Visualisation non-lytique exocytose de Cryptococcus neoformans À partir de macrophages au moyen de Digital microscopie optique

L’objectif global de cette procédure est de visualiser l’exocytose non litique de Cryptococcus neoformans à partir de macrophages de neurones primaires de la moelle osseuse. Ceci est accompli en plaquant et en infectant d’abord les macrophages neurologiques activés avec des cellules fongiques pour permettre la phagocytose et l’internalisation de la xeomine. La deuxième étape consiste à éliminer les cellules fongiques extracellulaires pour assurer une monocouche claire de macrophages infectés et non infectés.

Ensuite, les macrophages sont incubés dans une chambre à température contrôlée de dioxyde de carbone et enregistrés pendant 24 heures afin de capturer les cas d’exocytose non litique et d’autres interactions. La dernière étape consiste à créer un film en compressant toutes les images réalisées sur une période de 24 heures. En fin de compte, la visualisation des macrophages par microscopie optique numérique est utilisée pour observer la variété des types d’exocytose non litiques que subissent les macrophages tout au long d’une infection de 24 heures.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’interaction hôte-pathogène, telles que le moment et la quantification des événements cellulaires. La veille de l’expérience, sélectionnez la colonie d’un contremaître principal qui a été cultivée sur une plaque de gélose sbarro et inoculez 10 millilitres de bouillon sbarro. Laissez la culture croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius, en secouant à une vitesse de 250 tr/min après l’euthanasie des souris comme décrit dans le protocole écrit.

Stérilisez tout le corps avec de l’alcool éthylique à 70 %. Retirez les fémurs et le tibia et placez les os dans des duos stériles, un milieu d’aigle modifié ou DMEM. Ensuite, retirez l’excès de tissu et de muscle à l’aide de lingettes délicates jusqu’à ce que les os soient complètement propres.

Placez uniquement les os intacts dans une boîte de Pétri contenant de l’alcool éthylique à 70 % et incubez pendant trois minutes pour tuer les micro-organismes associés. Retirez les arêtes et placez-les dans une boîte de Pétri avec du DMEM stérile. Ensuite, coupez soigneusement les extrémités des os.

Tenez l’os au-dessus d’un tube conique MT de 50 millilitres placé sur de la glace et utilisez une aiguille de calibre 25 pour rincer soigneusement 10 millilitres de DMEM froid à travers chaque os. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire collectée à température ambiante pendant 10 minutes à 650 fois G.Au cours de cette centrifugation, préparez et filtrez les milieux d’alimentation de macrophages de la moelle osseuse comme décrit dans le protocole de texte. Ensuite, remettez en suspension la palette obtenue avec 10 millilitres de milieu d’alimentation.

Faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 micromètres pour perturber les amas cellulaires et éliminer les gros débris. Ensuite, plaquez un millilitre de suspension de cellules de souche dans 10 millilitres de milieux d’alimentation, des boîtes de Pétri spécifiées pour une utilisation en culture tissulaire. Laissez les cellules adhérer à 37 degrés Celsius avec 10 % de dioxyde de carbone pendant sept jours.

Changer le milieu d’alimentation comme décrit dans le protocole textuel la veille de l’expérience. Détachez les macrophages de la plaque en retirant le milieu d’alimentation et ajoutez cinq millilitres d’un réactif de décapage cellulaire doux à la plaque après l’incubation des cellules pendant cinq à 10 minutes. À 37 degrés Celsius, retirez les macrophages à l’aide d’un pipetage doux.

Granulez les cellules par centrifugation à 650 fois G pendant 10 minutes avant de plier à nouveau la pastille dans un millilitre de milieu d’alimentation. À l’aide d’une dilution de un à 20, calculez la concentration des macrophages en pipetant 10 microlitres de suspension cellulaire dans un hémocytomètre à l’aide d’un fond de verre de 14 millimètres. Les boîtes de Pétri placent une concentration de un fois 10 à cinquième macrophages directement dans le puits intérieur, qui contient un maximum de 200 microlitres.

Veillez à ne pas dépasser ce volume. Laissez les cellules adhérer à la boîte de Pétri en verre en plaçant les plats dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ajoutez ensuite un à deux millilitres de milieu d’alimentation complété par du lipopolysaccharide à raison d’un milligramme par millilitre et de l’interféron gamma.

