Name: Méthode EPA 1615. Mesure de entérovirus et Norovirus présence dans leau par Culture et RT-qPCR. I. Prélèvement des échantillons de virus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Découvrez la méthode EPA 1615 pour prélever des échantillons d'eau et détecter les entérovirus et norovirus par filtration électropositive. Cette procédure standardisée garantit des résultats fiables pour la surveillance de la qualité microbiologique des eaux.

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Les auteurs remercient le personnel de nombreux APE dont les contributions fait de la surveillance effectuée au cours de l&#39;ICR et UCMR3 possible, les enquêteurs principaux suivants d&#39;autres études APE signalés: Daniel Dahling, Alfred Dufour, Andrey Egorov, Susan Glassmeyer, Asja Korajkic, Richard Lieberman, Robert Safferman, et Tim Wade; et Shannon Griffin et Michael Ware pour un examen critique de ce manuscrit. Les auteurs remercient les Indian Hill Water Works pour l&#39;utilisation d&#39;un de leurs stations de pompage pour démontrer la collecte d&#39;échantillons. Bien que ce travail a été examiné par l&#39;EPA et approuvé pour publication, il peut ne pas refléter nécessairement la politique officielle de l&#39;Agence. La mention de marques de commerce ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation à l&#39;emploi.

1. Procédures préliminaires <ol><li> Assembler un dispositif de filtre standard, comme illustré sur la figure 1 consistant en un module d&#39;entrée, un module de logement de cartouche, et un module de décharge comme décrit dans Matériels supplémentaires. </li><li> Étalonner le débitmètre / totalisateur les débits utilisés pour l&#39;échantillonnage avant la première utilisation. Vérifier l&#39;étalonnage après la première utilisation et après un mois d&#39;utilisation. Si l&#39;étalonnage de débit a changé après soit la première utilisation ou après le premier mois d&#39;utilisation, déterminer la fréquence des contrôles d&#39;étalonnage comme décrit dans Matériels supplémentaires. <ol><li> Connectez un module de décharge à un module d&#39;admission, puis connecter le module d&#39;admission à un robinet. Réglez le débitmètre / totalisateur de lire le débit. Ouvrez le robinet complètement et ensuite ajuster le débit à 10 L / min en utilisant la vanne bronze globe. Une fois le débit est stable à 10 L / min, réinitialiser le débitmètre / totalisateur à lire volume total. </li><li> Placez le surlaisser du module de décharge dans une 4 L ou plus graduée et réinitialiser simultanément le totalisateur à zéro. Mesurer la lecture du compteur à la marque de 4-L et le temps nécessaire pour atteindre la barre des 4 L sur le cylindre. Changez le réglage de retour au débit du débitmètre / totalisateur. NOTE: Si le débit a chuté au-dessous de 9,95 L ou augmenté à plus de 10,05 L après avoir terminé l&#39;étape 1.2.2, attendez jusqu&#39;à ce que le débit est stable et répétez l&#39;étape 1.2.2. Un compteur correctement calibré atteindra la marque de 4 L sur le cylindre gradué à 24 ± 1 sec avec une lecture de compteur de 4,0 ± 0,04 L. </li><li> Si la lecture du compteur est inférieure à 3,96 ou plus de 4,04 L, calculer un facteur de correction nécessaires pour tenir compte de la différence observée. Par exemple, si le débitmètre / totalisateur lit 3,9 L à la marque de 4 L sur l&#39;éprouvette graduée, le facteur de correction serait 1,026 (4 ÷ 3,9). Ainsi, si le volume souhaité d&#39;un échantillon de terrain ont été 300 L, le volume collecté selon la ra lecture sur le débitmètre / totalisateur doit être de 300 ÷ 1,026 = 292,4 L. </li></ol></li><li> Stériliser l&#39;appareil de filtre standard et de le préparer pour la collecte de l&#39;échantillon. <ol><li> Stériliser les modules de boîtier d&#39;admission et de la cartouche avec de l&#39;hypochlorite de sodium 0,525% pendant au moins 30 min avant chaque utilisation, soit en immergeant complètement les modules dans les solutions, soit par la circulation de l&#39;hypochlorite de sodium si les modules en utilisant une pompe. Rincer les modules avec dH 2 O stérile puis déchlorer dans une solution contenant 50 ml de 1 M de thiosulfate de sodium par litre d&#39;eau de qualité réactif stérile pendant 5 min. Couvrir le module d&#39;appareil d&#39;échantillonnage de filtre se termine par une feuille d&#39;aluminium stérile. </li><li> Ajoutez un filtre à cartouche électropositif au module de logement de cartouche de manière aseptique. REMARQUE: Veillez à ce que le filtre de la cartouche est bien en place dans les logements. Correctement assis filtres ne fuient pas et le filtre ne se déplace pas dans le logement quand on les secoue. Les joints sur aproperly filtre assis aura indentations visibles montrant où les contacts de les filtrer. Les joints d&#39;étanchéité doivent toujours être vérifiées pour indentations immédiatement après le filtre est retiré du boîtier. </li><li> Enregistrer un numéro unique d&#39;échantillon sur une feuille de données de l&#39;échantillon (voir Matériaux supplémentaires pour un exemple), puis prendre ou expédier l&#39;appareil d&#39;échantillonnage de filtre et l&#39;échantillon Fiche technique à la personne qui viendra chercher l&#39;échantillon sur le terrain, avec les instructions nécessaires concernant l&#39;échantillon collection (par exemple, le volume de l&#39;échantillon, l&#39;emplacement d&#39;échantillonnage, etc.). </li></ol></li></ol> 2. Préparation pour le recueil des échantillons sur le site d&#39;échantillonnage <ol><li> Se laver les mains à l&#39;arrivée sur le site de collecte et enfiler des gants chirurgicaux pour minimiser la possibilité de contamination des échantillons. Ne pas collecter d&#39;échantillons si des symptômes intestinaux ou respiratoires. Changer de gants fréquemment, et surtout après avoir touché les robinets d&#39;eau et d&#39;autres éléments qui