La ligature très efficace de petites molécules d'ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

L’objectif global de cette procédure est de préparer de manière impartiale les microARN pour le séquençage à haut débit. Ceci est accompli en préparant ou en achetant d’abord des oligonucléotides d’ADN qui sont compétents pour la ligature aux trois extrémités principales du micro-ARN. La deuxième étape consiste à ligaturer les trois premiers oligonucléotides d’ADN à la troisième extrémité principale du micro-ARN.

Ensuite, le produit de ligature est purifié en gel et le liant oligonucléotidique à cinq ARN principaux est ligaturé à l’extrémité cinq premiers du microARN. La dernière étape consiste à convertir les molécules hybrides en ADNC, puis à amplifier l’ADNC par réaction en chaîne par polymérase. En fin de compte, le clonage de micro-ARN et le séquençage à haut débit sont utilisés pour montrer le profil à l’échelle du transcriptome des microARN de manière quantitative à la résolution de chaque nucléotide.

Le principal avantage de notre technique par rapport aux techniques existantes telles que le microséquençage microray qPCR blot, est que notre technique reflète mieux le niveau réel de microrayons à l’échelle d’un transcrit à l’échelle du laboratoire à une résolution de nucléotide unique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biologie des microARN, elle peut également être appliquée à d’autres technologies de séquençage à haut débit comme HC clip et RNA-Seq. Les oligonucléotides d’ADN pour cette procédure sont conçus pour trois réactions de ligature primaire et doivent avoir un groupe phosphate à cinq primes, un dinucléotide randomisé à l’extrémité cinq premières et une cytosine à trois premières diluer les oligonucléotides d’ADN à 100 micromolaires dans de l’eau sans nucléases.

Assemblez la réaction de ventilation en combinant ces réactifs : 200 pimoles des trois oligonucléotides primaires de liaison, quatre microlitres de cinq tampons de ventilation d’ADN primaires, quatre microlitres d’un TP, quatre microlitres de M-T-H-R-N-A, de la ligase et de l’eau sans nucléases pour un volume final de 40 microlitres. Incuber la réaction à 65 degrés Celsius pendant une heure. Terminez la réaction en chauffant à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Précipitez l’agent de liaison TED en ajoutant 2,5 volumes d’éthanol à 100 % et un tiers de volume d’acétate d’ammonium à 10 molaires. Pour éliminer les résidus de TP et éviter les ligatures imprévues lors de réactions futures, mélangez la solution d’alcool, de sel et d’oligonucléotides jusqu’à l’homogénéité en tournant à pleine vitesse dans une micro-centrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Lavez la pastille dans de l’éthanol à 70 %, séchez-la à l’air libre et remettez-la en suspension dans le volume approprié d’eau sans nucléase pour obtenir 50 à 100 micromolaires d’un oligonucléotide ventilé.

Confirmer une ventilation de l’oligonucléotide par électrophorèse sur un gel de poly acrylamide à 18 %. Pré-faites fonctionner le gel pendant 30 minutes à 24 volts centimètre de largeur de gel avec un tampon de fonctionnement XTBE à température ambiante. Une fois les 30 minutes écoulées, rincez les puits avec un tampon courant.

Les oligonucléotides d’ADN pour cette procédure sont conçus pour trois réactions de ligature primaire et doivent avoir un groupe phosphate à cinq primes, un dinucléotide randomisé à l’extrémité cinq premières et une ocytocine à trois primes. Diluez les oligonucléotides d’ADN à 100 micromolaires dans de l’eau sans nucléases. Faites fonctionner le gel à 24 volts par centimètre jusqu’à ce que le bleu de bromo phénol soit aux trois quarts du bas du poteau de gel.

Teignez le gel avec une solution x cyber gold dans un XTBE et visualisez-le sur un boîtier de transluminateur UV. Il devrait y avoir un seul décalage nucléotidique dans la taille de l’oligonucléotide d’ADN qui a été soumis à une ventilation par la ligase M-T-H-R-N-A pour la réaction de ligature à trois primes. Assemblez les composants suivants sur de la glace dans cet ordre.

Un microlitre de 50 % de PEG 8 000 0,5 microlitres de tampon 10 XRNA ligase. Un microlitre d’un linker ventilé à trois primes, 0,5 microlitre d’inhibiteur d’ARN 0,5 à huit microgrammes d’ARN total, 0,5 microlitre de T, quatre ARN Ligase deux et de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume final de cinq microlitres. Mélangez la réaction par pipetage une fois bien mélangée.

