Isoler Potentiated Hsp104 Variantes utilisant de la levure Proteinopathy modèles

Le but de l’expérience suivante est de cribler les banques HS P 1 0 4 pour la sélection de variantes qui suppriment la toxicité des protéines associées aux troubles de mauvais repliement des protéines. Ceci est réalisé en cotransformant des banques de variants HSP 1 0 4 avec un substrat associé à une maladie dans la levure et en exprimant les deux protéines dans un second temps. Les levures sélectionnées sont traitées avec cinq acides fluorutiques ou cinq FOA pour contrer la sélection du plasmide HSP 1 0 4.

Ensuite, les hits sont séquencés en amplifiant la région mutagène par PCR de colonie ou en identifiant les mutations du gène HSP 1 0 4. En fin de compte, la suppression de la toxicité du substrat associé à la maladie peut être évaluée pour identifier les variants HS P 1 0 4 qui sont les plus prometteurs pour une caractérisation plus approfondie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les sélections basées sur la liaison, est qu’elle permet de sélectionner des variantes qui suppriment la toxicité du substrat associé à la maladie.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du repliement des protéines en identifiant les protéines qui peuvent inverser le mauvais repliement des protéines. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la potentialisation de HS P 1 0 4, elle peut également être appliquée au criblage de bibliothèques de n’importe quelle protéine pour la suppression de la toxicité de tout substrat toxique chez la levure. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à le faire, car de nombreuses colonies devront peut-être être dépistées pour trouver des résultats valides. Pour dépister la suppression de la toxicité de la protéa, commencez par laver les colonies HSP 1 0 4 des plaques avec un milieu de chute enrichi en raffinose, une pipette sérologique et du bois stérile et les applicateurs transfèrent les lavages liquides dans un tube conique de 50 millilitres et agitez soigneusement les colonies pour séparer les amas cellulaires.

Ensuite, diluez la suspension cellulaire en une culture légèrement trouble et cultivez les cellules pendant la nuit dans un milieu de décrochage Raffinose en secouant à 30 degrés Celsius. Cultivez les HSP 1, 0, 4 de type sauvage et les contrôles vectoriels en parallèle à ce moment-là également. Le matin suivant, une gamme de concentrations cellulaires sur des plaques individuelles de galactose pour générer au moins une plaque par groupe avec des colonies uniques.

Normaliser les cultures de vecteur et de type mondial HSP 1 0 4 à la DO 600 de la bibliothèque et de la plaque. Volumes égaux de ces cellules aux concentrations de souches expérimentales pour comparer la croissance de la bibliothèque par rapport aux témoins afin d’évaluer la sélection. La rigueur consiste également à placer la bibliothèque sur un milieu de répression du glucose, puis à incuber toutes les plaques pendant deux à trois jours à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies semblent utiliser cinq FOA pour la sélection des cellules, qui ne maintiennent plus les plasmides exprimant HSP 1 0 4 et qui s’étendent ensuite sur les colonies simples de chaque souche en double sur des plaques de milieu de chute doubles et simples par incubation nocturne à 30 degrés Celsius.

Ces plaques seront utilisées pour le séquençage ultérieur afin d’éviter que les plaques ne se dessèchent. Enveloppez les plaques SD Hiss Euro dans un film para et installez-les à quatre degrés Celsius tout en effectuant l’écran à cinq FOA. Ensuite, striez les colonies des plaques de sifflement SD aux colonies simples sur cinq plaques FOA pour une incubation d’un à deux jours à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies uniques apparaissent. Prochain.

À partir de chaque cinq plaques FOA, sélectionnez et soyez. Trois colonies survivantes sur un SD Euro et un SD sa plaque par colonie survivante après un à deux jours d’incubation à 30 degrés Celsius. Les colonies qui ont perdu le plasmide HSP 1 0 4 se développeront sur des plaques SD sifflantes, mais pas sur des plaques SD Euro.

Cultivez ces souches jusqu’à saturation dans un substrat de décrochage raffinose en 96. Puits profond de deux plaques de millilitres pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec agitation. Ensuite, pour éliminer les faux positifs, effectuez un test de repérage.