peuvent être suiteaminé. </li><li> Enregistrez échantillon représentatif des informations de suivi sur une feuille de données échantillon. Les informations pertinentes comprennent le site et l&#39;identification de l&#39;échantillon, le nom de l&#39;échantillonneur, et les modèles d&#39;équipement et de numéros de série. </li><li> Ouvrez le robinet d&#39;eau pendant 2-3 min pour effacer tous les débris qui se est installé dans la ligne. Si nécessaire, utilisez un tuyau ou un tube jardin pour atteindre un drain pendant cette étape. </li><li> Si les modules de l&#39;appareil d&#39;échantillonnage sont connectés, débranchez-les et protéger les extrémités ouvertes du module de logement de la cartouche avec du papier stérile. Connecter le module de décharge au module d&#39;admission puis brancher à la fois à la prise d&#39;eau. Connecter un tuyau d&#39;arrosage à l&#39;extrémité du module de décharge et placer l&#39;extrémité libre dans le récipient de polypropylene de 1 L. </li><li> Tournez le robinet et passer au moins 75 L de l&#39;eau à échantillonner à travers l&#39;appareil. <ol><li> Mesurer et enregistrer les paramètres de qualité de l&#39;eau pendant la période à plat sur l&#39;eau qui coule dans le récipient polypropylène chlore résiduUAL, le pH, la température et la turbidité. </li><li> Après avoir coupé l&#39;eau du robinet, débrancher le module de décharge à partir du module d&#39;admission, puis connecter le module de logement de cartouche à la sortie du module d&#39;entrée et le module de décharge à la sortie du module de logement de cartouche. Réinitialiser le totalisateur lecture à zéro. </li></ol></li></ol> 3. Champ de prélèvement des échantillons <ol><li> Enregistrez la lecture initiale du totalisateur avec la date et l&#39;heure, puis ouvrir lentement le robinet d&#39;eau. <ol><li> Assurez-vous que le boîtier de cartouche est en position verticale et qu&#39;il remplit complètement avec de l&#39;eau. Certaines enceintes sont pourvues d&#39;un bouton d&#39;aération qui peut être pressé pour expulser l&#39;air hors du boîtier pendant l&#39;opération de remplissage. </li><li> Ouvrez complètement le robinet. Réglez le taux à 10 L / min en utilisant la vanne bronze globe, puis enregistrer le débit initial. </li></ol></li><li> Passez 300 L d&#39;eau de surface ou 1500 à 1800 L d&#39;eau souterraine à travers l&#39;appareil à l&#39;aideles lectures des compteurs (ajusté, si nécessaire). Si les sabots de filtre avant le volume requis est atteint et plus de la moitié du volume a été recueilli, utiliser un second module de boîtier de filtre pour recueillir l&#39;échantillon restant, si elle est disponible. </li><li> Observez le débit que le volume de l&#39;échantillon se rapproche de la fin de la période d&#39;échantillonnage, puis éteindre le débit d&#39;eau à l&#39;échantillon robinet. Enregistrez le taux final de flux, la date, l&#39;heure, la lecture finale du totalisateur, et le volume total de l&#39;échantillon. </li><li> Déconnecter l&#39;appareil d&#39;échantillonnage de filtre du robinet. Déconnecter le module de logement de cartouche à partir des autres modules. <ol><li> Tournez le logement (s) de filtre à l&#39;envers et permettre l&#39;excès d&#39;eau se écouler jusqu&#39;à ce que plus l&#39;eau se écouler de deux ports d&#39;entrée et de sortie. </li><li> Tourner le boîtier debout et couvrir les raccords rapides à chaque extrémité d&#39;une feuille d&#39;aluminium stérile. Placer le boîtier dans un ou plusieurs sacs en plastique refermables. </li><li> Videz l&#39;eau de l&#39;admission et discharge modules. Placez les modules dans un ou plusieurs sacs en plastique hermétiques. </li></ol></li></ol> 4. L&#39;expédition d&#39;échantillons sur le terrain <ol><li> Placer les modules de l&#39;appareil d&#39;échantillonnage de filtre dans un stockage et le transport glacière. </li><li> Ajouter briquettes congelées ou des cubes de glace double-ensachées pour le stockage et le transport de refroidisseur pour se assurer que l&#39;échantillon reste entre 1-10 ° C pendant le transport. Deux grandes ou 6-8 petits paquets de glace devraient être suffisantes. </li><li> Placez un système d&#39;enregistrement de la température dans le stockage et le transport isolé poitrine dans un endroit sans contact avec des packs de glace ou des sacs de glace. REMARQUE: le dispositif d&#39;enregistrement de la température est facultatif si le laboratoire d&#39;analyse sera utilisant un thermomètre infrarouge visuel pour mesurer la température du boîtier de la cartouche dès l&#39;arrivée et l&#39;ouverture du récipient. </li><li> Remplir tout l&#39;espace vide avec le matériel d&#39;emballage et ensuite placer la fiche de données de l&#39;échantillon, protégé dans un sac en plastique refermable, le top. Fermez le stockage et le transport isolé poitrine et du ruban adhésif pour empêcher toute fuite d&#39;eau. </li><li> Transporter ou expédier l&#39;échantillon au laboratoire d&#39;analyse. Assurez-vous que l&#39;échantillon arrive au laboratoire d&#39;analyse au plus tard 24 heures après le début de la collecte des échantillons sur le terrain (ce est à dire, le temps enregistré à l&#39;étape 3.1). </li></ol>

