les labos de neuroscience aujourd’hui.
Avant de présenter comment les procédures de coloration neurologique sont mises en œuvre, decrivons les objectifs de cette technique.
Les colorants histologiques sont communément utilisés pour créer un contraste, révélant ainsi les caractéristiques qui ne peuvent être distinguées dans des tissus non colorés. Par exemple, pour visualiser les corps cellulaires du neurone, ou soma, qui constituent la matière grise du système nerveux, de nombreux colorants sont disponibles. Les encres utilisées dans la coloration de Nissl s’attachent aux acides nucléiques, colorant le soma en violet et révélant l’organisation neuronale.
Alternativement, pour observer la matière blanche, vous pouvez teindre la myéline – l’acide gras enrobant les axones – avec des colorants comme le Bleu Luxol rapide. Une autre option est la coloration immunohistochimique qui peut mettre en évidence des cibles moléculaires trouvées sur des types spécifiques de cellules. Cette technique profite de la spécificité entre les anticorps et les cibles moléculaires appelées antigènes. L’utilisation d’anticorps fusionnés à des enzymes ou des composés fluorescents permet aux chercheurs de visualiser leurs sites de liaison en utilisant les réactions enzymatiques ou fluorescentes.
Maintenant que vous avez une idée de ce qu’est la coloration de sections, regardons les étapes histologiques habituelles qui précèdent la coloration des tissus et garantissent des conditions optimales pour la visualisation.
Pour préserver la structure du tissu, le cerveau est d’abord perfusé – c’est-à-dire que le sang est drainé hors du cerveau et le réseau vasculaire de l’animal est utilisé pour livrer une substance chimique fixative. Après dissection, le cerveau est totalement immergé dans un fixatif pour compléter le processus de conservation.
Ensuite, le prélèvement est intégré dans un milieu aux propriétés mécaniques similaires, comme la cire de paraffine. Après l’intégration, le cerveau est finement tranché en utilisant un microtome. Les tranches sont ensuite mises sur une plaque et laissées à sécher.
Vu que la plupart des colorants sont à base d’eau, le tissu a besoin d’être dé-ciré et réhydraté avant d’être coloré. Pour réaliser cela, les tranches sont rincées dans du xylène pour dissoudre la cire avant d’être réhydratées graduellement dans des bains d’éthanol de plus en plus dilués. Ce procédé devrait être mis en œuvre sous hotte tout en portant l’équipement de protection individuel approprié.
Une fois vos tissus de cerveau préparés, vous êtes maintenant prêts pour commencer la procédure de coloration.
La première étape, appelée blocage, réduit la coloration de fond provoquée par les liaisons non spécifiques d’anticorps. L’exposition de la tranche au sérum aura cet effet via l’introduction d’anticorps non labélisés qui se lient à des sites non cibles. Après un blocage allant de 30 minutes à toute la nuit, le tissu est prêt pour incubation avec l’anticorps primaire, qui se lie à des cibles moléculaires spécifiques.
Les anticorps sont habituellement dilués dans une solution de blocage contenant du détergent, ce qui perturbe les membranes cellulaires et permet aux anticorps d’entrer dans le cytoplasme.
Après une incubation au cours de la nuit, les anticorps primaires en excès sont retirés par un lavage bref en solution tampon. Ensuite, les anticorps secondaires, conjugués à des enzymes ou des fluorophores, sont introduits pour étiqueter spécifiquement les anticorps primaires. Plusieurs heures plus tard, les anticorps en excès sont retirés avec de multiples changements de tampon.
Maintenant que les cibles ont été étiquetées, voyons comment les détecter. Pour les anticorps secondaires conjugués aux enzymes, ceci est réalisé par l’introduction d’un substrat chromogénique. Lorsque le substrat interagit avec l’enzyme, un changement de couleur se produit, d’où le nom « chromogénique ». Une fois que la coloration désirée est réalisée, typiquement après 2 minutes, la réaction est arrêtée en immergeant rapidement les tranches dans l’eau.
Après la coloration de l’anticorps, une deuxième étape peut être nécessaire pour fournir un contexte neuroanatomique aux résultats. Par exemple, vous pouvez choisir d’améliorer le contraste en utilisant un colorant de Nissl. Cette procédure repose sur des colorants de base comme le violet de crésyle, qui interagit avec les acides nucléiques.
La première étape est de filtrer la solution colorante pour retirer les cristaux non dissouts. Les tranches sont ensuite incubées dans le colorant jusqu’à ce que le contraste désiré soit atteint. Ensuite, lavez les tranches dans de l’eau renouvelée plusieurs fois pour arrêter la coloration.