Vers la fin de l’incubation, une pipette multicanaux permet d’aliquoter 200 microlitres de milieu de chute de raffinose par puits vers une nouvelle plaque à 96 puits réservant les colonnes un et sept pour les cultures nettes. Ensuite, aliquote 250 microlitres de chacune des 16 cultures saturées dans les colonnes un et sept de la plaque et diluer en série les cultures cinq fois dans chaque colonne de la plaque, en mélangeant soigneusement avec la pipette multicanaux. Ensuite, pour assurer un repérage uniforme, retirez 50 microlitres de la culture diluée des colonnes six et 12 pour vous assurer que le volume final de chaque puits est de 200 microlitres.

Ensuite, utilisez un outil réplicateur de 96 volts pour repérer les cultures en double sur les plaques de sifflement SD et de sifflement escal. Après une incubation de deux à trois jours à 30 degrés Celsius, sélectionner pour le séquençage les souches qui présentent une toxicité sur les plaques de sifflement de l’escalan. Semblable à celui des témoins, les souches faussement positives, qui ne sont pas aussi toxiques que les témoins, peuvent être jetées.

Jetez également les souches qui présentent un défaut de croissance sur le sd. Ses plaques ou qui présentent une toxicité nettement plus élevée que le substrat de la maladie seul. Pour séquencer les variantes HSP 1, 0, 4 par PCR de colonie, grattez d’abord environ 10 microlitres de levure des plaques SD Hiss Euro en trois microlitres de 20 millilitres d’hydroxyde de sodium dans des tubes dénudés par PCR pour allonger les cellules par congélation et décongélation.

Placez d’abord les bandes dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Après 10 minutes au congélateur, incubez les tubes à 99 degrés Celsius dans le thermocycleur pendant 10 minutes, puis diluez les souches à 100 microlitres avec de l’eau de qualité PCR en utilisant une concentration d’amorce élevée. Ensuite, exécutez un programme PCR standard sur les échantillons, puis analysez les échantillons par électrophorèse agel pour confirmer l’amplification d’un produit PCR de taille appropriée.

Enfin, séquencez les produits de PCR en prenant soin de bien analyser les chromatogrammes de séquençage pour détecter les mutations. Les mutations peuvent être observées sous la forme d’un mélange de deux nucléotides à un site donné, car les levures hébergent souvent plusieurs plasmides. Dans cette expérience représentative, après la construction d’une bibliothèque de variants HSP 1 0 4 randomisés dans le domaine intermédiaire, la banque a été transformée en levure hébergeant un plasmide pour l’expression de TDP 43 inductible par le galactose.

Les transformants ont ensuite été récupérés et placés sur des plaques de glucose et de galactose afin d’évaluer la rigueur de l’écran. Après cinq tests de repérage de traitement FOA d’un sous-ensemble des variants sélectionnés lors du dépistage initial. Indique que sur les quatre colonies sélectionnées, deux présentaient une suppression de la toxicité de la TDP 43 par HSP 1 0 4.

L’un d’eux était faussement positif et l’autre présentait une toxicité accrue. Après cinq traitements FOA, les deux vrais résultats ont ensuite été séquencés par PCR de colonie pour identifier les mutations du domaine intermédiaire. Ces mutations HS P 1 0 4 peuvent ensuite être produites dans le plasmide parental HSP 1 0 4 par mutagenèse dirigée pour confirmer leur suppression de la toxicité Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour dépister jusqu’à 200 résultats à la fois dans les cinq FO, une étape sur une à deux semaines si elle est effectuée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’analyser soigneusement les résultats du séquençage car des mélanges de plasmides sont souvent obtenus à la suite de cette procédure. D’autres méthodes, comme la microscopie à fluorescence, peuvent être effectuées pour aider à répondre à des questions supplémentaires telles que : comment les variantes HSP 1, 0, 4 affectent-elles l’agrégation du substrat associé à la maladie ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cribler les bibliothèques de variantes HSP 1 0 4 pour la sélection de suppresseurs de toxicité.