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<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Evidence+of+Norwalk+Virus+Contamination+Levels+on+the+Hands+of+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Evidence of Norwalk Virus Contamination Levels on the Hands of Infected Individuals.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (24), 7875-7881 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Différents types de filtres pour concentrer les virus dans les eaux environnementales ont été utilisés au cours des années 26. Les méthodes actuelles utilisent des ultrafiltres, filtres 27 électronégatifs 13,28,29, des filtres en laine de verre 23, 30 et des filtres électropositifs. Électronégatif filtres ont été largement utilisés depuis de nombreuses années, mais une exigence pour l&#39;addition de sel et l&#39;ajustement du pH de l&#39;eau dans le champ avant ou pendant l&#39;échantillonnage limite leur utilité 13. Le choix de filtre le plus pratique pour échantillonnage sur le terrain est filtres électropositifs. Ces filtres permettent l&#39;échantillonnage de grands volumes d&#39;eau à des débits élevés et sans aucun conditionnement de l&#39;eau. Filtres de laine de verre sont l&#39;option la moins coûteuse, mais avoir des débits plus lents que les filtres électropositifs et ne sont pas disponibles dans le commerce. Ultrafiltres fournissent les recouvrements plus élevés de virus sur une large gamme de qualité de l&#39;eau, mais l&#39;équipement requis pour Sampling est pas facilement portable champ et le temps nécessaire pour prélever des échantillons 27 est beaucoup plus longue. Méthodes ont été développées récemment que l&#39;utilisation préconditionné filtres électronégatifs pour éviter la nécessité d&#39;un ajustement dans le domaine, mais ceux-ci peuvent ne pas être applicables pour la collecte de grands volumes d&#39;échantillons 28,29. Méthode EPA 1615 utilise des filtres à cartouche électropositifs qui obtiennent leur charge positive soit de nanofibres d&#39;oxyde d&#39;aluminium ou des amines quaternaires. Les avantages du premier sur le second, ce est qu&#39;il est moins cher et recueille efficacement le virus dans les eaux sur une plus large gamme de pH naturel valeurs 30,31; Toutefois, chaque cartouche, ainsi que les filtres de laine de verre utilisés par Borchardt et ses collègues donnent recouvrements similaires de entérovirus et de norovirus 23,31,32 de l&#39;eau (Cashdollar, données non publiées). Les filtres à cartouches sont placées dans un appareil d&#39;échantillonnage simple qui est conçu pour simplifier la collecte d&#39;échantillonset réduire la contamination pendant l&#39;échantillonnage. Les méthodes standard sont inestimables lorsque de grandes études sont effectuées avec plusieurs laboratoires d&#39;analyse. Méthode EPA 1615 prévoit des procédures et des conseils pour minimiser les deux grandes questions de collecte de l&#39;échantillon qui peuvent affecter les données recueillies au cours de ces standards études-faux résultats positifs découlant de la contamination lors de la collecte de l&#39;échantillon ou de composants de l&#39;appareil mal désinfectée, et le colmatage des pores du filtre par des composants en l&#39;eau étant échantillonné. Tout comme les virus entériques peuvent se propager de personne à personne en raison de manque d&#39;hygiène, les virus peuvent être introduits dans des échantillons provenant de la main ou des mains mal lavées avec des gants contaminés 33. Il est essentiel que les échantillonneurs à comprendre les voies potentielles de contamination et utilisent une technique aseptique lors de l&#39;échantillonnage. Échantillonneurs doivent comprendre que les gants sont principalement utilisés pour protéger l&#39;échantillonneur de l&#39;exposition et de ne pas protéger l&#39;appareil de contamination. Les mains doivent être lavées avant le début de l&#39;échantillonnage et de soins doivent être prises au cours de l&#39;enfilage de gants pour prévenir main gant contamination. Échantillonneurs de gastro-entérite ou des symptômes respiratoires ne doivent pas prélever des échantillons, car ils pourraient être versaient entérovirus ou norovirus dans les niveaux élevés. Deuxièmement, il faut veiller à éviter toute contamination du virus à partir des événements d&#39;échantillonnage précédentes. Pour réduire cette source potentielle de contamination, le dispositif d&#39;échantillonnage dans la méthode 1615 a été modifiée de celle de l&#39;ICR par l&#39;exclusion d&#39;un régulateur de pression et de mesure de pression entre l&#39;entrée et le module de logement de cartouche. Ces composants ont été retirés parce que les pressions observées pendant les événements d&#39;échantillonnage étaient toujours en dessous de la note maximale du logement (par exemple, 125 psi pour les boîtiers de cartouches 5 pouces) et parce qu&#39;ils étaient difficiles à désinfecter. Ce dernier problème a été démontrée grâce à l&#39;utilisation de l&#39;équipement témoins à blanc en studies la suite de l&#39;ICR 6,20. Le degré auquel il affecté les données ICR est inconnue, mais était probablement faible; il n&#39;y avait que deux échantillons de faux positifs d&#39;évaluation des performances négatives pendant l&#39;étude (données non présentées). Pour réduire davantage la possibilité de contamination par transfert, il est également recommandé que le module de tubulure d&#39;entrée est remplacé après chaque événement d&#39;échantillonnage. Il est particulièrement important d&#39;assurer une désinfection adéquate si l&#39;appareil a été utilisé pour un contrôle de qualité ou de rendement qui a été ensemencée avec des virus. Avant de procéder à la désinfection, la concentration de chlore libre doit être mesurée de la perte au cours du stockage. En plus des modifications de la configuration de l&#39;appareil décrit ci-dessus, il est essentiel que les ébauches de l&#39;équipement normal être exécutées pour démontrer que la désinfection est efficace. Méthode 1 615 mandats qui ébauches de matériel être effectuée en utilisant des appareils qui ont été désinfectés après avoir été utilisée pour les contrôles de virus tête de série, ce qui simplifiela procédure en éliminant la nécessité de passer d&#39;une solution de virus tête de série à travers l&#39;appareil avant la désinfection. La concentration de désinfectant a été porté à 0,525% d&#39;hypochlorite pour la méthode 1615, que cette concentration est nécessaire à la fois pour inactiver tout virus viables sur le matériel et à dégrader les acides nucléiques. Par