Slice It Hot: aiguë cerveau adulte trancher dans physiologique Température

L’objectif global de cette procédure est de produire des coupes cérébrales aiguës de haute qualité. Ceci est accompli en extrayant d’abord le cerveau de l’animal. La deuxième étape consiste à disséquer la région cérébrale d’intérêt et à l’attacher à l’étape de tranchage tout en la gardant humide avec une solution de tranchage.

Ensuite, le cerveau est immergé dans une solution de tranchage de température physiologique. La dernière étape est le tranchage viome du cerveau. En fin de compte, les tranches peuvent être utilisées dans diverses expériences électrophysiologiques in vitro.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le tranchage à froid glacé, est qu’elle est plus simple et produit des résultats supérieurs. En général, quiconque est nouveau dans cette méthode aura du mal car elle exige que toutes les étapes soient menées en douceur et rapidement sans retards inutiles. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons eu besoin d’obtenir des tranches nucléaires cérébelleuses de haute qualité à partir d’animaux adultes.

La méthode sera démontrée par Le Anri, étudiant dans notre laboratoire avant de commencer cette procédure. Assurez-vous que l’outil, les outils et les solutions sont préparés à l’avance. Le tableau 1 montre la composition de la solution physique standard dans laquelle le cerveau sera coupé après la préparation de la solution de travail SPS.

Selon le protocole écrit, équilibrez la solution avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 minutes, tandis que les équilibres SPS organisent les outils nécessaires au tranchage. Cette figure montre la disposition des outils utilisés pour le découpage cérébral et peut être utilisée comme référence visuelle lors de la configuration de la clé pour identifier chaque élément contenu dans le protocole écrit. Une fois l’équilibrage de la solution de travail du SPS terminé, ajoutez deux millilitres d’une molaire de chlorure de calcium au SPS, puis décantez environ 300 millilitres de la solution dans un bécher.

Placez le bécher contenant le SPS sur une plaque chauffante ou dans un bain-marie pour chauffer à 36 degrés Celsius. Si un appareil de chauffage est utilisé, assurez-vous d’inclure une barre d’agitation magnétique et assurez-vous que la solution ne surchauffe pas, car cela provoquerait une précipitation de fer et rendrait la solution inutilisable. Ensuite, faites bouillir environ 500 millilitres d’eau purifiée dans une bouilloire électrique et ajoutez-les dans un bécher contenant 300 millilitres d’eau purifiée fraîche pour obtenir une eau légèrement plus chaude que 36 degrés Celsius après avoir anesthésié et décapité la souris.

Selon les protocoles approuvés par l’établissement, la tête est rincée de l’excès de sang dans le gobelet d’eau chauffée. Ensuite, utilisez de petits ciseaux pour exposer le foram et le magnum du crâne et tirez la peau vers l’arrière pour exposer le crâne et mieux visualiser les sutures du crâne pour ouvrir le crâne. Insérez la pointe des petits ciseaux dans l’avant-bras et le magnum.

Tournez-les immédiatement vers le côté latéral et coupez doucement le long du rebord latéral de l’os pariétal jusqu’à un emplacement derrière les yeux et la suture pariétale frontale. Tournez ensuite les ciseaux vers le centre du crâne et coupez sur la ligne médiane de l’autre côté du crâne. Ce schéma montre le schéma complet des incisions pour ouvrir le crâne.

Maintenant, utilisez des pinces fines pour soulever le crâne du coin pariétal frontal et tirez-le vers le haut en diagonale pour exposer le cerveau, transférez le cerveau et le crâne restant dans une boîte de Pétri contenant du gast chaud. SPS. Ensuite, utilisez un scalpel et une spatule pour détacher la région d’intérêt du reste du cerveau. Ici, une seule incision est pratiquée à travers le mésencéphale et le pont pour détacher le cervelet.

