Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune Aedes aegypti

L’objectif général de cette procédure est d’observer les réponses des neurones gustatifs chez les insectes et de mesurer l’expression des gènes dans les tissus gustatifs. Ceci est accompli en enregistrant d’abord les réponses de poils gustatifs spécifiques à plusieurs goûts à différentes concentrations. La deuxième étape consiste à disséquer soigneusement les tissus gustatifs.

Séparez ensuite les échantillons par sexe et appendice. Ensuite, isolez l’ARN total de chaque échantillon de tissu et créez des préparations de CD NA pour le séquençage de nouvelle génération et le QPCR. La dernière étape consiste à analyser les données d’expression génique et à formuler des hypothèses, telles que la façon dont les gènes sensoriels de chimiothérapie exprimés médient les réponses physiologiques aux goûts chez les insectes.

En fin de compte, les enregistrements électrophysiologiques sont utilisés pour montrer la plage réceptive du système gustatif de l’insecte et le séquençage de l’ARN du tissu gustatif est utilisé pour mettre en évidence les composants génétiques les plus importants de la réception gustative. En général, les personnes qui ne connaissent pas ces méthodes auront du mal à cause de la petite taille de la chimiothérapie des insectes. Appendices sensoriels.

Qu’il s’agisse de dissection ou d’enregistrement à partir de petits organes d’insectes, la pratique chez les patients sont les clés de la maîtrise de ces techniques. Pour commencer cette procédure, tirez une électrode d’enregistrement à pointe mince dans un extracteur de pipette avec un capillaire en verre sous le microscope de dissection. Cassez soigneusement la pointe de l’électrode de sorte que son ouverture soit suffisamment large pour envelopper le centum cible, mais suffisamment petite pour éviter d’entrer en contact avec les structures voisines.

Ensuite, anesthésez deux à quatre insectes adultes dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 20 secondes. Après cela, immobilisez l’un des insectes à l’aide d’une lamelle avec de petites bandes de ruban adhésif en cellophane. Sous le microscope.

Identifiez le sens cible par sa morphologie et sa position et orientez l’animal pour permettre un accès libre à celui-ci depuis l’angle d’entrée des électrodes. Insérez ensuite un fil de tungstène dans son thorax dorsal. Pour servir d’électrode de terre, remplissez l’électrode en verre de l’extrémité avec une solution stimulante d’intérêt.

Évacuez les bulles d’air tout en maintenant la pointe vers le bas. Insérez un fil d’argent dans l’électrode pour servir d’électrode d’enregistrement et de stimulation. Après cela, connectez les électrodes à un préamplificateur, ce qui permet de réduire le temps de stabilisation pour capturer l’activité neuronale.

Le préamplificateur est connecté à un ordinateur équipé d’un logiciel d’enregistrement de pointes pour collecter, stocker et analyser les signaux électriques. Stimulez maintenant le centum avec une solution de contrôle pour assurer sa fonctionnalité. Comptez les pics commençant 200 millisecondes après l’artefact de stimulus.

Pour obtenir les résultats dose-réponse. Exposer le centum à des concentrations croissantes du produit chimique expérimental et laisser un intervalle d’au moins trois minutes entre les stimulations pour assurer une récupération adéquate. Dans cette procédure, préparez une glacière peu profonde avec de la glace sèche.

Pour les tubes de prélèvement de tissus, étiquetez les tubes à pression sans ARN de 1,5 millilitre pour le prélèvement de différents types de tissus. Gardez les tubes fermés pour éviter une condensation excessive. Ensuite, anesthésez 30 à 40 moustiques dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 15 à 30 secondes.

Transférez ensuite les moustiques anesthésiés à un stade froid et triez-les par sexe. Retournez les insectes côté dorsal vers le bas en saisissant leurs ailes, en faisant attention de ne pas endommager les appendices gustatifs. À l’aide d’un microscope à dissection, disséquez l’étiquette appariée Bella ou tarses des mâles ou des femelles en saisissant doucement le moustique pro Bois juste à proximité de l’étiquette.

Bella avec une paire de pinces pour exposer le stylet intérieur et retirer l’étiquette avec l’autre paire de pinces. Placez ensuite le tissu dans le tube de prélèvement froid pour le tissu tarsien. Saisissez doucement la patte du moustique à la jonction du tibia et du premier segment tarsien, et retirez les tarses.

Placez ensuite le tissu dans le tube étiqueté à froid. Faites tourner les tubes de collecte pendant une minute dans une centrifugeuse à zéro degré Celsius à 9 000 fois la gravité pour maintenir le tissu au fond du tube. Si de l’humidité s’accumule dans les tubes de prélèvement pendant la dissection, ajoutez 50 microlitres de réactif de triol froid pour couvrir et protéger le tissu collecté.

Congelez les tubes dans le support de tubes de 1,5 millilitre contenant de l’azote liquide. Après cela, préparez les pilons sans ARN bien ajustés en les refroidissant sur de la glace sèche avant la rupture des tissus. Ensuite, broyez le mouchoir en poudre fine et répétez une fois de plus.

Amenez le volume total de triol à un millilitre et réusez. Suspendez le tissu broyé par vortex. Après cela, ajoutez 200 microlitres de chloroforme au tissu broyé et mélangez soigneusement.

Après cinq minutes à température ambiante, faites-le tourner dans la centrifugeuse à quatre degrés Celsius à 11 000 fois la gravité pendant 15 minutes. Ajoutez délicatement la couche aqueuse directement dans une colonne de filtre d’ADN génomique. Ensuite, faites-le tourner à 11 000 fois la gravité pendant cinq minutes.

Ajouter un volume égal d’ARN sans éthanol à 70 % dans le flux et mélanger par pipetage. Transférez le liquide dans une colonne de collecte d’ARN et poursuivez l’extraction de l’ARN. Après cela, quantifiez et évaluez la pureté de l’ARN total sur un spectrophotomètre de précision et procédez à n’importe quelle méthode de séquençage de l’ARN standard.

Les enregistrements de traces de potentiels d’action de l’illa gustative E GTI d’aide démontrent l’efficacité de la stimulation directe avec la gamme de produits chimiques. Cette technique peut être utilisée pour quantifier les réponses à n’importe quel produit chimique stimulant en comptant les pics d’une amplitude et d’une durée données sur une plage de temps raisonnable de moins de 500 millisecondes. Ces trois pointes correspondent à trois sous-types de neurones sensoriels avec des sensibilités différentes.

Les réplicats biologiques pour les ensembles de données RNA-Seq peuvent être limitées par le coût ou la difficulté de la collecte de tissus. Q-R-T-P-C-R offre la possibilité de valider de petits sous-ensembles de l’expression génique totale à moindre coût et nécessite moins de source. L’ARN montré dans le panneau de gauche, côte à côte, est une comparaison entre l’expression relative déterminée par RN Aeq et l’expression relative déterminée par Q-R-T-P-C-R.

Ces deux méthodes reposent sur des chimies différentes pour l’estimation de l’abondance des gènes. Les fonctions d’équivalence statistique affichées graphiquement dans le panneau de droite montrent les limites de la certitude dans chaque cas. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer les tissus d’insectes pour l’isolement de l’ARN et d’enregistrer les signaux neuronaux des poils gustatifs d’insectes vivants.