conséquent, les blancs d&#39;équipement doivent être analysés en utilisant à la fois la culture cellulaire et analyses qPCR. Les deux types de filtres électropositifs ont fait l&#39;objet d&#39;une obstruction pendant les études rapportées dans le tableau 1. Un nombre inconnu d&#39;échantillons avec des volumes réduits peut-être dû à des erreurs d&#39;échantillonnage, comme une lecture erronée du totalisateur ou un arrêt plus tôt intentionnelle de l&#39;échantillonnage de rencontrer un autre date limite, en particulier pour les eaux à turbidité lectures de moins de 20 NTU. Le degré de colmatage dépend à la fois les paramètres de type de filtre et la qualité de l&#39;eau. Préfiltres fournissent une certaine mesure de l&#39;amélioration, mais se il est utilisé, doivent être traitées et analyséesséparément du filtre électropositif. La recommandation actuelle pour la UCMR3 est que l&#39;échantillon soit prélevé sans préfiltres en utilisant des filtres à base de nanofibres d&#39;oxyde-deux aluminium si au moins la moitié du volume peut être recueillie à l&#39;aide du premier filtre.

Les virus entériques humains répliquent dans le tractus gastro-intestinal et se propagent par la voie fécale-orale. Ces virus sont souvent trouvés dans les eaux usées à forte concentration de 1 à 3. Ils peuvent persister dans les effluents d&#39;eaux usées 4,5, et 6,7 surface, rez-de-8-10 et 11 eaux potable traitée. Lorsqu&#39;il est présent, la concentration du virus dans les eaux environnementales aux États-Unis est généralement trop faible pour la mesure directe 12,13. Cela exige que les virus soient concentrées à partir de grands volumes d&#39;eau. Au cours de la Règle de collecte de l&#39;information (ICR) de suivi menées par l&#39;Environmental Protection Agency des États-Unis (EPA) 14, les concentrations de virus d&#39;échantillons positifs dans l&#39;eau de source de grands services publics à l&#39;échelle nationale à distance de 0,009 à 19,7 nombre le plus probable d&#39;unités infectieuses (NPP) / L. Les concentrations médianes et moyennes des échantillons positifs étaient 0,03 et 0,17 MPN / L pour les eaux de source de ruisseaux, 0,01à 0,07 MPN / L pour ceux des lacs et des réservoirs, et de 0,04 à 0,74 MPN / L pour ceux qui utilisent les eaux souterraines 11 (données de la base de données d&#39;accès de 18 mois ICR Aux1 datée du 25.04.2000). concentrations de virus d&#39;échantillons positifs d&#39;une étude de l&#39;EPA des eaux souterraines nationales allaient de 0,009 à 2,12 unités infectieuses / L avec la médiane et les concentrations moyennes de 0,13 et 0,29 unités infectieuses / L 8. La concentration du virus dans des échantillons d&#39;eau souterraine positifs était plus élevé que ceux des ruisseaux. La plupart des installations utilisant des eaux souterraines dans ces études obtenu l&#39;eau des aquifères situés dans des régions karstiques. Ceux-ci, ainsi que ceux situés dans le calcaire et cristallin paramètres (du substratum rocheux fracturé) sont susceptibles d&#39;avoir des concentrations de virus plus élevés que dans d&#39;autres contextes 8,15,16. Méthodes de virus EPA précisent volumes d&#39;échantillonnage de 200 L (ICR) à 300 L (Méthode 1615) de l&#39;eau de surface et 1000 L (ICR) pour 1500 L (Méthode 1615) des eaux souterraines 17,18. Cependant, même avec l&#39;utilisation degrands volumes d&#39;échantillons, la plupart des échantillons de surface et des eaux souterraines sont négatifs pour le virus 8,11,19,20. Les virus présents dans les eaux de surface présentent un risque sanitaire potentiel pour les consommateurs d&#39;eau potable. La Surface Water Treatment Rule exige que tous les usines de traitement utilisant l&#39;eau de surface pour réduire les concentrations de virus d&#39;au moins 4 log. Même avec une réduction de 4 log, les concentrations de virus infectieux dans la source d&#39;eau aussi petit que 0,0044 MPN / L pourraient conduire à une infection par jour en supposant une telle exposition et de traitement des conditions moyennes et les paramètres de dose-réponse pour le rotavirus 11,21. Le risque de virus dans les eaux souterraines non traitées pourrait être encore plus grande en raison de l&#39;absence de traitement et l&#39;apparition virale. Borchardt et ses collègues estiment que jusqu&#39;à 22% des gastro-entérite aiguë chez les adultes et 63% chez les enfants de moins de cinq ans pourraient être attribuables au virus dans l&#39;eau potable dans les communautés en utilisant les eaux souterraines non traitées 19. EPA Méthode 1615 a été développé pour détecter et entérovirus norovirus au cours de troisième cycle de suivi de la surveillance de la contamination non réglementée règlement (UCMR3) 22 comme un ressortissant suivi des conclusions de Borchardt et collègues 19,23. La méthode EPA a été conçu principalement pour mesurer le virus dans les systèmes utilisant les eaux souterraines non traitées, mais a été écrit plus généralement à d&#39;autres types de matrice de l&#39;eau. La nouvelle méthode est un hybride en préservant de nombreux éléments de la méthode du virus utilisé lors de la précédente IC 17, l&#39;ajout de procédures moléculaires basée sur la méthode de Borchardt et al. 19,23 et jeux d&#39;amorces supplémentaires pour les norovirus 24. Le but de cet article est de décrire la procédure d&#39;échantillonnage et les mesures nécessaires pour maintenir l&#39;intégrité de l&#39;échantillon lors de la collecte et l&#39;expédition. Une évaluation de la méthode globale est décrite dans Cashdollar et al. 25. Ce protocole couvre collectio simple sur le terrainn des eaux de surface et souterraines où une pompe et pré-filtre ne sont pas nécessaires et où les ajustements ne sont pas nécessaires pour le pH ou la présence d&#39;un désinfectant dans l&#39;eau à échantillonner. Les exigences d&#39;échantillonnage plus complexes sont décrits dans Fout et al. 17,18.