Les tranches sont alors immergées dans une série d’alcools pour enlever l’excès de colorant et déshydrater les tranches. Après déshydratation, les tranches sont nettoyées au xylène, ce qui retire l’alcool et améliore l’imagerie car il a des propriétés de diffraction similaires à celles du tissu.
Pour préserver les sections teintes en vue de les analyser plus tard, couvrez les avec un média de montage permanent et laissez sécher au cours de la nuit.
Maintenant que nous avons exposé les procédures et les buts de la coloration, decrivons quelques utilisations.
Tout d’abord, la coloration histologique est habituellement utilisée pour visualiser les neurones individuels. A son tour, la visualisation est requise pour les techniques comme la microdissection au laser, dans laquelle les chercheurs utilisent un laser pour isoler des cellules spécifiques cultivées sur un film mince. Le matériel génétique peut être extrait depuis les cellules teintes et disséquées, permettant aux chercheurs d’étudier l’expression de gènes spécifiques au neurone.
La coloration peut aussi être employée pour caractériser les particularités morphologiques des neurones individuels. Dans cette expérience, une immunohistochimie est réalisée sur des cellules exprimant du GFP pour visualiser les dendrites des synapses en formation. La coloration est comparée entre les cellules normales et celles activées, révélant que les dendrites subissent de multiples changements en réponse aux stimuli d’activation.
Enfin, grâce à la spécificité de l’IHC, l’expression de protéines individuelles peut être utilisée pour identifier la localisation et l’identité des populations de cellules uniques dans le système nerveux. Par exemple, la coloration du cervelet de la souris avec des anticorps Zebrin-2 révèle la localisation de neurones spécialisés appelés cellules de Purkinje.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE sur la coloration ciblée de tranches de cerveau. Dans cette vidéo, nous avons montré les méthodes et buts généraux de la coloration, en plus des procédures spécifiques pour la coloration par IHC et Nissl. Merci de nous avoir regardés!
Q1: Why is staining necessary for studying brain tissue?
Untreated brain tissue is visually uniform, making it difficult to distinguish cellular and structural components. Staining provides contrast by using dyes that attach to specific targets like nucleic acids or molecular markers. This allows researchers to visualize neuronal organization, white matter, and other features that would otherwise remain invisible under a microscope.
Q2: What is the difference between Nissl staining and Luxol Fast Blue staining?
Nissl stains target nucleic acids in neuronal cell bodies, or somata, coloring them purple to reveal gray matter organization. Luxol Fast Blue stains myelin, the fatty acid sheath surrounding axons, to visualize white matter. Each stain has a unique morphological target, allowing researchers to examine different nervous system components depending on their research goals.
Q3: How does immunohistochemical staining work?
Immunohistochemical staining uses antibodies that bind to specific molecular targets called antigens on cell types of interest. Antibodies fused to enzymes or fluorescent compounds allow researchers to visualize binding sites through enzymatic reactions or fluorescence. This specificity enables researchers to highlight particular proteins and identify unique cell populations in the nervous system.
Q4: What are the main preparation steps before staining brain tissue?
Brain tissue preparation involves perfusion to drain blood and deliver chemical fixative, followed by immersion in fixative for complete preservation. The specimen is then embedded in paraffin wax, sectioned thinly using a microtome, and mounted on slides. Before staining, tissue must be dewaxed with xylene and rehydrated through increasingly diluted ethanol solutions to prepare it for dye application.
Q5: What does the blocking step accomplish in immunohistochemical staining?
Blocking reduces background staining caused by nonspecific antibody binding. Exposing tissue sections to serum introduces unlabeled antibodies that bind to non-target sites, preventing primary antibodies from attaching to unwanted locations. This 30-minute to overnight incubation step improves staining specificity and clarity, ensuring that only target molecular sites are labeled.
Q6: How is chromogenic detection used to visualize stained targets?
Chromogenic detection uses enzyme-conjugated secondary antibodies that bind to primary antibodies. When a chromogenic substrate is introduced, it interacts with the enzyme to produce a visible color change, typically within two minutes. The reaction is stopped by immersing sections in water, leaving a permanent colored mark at target sites for microscopic analysis.
Q7: What are practical applications of histological staining in neuroscience research?
Staining enables laser capture microdissection, where researchers use lasers to isolate specific stained cells for genetic analysis of neuron-specific gene expression. Immunohistochemistry reveals morphological changes in dendrites and identifies unique cell populations like Purkinje cells in the cerebellum. These techniques provide essential visualization for studying cellular structure, protein expression, and neural organization in an introduction to cellular and molecular neuroscience research.
Chapters in this video
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Vue d’ensemble
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Pourquoi « peindre » le cerveau
2:23
Préparation des échantillons histologiques
3:49
Procédure d’immunohistochimie
5:36
Procédure de coloration de Nissl
6:49
Utilisations
8:27
Résumé
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