La ligne rouge sur ce schéma illustre l’emplacement de la coupe. Rincez le cervelet en le plaçant dans une deuxième petite boîte de Pétri contenant du SPS gazeux chaud. Transférez ensuite le cervelet sur un morceau de papier filtre humide.

Utilisez un scalpel pour couper le tronc cérébral du cerveau afin de former une base droite et large à coller sur l’étape de coupe. La ligne bleue sur ce schéma montre la zone qui sera chère à l’étape de coupe. Enfin, remettez le cervelet coupé dans la petite boîte de Pétri contenant du gaz chaud SPS, puis procédez au tranchage.

Tout d’abord, assurez-vous que l’étape de coupe est sèche, puis appliquez une petite goutte de colle cyanoacrylate au milieu de l’étape. Ensuite, utilisez une sula pour soulever le bloc cérébral du SPS et tamponnez avec un petit morceau de papier filtre pour éliminer tout excès de liquide du cerveau. Une fois l’excès de liquide éliminé, faites glisser le cerveau de la spatule sur la goutte de colle en un seul mouvement.

Utilisez ensuite des pâtes pour animaux de compagnie pour appliquer quelques gouttes de SPS sur le cerveau. Placez l’étape de coupe avec le cerveau attaché dans la chambre de tranchage. Alignez le bloc cérébral de manière à ce que le cortex cérébelleux soit face à la lame.

Cela garantit que la région d’intérêt est soumise au moins de pression mécanique avant d’être tranchée. Maintenant, commencez à couper le cerveau à l’aide du microtome selon les instructions du fabricant, tout en gazant constamment le SPS dans la chambre de coupe tout au long de la procédure de tranchage. Maintenez la température de la chambre de coupe entre 34 et 37 degrés Celsius en remplissant la chambre externe avec de l’eau purifiée réchauffée.

Pendant le tranchage, soutenez délicatement chaque tranche avec une brosse douce pour éviter qu’elles ne se plient. Essayez de ne pas toucher la zone d’intérêt et ne laissez pas la brosse toucher la lame du vibromasseur car cela endommagerait la lame. À l’aide d’une pipette à pâtes en verre poli au feu à large ouverture, transférez chaque tranche de la chambre de tranchage vers une chambre de stockage contenant du SPS gazé en continu et maintenez-la à 36 degrés Celsius.

Assurez-vous que le gazage n’entraîne pas de petites bulles piégées dans la chambre qui pourraient endommager les tranches une fois que le cerveau a été entièrement tranché. Laissez les tranches reposer immergées dans la chambre de maintien à 34 à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure avant de commencer l’expérience. Cela permet la dégradation des tissus endommagés et mourants, ce qui permet d’obtenir une surface de tranche plus propre.

Une fois l’heure écoulée, laissez la température de la chambre de récupération refroidir à température ambiante. Les tranches sont maintenant prêtes à être utilisées pour des expériences. Cette image montre une tranche cérébelleuse horizontale obtenue avec la méthode démontrée.

Les trois couches principales du cortex cérébelleux sont indiquées. GC est la couche de granulés. PC indique la couche cellulaire du bikini et ml.

La couche moléculaire de matière blanche est étiquetée WMA L’électrode de patch clamp est schématiquement dessinée sur une cellule GOGI, abrégée GOC. La barre d’échelle représente 40 microns. Il s’agit d’un exemple d’enregistrement de la cellule GOGI précédemment montré.

L’enregistrement a été obtenu à l’aide d’une électrode patch clamp. En mode pince de courant. La couleur noire est une trace représentative sur six traces grises.

Ici, une coupe corticale cérébrale coronale obtenue avec la méthode démontrée est présentée. Les cellules paramétalliques corticales sont illustrées avec un dessin schématique d’une électrode patch clamp. Il s’agit d’un exemple d’enregistrement de patch clamp.

En mode de pince actuel de la cellule paramétallique montrée dans l’image précédente, la trace montre le comportement typique d’une cellule paramétallique corticale. Veuillez faire attention pendant cette procédure à surveiller constamment la température.