<table><tbody><tr><td>Bouteille en polypropylène de 1 L</td><td>Nalgene</td><td>2104-0032</td><td></td></tr><tr><td>Carrés de feuille d’aluminium</td><td>Cole-Parmer</td><td>06275-40</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Papier bulle</td><td>U.S. Plastics</td><td>50776</td><td></td></tr><tr><td>Sac refermable</td><td>Uline</td><td>S-12283</td><td></td></tr><tr><td>Sac refermable</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S31798C</tr><tr><td>Blocs réfrigérants commerciaux</td><td>Cole-Parmer</td><td>06345-20</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de coffre-fort réfrigérée</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Éponge de gaze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué</td><td>Cole-Parmer</td><td>06135-90</td><td>4 L ou plus</td></tr><tr><td>Lingette Hype Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-412-56</td><td></td></tr><tr><td>iButtons Enregistreur de données de température</td><td>Maxim</td><td>DS1921G</td><td></td></tr><tr><td>Coffre de rangement et de transport isolé</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-12</td><td></td></tr><tr><td>Ruban d’emballage</td><td>U.S. Plastics</td><td>50083</td><td></td></tr><tr><td>Colorimètre de chlore portable II kit de test</td><td>Hach</td><td>5870062</td><td></td></tr><tr><td>Sonde de pH et de température portable</td><td>Omega</td><td>PHH-830</td><td></td></tr><tr><td>Portable turbidimètre</td><td>Omega</td><td>TRB-2020-E</td><td></td></tr><tr><td>Ruban fileté en PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>08270-34</td><td>Utilisation sur tous les raccords filetés</td></tr><tr><td>Pompe, entraînement magnétique centrifuge</td><td>Cole-Parmer</td><td>72010-20</td><td></td></tr><tr><td>Mamelon de réduction</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-87</td><td></td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium (NaClO)</td><td></td><td></td><td>Utiliser de l’eau de Javel domestique disponible localement</td></tr><tr><td>Thiosulfate de sodium (Na2S2O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217247</td><td></td></tr><tr><td>Gants chirurgicaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur imperméable</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-290546</td><td></td></tr><tr><td>Composition</td><td></td><td></td><td>du support</td></tr><tr><td>0,525 % d’hypochlorite de sodium (NaClO)</td><td>Préparez une solution de NaClO à 0,525 % en diluant l’eau de Javel domestique 1:10 dans dH2O. Conservez les solutions de NaClO à 0,525 % jusqu’à 1 semaine à température ambiante.</td><td></td><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>1 M thiosulfate de sodium (Na2S2O3) pentahydraté</td><td>Préparez une solution de 1 M en dissolvant 248,2 g de Na2S2O3 dans 1 L de dH2O.&nbsp ; Conservez le thiosulfate de sodium jusqu’à 6 mois à température ambiante.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

méthode epa 1615. mesure de entérovirus et norovirus présence dans l&#39;eau par culture et rt-qpcr. i. prélèvement des échantillons de virus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

La méthode EPA 1615 a été élaborée dans le but de fournir une méthode standard pour mesurer les entérovirus et les norovirus dans l’environnement et les eaux potables. L’élément d’échantillonnage normalisé de la méthode concentre les virus qui peuvent être présents dans l’eau par le passage d’un volume minimum spécifié d’eau à travers un filtre à cartouche électropositive. Les volumes minimaux spécifiés pour les eaux de surface et les eaux traitées/souterraines sont respectivement de 300 L et de 1 500 L. L’une des principales limites de la méthode est la tendance des filtres à se boucher avant de répondre à l’exigence de volume d’échantillon. Des études utilisant deux options de filtre à cartouche différentes, mais équivalentes, ont montré que l’encrassement du filtre était un problème pour 10 % des échantillons avec l’un des types de filtres, contre 6 % avec l’autre type de filtre. Le colmatage a tendance à augmenter avec la turbidité, mais ne peut pas être prédit uniquement sur la base des mesures de turbidité. Du point de vue des coûts, l’une des options de filtre est préférable à l’autre, mais la qualité de l’eau et l’expérience du système d’eau à échantillonner doivent être prises en compte dans le choix des filtres.