À raison de 500 unités par millilitre, laissez les cellules incuber pendant la nuit le jour de l’expérience. Retirez un millilitre d’une culture de cellules G inoculée pendant la nuit et palpez les cellules de levure par centrifugation pendant cinq minutes de 420 fois G.To retirez les milieux et les produits cryptococciques extracellulaires, lavez les cellules trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS suivie d’une centrifugation comme précédemment. Après la réanimation, mettez en suspension la pastille de cellules de levure dans un millilitre de PBS stérile et faites une pipette de dilution de un à 100 microlitres de dilution dans un hémocytomètre et comptez les cellules.

Calculez la concentration de cellules de levure nécessaire pour une multiplicité d’infection de un à cinq. Ajoutez le volume calculé de suspension de cellules cryptococciques à un millilitre de milieu d’alimentation avec l’anticorps monoclonal, 18 B sept à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Incuber la suspension cellulaire à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, retirez le milieu d’alimentation de la boîte de Pétri en verre et lavez les macrophages une fois avec du PBS stérile. Ajoutez ensuite 100 microlitres d’opsonize cmin directement dans le puits, suivi d’une incubation avec la levure pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 10 % de dioxyde de carbone. Après la co-incubation, il a été vérifié au microscope que les macrophages ont internalisé c eForms pour être considérés comme internalisés, les cellules cryptococciques doivent être clairement visibles dans les limites du macrophage, comme l’indique la grande pointe de flèche.

La pointe de la flèche plus petite indique un macrophage non infecté sans cellules fongiques. Lavez la boîte de Pétri trois fois avec du PBS stérile pour éliminer tous les c néoformanes extracellulaires. Ajoutez ensuite un à deux millilitres de milieu d’alimentation sans l’anticorps monoclonal pour réaliser ces expériences.

Avant l’expérience, il est nécessaire de disposer d’un microscope équipé d’une chambre d’incubation qui comprend l’administration de dioxyde de carbone et d’une unité de chauffage. Préchauffez la chambre d’incubation pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius. Assurez-vous que l’unité de dioxyde de carbone indique 5 % au début de l’expérience.

Placez la boîte de Pétri à fond de verre sur le couvercle de la plate-forme du microscope avec un dioxyde de carbone allumé et fermez toutes les portes pour vous assurer qu’aucune chaleur ne s’échappe à l’aide de l’objectif 10 x avec le microscope en contraste de phase, concentrez-vous sur un champ clair de macrophages infectés, configurez le logiciel du microscope pour prendre une image toutes les quatre minutes pendant une période de 24 heures. Après 24 heures, l’expérience sera terminée et un total de 361 images auront été collectées. Exportez ces images au format JPEG avec une compression de 5 %.

À l’aide du logiciel image J, visualisez les images sous forme d’une pile visuelle à cinq images par seconde. La première image du film montre de nombreux macrophages dans tout le champ, certains ne sont pas infectés et d’autres ont des quantités variables de cellules cryptococciques. Au fur et à mesure que le film progresse, les cellules sont toutes mos et on peut les voir se déplacer sur le terrain dans ce film, il est clair que les cellules cryptococciques sont dans les limites d’un macrophage infecté.

Le macrophage devient agité et une cellule de levure peut être vue, mais à l’intérieur de la zone FGA, les cellules cryptococciques sont ensuite rapidement éliminées dans l’environnement environnant. Un deuxième macrophage infecté subit une exocytose non litique et d’autres cellules de levure sont libérées dans l’espace extracellulaire. Les cellules hôtes restent viables après l’exocytose cryptococcique, comme l’indique leur capacité à continuer à se déplacer.

À l’occasion, les macrophages interagissent de manière à faciliter le transfert de cellules cryptococciques entre les cellules hôtes. Les cellules de levure ne sont pas exposées à l’environnement extracellulaire et les cellules hôtes restent viables. Dans ce film, deux macrophages infectés créent des ponts de cellule à cellule à deux occasions distinctes pour transporter les cellules cryptococciques d’un macrophage à un autre.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microscopie optique numérique pour visualiser les macrophages subissant une exocytose non lytique et d’autres interactions hôte-pathogène.