Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

L’objectif global de l’expérience suivante est d’effectuer un dépistage chimique sur des embryons de poisson-zèbre en utilisant le traitement manuel des échantillons. Pour ce faire, il suffit d’abord de placer les poissons-zèbres adultes dans des chambres d’accouplement avec un séparateur pendant la nuit, puis de retirer le séparateur le lendemain matin pour collecter les embryons. Ensuite, des groupes d’embryons de poisson-zèbre sont disposés dans des plaques de 96 puits, puis traités avec un médicament au stade de développement souhaité.

Ensuite, les embryons sont fixés avec 4 % de paraldéhyde et testés pour évaluer les effets de petites molécules sur le processus de développement d’intérêt. Les résultats montrent des changements développementaux tels que le gain ou la perte de domaines d’expression génique qui peuvent indiquer des altérations de la morphogenèse des sulfates ou des tissus causées par les petites molécules interrogées. Les implications de cette technique s’étendent au traitement clinique d’une variété de maladies en raison de la capacité d’identifier des composés potentiellement thérapeutiques.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique peuvent avoir des difficultés parce qu’elles doivent acquérir la dextérité nécessaire pour travailler avec des embryons, par exemple en les transférant entre des plaques multipuits sans les endommager. La démonstration de la procédure sera faite par moi-même et Eric Donahue, un chercheur de premier cycle dans le laboratoire Pour mettre en place des accouplements de poissons zèbres. Utilisez des chambres d’accouplement avec des séparateurs, placez le poisson zèbre mâle adulte d’un côté du séparateur et le poisson zèbre femelle adulte de l’autre côté.

Pour chaque plaque de 96 puits de petites molécules à tester. Installez 25 réservoirs d’accouplement et laissez-les passer la nuit. Le lendemain, retirez la chambre qui sépare chaque paire de poissons et, au bout d’une heure, utilisez une passoire à mailles fines pour recueillir les embryons avant de les placer dans des boîtes de Pétri contenant E trois milieu avec une pipette de transfert.

Retirez les débris des plaques et sous un stéréoscope. Observez chaque couvée d’embryons et retirez tous les œufs non fécondés. Décantez le E 3 moyen et remplacez-le par du E 3 frais.

Placez ensuite chaque plat d’embryons dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius pendant deux heures. Vérifiez à nouveau les plaques et jetez tous les œufs non fécondés supplémentaires. Continuez à incuber les embryons jusqu’au stade de 40 %.

Retirez la plaque de la chimiothèque à moins 80 degrés Celsius. Utilisez du papier d’aluminium pour le couvrir et laissez-le décongeler à température ambiante avec une pipette à huit canaux. Ajoutez 99 microlitres de E trois aux colonnes deux à 12 d’une plaque de 96 puits.

Ajoutez ensuite un microlitre des composés appropriés dans les puits des colonnes deux à 11 ici, désignés comme les échantillons expérimentaux Pipette un microlitre de DMSO dans la colonne de contrôle ici conçue pour être la colonne 12. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir la plaque de dilution et remettez la chimiothèque au congélateur. Ensuite, après avoir sélectionné une boîte de Pétri contenant des embryons au stade épi à 40 %, utilisez une pipette de transfert pour placer soigneusement environ 10 embryons par puits dans les colonnes deux à 12 d’un 96.

Assiette de puits. À l’aide d’une pipette de transfert en verre, retirez l’excédent de E trois de chaque puits et expulsez-le dans un contenant de déchets liquides. Pour traiter chimiquement les embryons, transférez 100 microlitres de chaque dilution chimique de la plaque à 96 puits dans le puits respectif des embryons pour créer une chambre humide avec une serviette en papier et placez-le dans un récipient sensible à la lumière.

Assez grand pour contenir une plaque de 96 puits. Utilisez ensuite un tapis de plafond pour sceller la plaque. Placez-le dans le récipient sensible à la lumière et incubez-le à 28,5 degrés Celsius pendant la durée souhaitée.

Pour éliminer les produits chimiques, ajoutez 300 microlitres de E 3 à chaque rangée de puits traités par médicament. Ensuite, prélevez le milieu avant d’utiliser E trois pour laver les embryons trois fois pour fixer les embryons, transférez-les dans quatre plaques étiquetées à 24 puits en plaçant la pipette devant un fond sombre. Après chaque transfert de puits, pour identifier les embryons laissés dans la pipette et éviter les croisements, retirez tous les embryons morts.

Retirez le E trois pour que les embryons soient à peine immergés dans le liquide. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre, ajoutez deux gouttes de 50 milligrammes par millilitre de pronase à chacune. Bien incuber les embryons pendant cinq minutes avant d’agiter les puits pour provoquer la rupture du Corian.

Après avoir utilisé E trois pour laver les embryons deux fois, prélevez et jetez les E trois restants. Ajoutez 4 % de P-F-A-P-B-S dans chaque puits et incubez les embryons pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Effectuez ensuite un criblage d’intérêt tel que l’hybridation in situ par montage en trou, ou souhaitez, comme indiqué dans le protocole textuel, noter les embryons à partir du criblage chimique.

Transférez-les sur des plaques de 12 puits étiquetées avant d’utiliser un stéréomicroscope pour les observer comme indiqué dans ce schéma. Il est pratique pour une seule personne d’effectuer un dépistage génétique chimique sur environ 600 composés au cours de neuf semaines d’efforts dédiés, et ce temps peut être réduit à trois semaines s’il est effectué par trois personnes. Ainsi, le temps passé sur le banc d’une ou de quelques personnes peut contourner le besoin d’équipements exigeants en ressources comme les systèmes automatisés.

Comme montré ici, des embryons de poisson-zèbre ont été soumis à des composés individuels d’une bibliothèque bioactive de 50 % de personnes à 24 HPF, puis testés par volonté, à l’aide d’un cocktail de trois sondes ribo pour détecter des segments de néphron. À titre d’exemple, le système de classement, un composé qui a entraîné une augmentation spectaculaire du tubule proximal alambiqué ou PCT, sera classé dans la classe un, qui représente la classe associée au défaut le plus grave et le plus haut niveau de confiance dans le phénotype observé. Le composé serait alors annoté en tant que PCT de première classe.

De plus, cette classification fournit un moyen simple et rapide de décrire une petite molécule d’intérêt, y compris la gravité de son effet sur l’organisme, la région affectée par le médicament et la manière dont la région est affectée. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de situer vos embryons au bon moment de développement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un dépistage chimique manuel avec des embryons de poisson-zèbre.