Colmatage du filtre est un problème potentiel majeur qui peut être rencontré avec la méthode 1615. colmatage diminue le débit d'eau à travers le filtre. Dans certains cas, cela peut être surmonté par l'ouverture du robinet à soupape pour permettre un plus grand débit. Dans d'autres cas, le filtre va devenir complètement bouché avant que le volume requis est passé à travers lui. Le tableau 1 montre le pourcentage d'échantillons avec des volumes réduits en fonction du type de filtre, du type de l'eau, et de la turbidité. Colmatage se est produite avec des échantillons à la fois de l'eau souterraine et de l'eau de surface, avec le filtre à base de nanofibres d'oxyde d'aluminium surperforme le filtre à base d'amine quaternaire pour les échantillons d'eau souterraine alors que l'inverse était le cas pour les échantillons d'eau de surface. Dans l'ensemble, 6% des échantillons prélevés en utilisant le filtre à base d'amine quaternaire était déficiente dans le volume tandis que 10% des échantillons prélevés avec les filtres à base de nanofibres d'oxyde d'aluminium n'a pas respecté le volume minimum spécifié nécessaire en raison de l'obstruction. Dans genresl, colmatage augmentait avec la turbidité, mais un certain nombre de différents composants contribuent à la turbidité et certaines d'entre elles ne conduisent pas à l'encrassement. Par exemple, 43% de tous les événements survenus au cours de colmatage l'étude ICR se limitait à deux systèmes fluviaux (données non présentées). Au cours de l'ICR le volume cible minimum pour l'eau de surface est de 200 L. Le volume moyen recueillies au cours de l'étude était de 217 ± 32 L avec un volume médian de 208 L (données de la base de données d'accès de 18 mois ICR Aux1 datés 25/04/2000) . Ainsi, le volume complet peut être recueillis auprès de nombreuses eaux, même avec de hauts turbidité. L'ICR nécessaire échantillonneurs d'utiliser un préfiltre lorsque la turbidité étaient plus de 75 NTU, mais même avec un préfiltre, 34% des échantillons prélevés dans les eaux dont la turbidité de plus de 75 NTU bouché. Méthode 1615 recommande l'utilisation d'un préfiltre avec des eaux de plus de 50 NTU; Cependant, depuis la publication de la méthode de 1615, plusieurs options de préfiltre en plus à celles énumérées dans la méthode ont ététester. Aucun de ceux-ci conduit à une amélioration significative du volume de l'échantillon (données non présentées). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52067/52067fig1.jpg"> Figure 1. Filtre standard Appareil. L'appareil de filtre standard se compose d'admission, boîtier de filtre, et des modules de décharge (voir Matériaux supplémentaires pour une description de chaque module). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52067/52067fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Total des échantillons A </td><td> Nombre d'échantillons déficients b </td><td> Pourcentage échantillons déficients </td><td> Turbidité (NTU) </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> Les eaux souterraines utilisant NanoCeram Filtres c </td></tr><tr><td> 113 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> l'eau de surface en utilisant des filtres de NanoCeram c </td></tr><tr><td> 83 </td><td> 12 </td><td> 14 </td><td> &lt;20 d </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 50 </td><td> 20 - &lt;50 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 83 </td><td> ≥ 50 d </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="230px" style="text-align:center"> Total NanoCeram c </td></tr><tr><td> 210 </td><td> 22 </td><td> 10 </td><td> ≥ 0 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> Les eaux souterraines utilisant 1MDS Filtres c </td></tr><tr><td> 374 </td><td> 75 </td><td> 20 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr>ext-align: center "&gt; eau de surface en utilisant 1MDS Filtres c </tr><tr><td> 2693 </td><td> 27 </td><td> 1 e </td><td> &lt;20 e </td></tr><tr><td> 505 </td><td> 36 </td><td> 7 f </td><td> 20 - &lt;50 f </td></tr><tr><td> 122 </td><td> 19 </td><td> 16 e </td><td> 50 - &lt;75 g </td></tr><tr><td> 175 </td><td> 60 </td><td> 34 e, f </td><td> ≥ 75 e, f, g </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="240px" style="text-align:center"> Total des 1MDS c </td></tr><tr><td> 3869 </td><td> 217 </td><td> 6 </td><td> ≥ 0 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. la capacité de filtre un échantillons sont des études suivantes à partir de laquelle les données de volume et de turbidité sont disponibles:. 1) étude de l'EPA (ICR de données provenant de la base de données d'accès de 18 mois ICR Aux1 du 4/25/2000), 2) l'étude EPA des eaux souterraines 8, 3) EPA-Laurent et Lowell, l'étude MA (données non publiées), 4) une étude EPA fleuve Mississippi (données non publiées), 5) étude EPA potable de l'usine de traitement de l'eau (données non publiées), 6) Méthode EPA 1615 étude d'évaluation 25, et 7) les trois premiers mois de la surveillance UCMR3 (données non publiées). échantillons B où le filtre bouché avant que le volume minimum d'eau spécifié pour chaque étude ont été recueillis. Ce était de 200 L pour les eaux de surface et 1500 L pour les eaux souterraines, mais était de 200 L pour les eaux de source qui étaient souterraine sous l'EPA ICR et 1893 L pour l'étude des eaux souterraines EPA. C La capacité de recueillir la pleine volume minimum spécifié est significativement différent pour échantillons prélevés à l'aide de filtres et NanoCeram 1MDS (P = 0,002) et entre les eaux de surface et des eaux souterraines à la fois globale (P &lt;0,001) et pour chaque type de filtre (P &lt;0,001) en utilisant le test de Mann-Whitney Rank Sum. d &amp; #8211; groupes G avec la même valeur en exposant sont significativement différentes (P &lt;0,05) selon le Kruskal-Wallis Une Analyse de variance sur le test des rangs et Pairwise méthode des comparaisons multiples de Dunn. Pour tous les tests statistiques la variable dépendante est le volume ayant traversé le filtre comme une fraction du volume minimum spécifiée, mais avec une valeur maximale de 1,0.

La méthode EPA 1615 utilise un filtre électropositif pour concentrer les entérovirus et les norovirus dans l’environnement et les eaux potables. Ce manuscrit décrit la procédure de collecte d’échantillons pour les analyses de la méthode 1615.

Méthode EPA 1615. Mesure de entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par Culture et RT-qPCR. I. Prélèvement des échantillons de virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

L’objectif général de cette procédure est de fournir une approche normalisée pour l’échantillonnage de l’environnement et de l’eau potable afin de détecter l’apparition de virus entériques, selon la méthode 1615 de l’EPA. Pour ce faire, il suffit d’abord d’assembler un appareil d’échantillonnage, de stériliser les modules d’admission et de boîtier de cartouche de l’appareil, puis d’ajouter de manière aseptique un filtre à cartouche électropositif stérile. Ensuite, un volume défini d’eau passe à travers un filtre électropositif contenu dans l’appareil d’échantillonnage.Ensuite, l’excès d’eau est évacué de l’appareil et du boîtier du filtre à cartouche, et le volume échantillonné est enregistré sur une fiche technique d’échantillon. Enfin, les composants de l’appareil d’échantillonnage sont emballés dans un conteneur d’expédition plus froid maintenu à une température de 1 à 10 degrés Celsius et livrés à un laboratoire d’analyse. En fin de compte, les entérovirus et les norovirus dans l’environnement et les eaux potables sont mesurés à l’aide de cette procédure d’échantillonnage dans le cadre d’une méthode globale.Cette procédure utilise un filtre électropositif pour concentrer les virus, certaines eaux potables environnementales. Il existe plusieurs autres types de filtres qui peuvent être utilisés pour effectuer cette procédure. L’un est l’ultra-filtre et l’autre est un filtre chargé négativement.L’avantage du filtre électro Posy par rapport au filtre ultra est que l’échantillonnage est environ deux fois et demie plus rapide. La collecte de virus à l’aide de filtres chargés négativement nécessite un ajustement du pH par l’ajout de sels. L’avantage de charger positivement les filtres est qu’aucun réglage n’est nécessaire avant le prélèvement de l’échantillon.En général, les personnes qui débutent dans cette procédure auront du mal à maintenir la stérilité et à faire face à des conditions inattendues, telles que l’absence d’un robinet pratique pour le prélèvement d’échantillons. La démonstration de la procédure aujourd’hui sera moi-même, sha out, Jennifer Cash dollar et Eunice VER oiese. Nous sommes tous des membres professionnels du personnel du National Exposure Research Laboratory de l’EPA à Cincinnati, dans l’Ohio.Pour préparer le prélèvement d’échantillons, assemblez un appareil de filtrage standard tel qu’illustré ici, composé d’un module d’admission, d’un module de boîtier de cartouche et d’un module de décharge, comme décrit dans les documents supplémentaires du protocole de texte. Utilisation des débits pour l’échantillonnage. Étalonnez le totalisateur de débit avant la première utilisation en connectant un module de refoulement à un module d’admission, puis en connectant le module d’admission à un robinet.Ouvrez complètement le robinet, puis utilisez le robinet à soupape en bronze pour régler le débit à 10 litres par minute. Une fois que le débit est stable à 10 litres par minute, réinitialisez le totalisateur du débitmètre pour lire le volume total. Ensuite, placez la sortie du module de décharge dans un cylindre gradué de quatre litres ou plus, et réinitialisez simultanément le totalisateur à zéro.Mesurez la lecture du totalisateur à la marque des quatre litres et à la minuterie nécessaire pour atteindre la marque des quatre litres sur la bouteille. Si la lecture du totalisateur est inférieure à 3,96 ou supérieure à 4,04 litres, calculez un facteur de correction nécessaire pour tenir compte de la différence observée. Par exemple, si le totalisateur du débitmètre indique 3,9 litres au repère de quatre litres sur le cylindre gradué, le facteur de correction serait de 1,026 ou quatre divisé par 3,9 Pour stériliser l’appareil de filtration standard et le préparer pour le prélèvement d’échantillons, utilisez de l’hypochlorite de sodium à 0,525 % pour immerger complètement les modules d’admission et de boîtier de cartouche et tremper pendant au moins 30 minutes.Vous pouvez également utiliser une pompe pour faire circuler la solution à travers les modules. Utilisez du DH stérile deux O pour rincer les modules, puis utilisez une solution stérile de 50 millilitres d’une molaire de thio sulfate de sodium par litre d’eau de qualité réactif stérile pour déchlorer pendant cinq minutes. Utilisez ensuite une feuille d’aluminium stérile pour couvrir l’appareil d’échantillonnage du filtre.Le module se termine de manière aseptique. Ajoutez un filtre à cartouche électropositif au module de boîtier de la cartouche en veillant à ce qu’il soit correctement installé. Dans les boîtiers, inscrire un numéro d’échantillon unique sur une feuille de données d’échantillon, puis apporter ou expédier l’appareil d’échantillonnage par filtre, la fiche de données d’échantillon et toutes les instructions nécessaires concernant le prélèvement de l’échantillon à la personne qui prélèvera l’échantillon de terrain À son arrivée sur le site de prélèvement et après s’être lavé les mains, porter des gants chirurgicaux à l’aube pour minimiser la contamination de l’échantillon.Changez fréquemment de gants, surtout après avoir touché des robinets d’eau et d’autres objets susceptibles d’être contaminés. À l’aide d’un tampon contenant de l’hypochlorite de sodium, stérilisez le robinet de l’appareil d’échantillonnage et les filetages intérieurs d’un tuyau d’arrosage. Consignez les informations pertinentes sur le suivi des échantillons sur une fiche technique d’échantillon, y compris l’identification du site et de l’échantillon, le nom de l’échantillonneur, les modèles d’équipement et les numéros de série.Fixez le tuyau d’arrosage au robinet. Placez la sortie du tuyau dans un endroit où l’eau peut être évacuée en toute sécurité, puis ouvrez l’eau. Tapotez pendant deux à trois minutes pour éliminer les débris qui se sont déposés dans la conduite.Connectez le module de décharge au module d’admission, puis connectez les deux au robinet d’eau. Connectez un tuyau d’arrosage à l’extrémité du module de décharge et placez l’extrémité libre dans le récipient en propylène d’un litre. Ensuite, ouvrez le robinet et faites passer au moins 75 litres de l’eau à échantillonner à travers l’appareil.Mesurer et consigner les paramètres suivants de la qualité de l’eau pendant la période de rinçage sur l’eau qui s’écoule dans le contenant de propylène, le pH résiduel du chlore, la température et la turbidité. Après avoir coupé l’eau au robinet, débranchez le module de décharge du module d’admission, puis connectez le module de boîtier de cartouche à la sortie du module d’admission et le module de décharge à la sortie du module de boîtier de cartouche. Réinitialisez ensuite la lecture du totalisateur à zéro.Pour commencer la collecte d’échantillons sur le terrain. Enregistrez la lecture initiale du totalisateur ainsi que la date et l’heure, puis ouvrez lentement le robinet d’eau. Assurez-vous que le boîtier de la cartouche est en position verticale et qu’il se remplit complètement d’eau.Maintenant, ouvrez complètement le robinet et utilisez le robinet à soupape en bronze pour régler le débit à 10 litres par minute avant d’enregistrer le débit initial. À l’aide des relevés du totalisateur, faites passer 300 litres d’eau de surface ou 1500 à 1800 litres d’eau souterraine à travers l’appareil. Observez le débit lorsque le volume de l’échantillon approche de la fin de la période d’échantillonnage, puis coupez le débit d’eau au robinet d’échantillonnage et notez le débit final, la date, l’heure de la journée, la lecture finale du totalisateur et le volume total de l’échantillon.Débranchez l’appareil d’échantillonnage du filtre du robinet. Déconnectez le module de boîtier de la cartouche des autres modules. Retournez les boîtiers du filtre et laissez l’excès d’eau s’écouler jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’eau qui s’écoule des orifices d’entrée et de sortie.Retournez le boîtier à la verticale et utilisez une feuille stérile pour couvrir les raccords rapides à chaque extrémité. Placez le boîtier dans un ou plusieurs sacs en plastique refermables. Vidangez l’eau des modules d’admission et de refoulement.Placez les modules dans un ou plusieurs sacs en plastique refermables pour préparer les échantillons à l’expédition. Placez les modules de l’appareil d’échantillonnage du filtre dans une glacière de stockage et de transport isolée. Ajoutez des blocs réfrigérants congelés ou des glaçons en double sac dans la glacière de stockage et de transport pour vous assurer que l’échantillon reste entre un et 10 degrés Celsius.Pendant l’expédition. Remplissez tout espace vide avec du matériel d’emballage, puis placez la fiche technique de l’échantillon dans un sac en plastique refermable et placez-la sur le matériau d’emballage. Fermez le stockage isotherme et le transport du coffre de transport, ou expédiez l’échantillon au laboratoire d’analyse.Si le coffre doit être expédié, scellez-le avec du ruban adhésif pour éviter les fuites. S’assurer que l’échantillon arrive au laboratoire d’analyse au plus tard 24 heures après le début de la collecte sur le terrain. Le colmatage du filtre est un problème potentiel majeur qui peut être rencontré avec la méthode 1615 car elle diminue le débit d’eau.Ce tableau indique le pourcentage d’échantillons dont le volume est réduit en fonction du type de filtre, du type d’eau et de la turbidité. Lors du filtrage d’échantillons d’eau souterraine, le filtre contenant des fibres nano Illumina a surpassé un filtre à base d’amines quaternaires. Le filtre à base d’amines arytiques était meilleur pour filtrer les échantillons d’eau de surface.Dans l’ensemble, 6 % des échantillons prélevés à l’aide du filtre basé sur la moyenne quaternaire étaient insuffisants en volume. Alors que 10 % des échantillons collectés avec de l’oxyde d’aluminium, les filtres à base de nanofibres n’ont pas atteint le volume minimum spécifié requis en raison du colmatage. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des conditions stériles.Ce n’est que la première procédure d’une méthode globale. Cette procédure sera suivie d’une élution par filtre, d’une concentration secondaire et d’essais tels que le virus culturel total, un essai et des essais moléculaires. Ces derniers tests sont nécessaires pour mesurer l’occurrence et la concentration du virus.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de prélever des échantillons de virus dans l’environnement et les eaux potables. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes viraux peut être dangereux et que vous devez toujours prendre des précautions telles que l’utilisation de gants lors de l’exécution de cette procédure.

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Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

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