Placez la réaction dans un thermocycleur avec un couvercle chauffé. Réglez le bloc à 16 degrés Celsius et incubez pendant quatre heures. Notez que la réaction peut être mise à l’échelle jusqu’à un volume final de 20 microlitres sans aucune perte d’efficacité de ligature.

Après la ligature à trois primes, mélangez la réaction avec un volume égal de deux tampons de chargement XRNA, chauffez à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes et refroidissez-la sur de la glace. Gel suivant. Purifier l’échantillon sur un gel de polyacrylamide à 15 %.

Pré-exécutez le gel à 24 volts centimètre de largeur de gel pendant au moins 30 minutes. Coupez l’alimentation électrique et rincez les puits avec un tampon en marche. Chargez l’échantillon et faites fonctionner le gel à la même tension que lors de la pré-course jusqu’à ce que le bromophénol soufflé vienne de sortir du gel.

Le produit souhaité migrera à proximité du cyan de xylène lorsque l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide sera terminée. Placez le gel dans un plateau propre avec un tampon de coulée et un tampon de cyber or et de roche pendant 15 minutes. Retirez le gel du plat de coloration et visualisez-le sur une boîte de transluminateur UV recouverte d’une pellicule plastique propre.

Le produit de ligature doit avoir une longueur d’environ 45 nucléotides. Étant donné que ce produit de ligature n’est généralement pas visible, il est important d’inclure un échantillon d’ARN synthétique de contrôle positif dans la voie adjacente à l’aide d’une lame de rasoir propre, la région contenant le produit de ligature. Guidé par les positions de l’échantillon d’ARN synthétique et les normes de taille.

Placez le fragment de gel d’accise dans un microtube à centrifuger de 0,5 millilitre. Percez le fond du microtube de centrifugation de 0,5 millilitre avec une aiguille de calibre 30 et placez le tube de perçage dans une deuxième centrifugeuse à microtube de centrifugation propre à faible rétention, de 1,5 millilitre, pendant cinq minutes à environ 15 000 fois. G.Vérifiez visuellement que la tranche entière de gel s’est déplacée à travers le trou du tube intérieur.

Si nécessaire, utilisez une pointe de pipette propre pour rapprocher certains fragments de gel du trou. Jetez le tube vide de 0,5 millilitre et ajoutez 400 microlitres de tampon à colonne de sel élevée à la suspension d’acrylamide. Faites vibrer le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit du lendemain.

Transférez la boue dans une colonne de spin en acétate de cellulose de 0,22 micron à l’aide d’une centrifugeuse à pointe de pipette à large diamètre pendant trois minutes à température ambiante à environ 15 000 fois. G pour recueillir tout le liquide loin de la matrice de gel d’acrylamide. Transférez le liquide dans un tube propre de 1,5 millilitre à faible rétention contenant un microlitre d’une solution de glycogène de 20 milligrammes par millilitre.

Ajoutez un volume égal d’isopropanol et un dixième de volume d’acétate de sodium et mélangez la solution en retournant le tube plusieurs fois. Précipiter dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. Centrifuger à pleine vitesse à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Pour granuler l’acide nucléique, retirez le snat et lavez-le à l’air à 70 % d’éthanol. Séchez le granulé pendant 10 minutes à température ambiante et passez directement à l’étape de ligature à cinq primes. Pour commencer cette procédure, ajoutez les composants suivants à l’acide nucléique granulé précédemment, deux microlitres de PEG 8 000, 0,5 microlitre de tampon ARN ligase, 0,5 microlitre d’un TP, 0,5 microlitre de linker, ARN oligonucléotide et de l’eau jusqu’à un volume final de quatre microlitres.

Mélangez cet échantillon en pipetant de haut en bas à plusieurs reprises pendant cinq minutes maximum pour vous assurer que la pastille a été complètement resolubilisée. Une fois la pastille en solution, transférez le contenu dans un tube PCR propre contenant un microlitre d’un mélange individuel d’inhibiteur d’ARN et de T quatre ARN ligase mélangées par pipetage de haut en bas. Incuber la réaction dans un thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Lorsque la réaction est terminée, procéder immédiatement à la synthèse du CD NA comme décrit dans le texte du protocole après la ligature de l’agent de liaison aux trois extrémités premières de l’ARN et l’analyse de la page des réactions. Des bandes pointues de haut poids moléculaire sont évidentes dans la région de 100 à 300 nucléotides du gel, ce qui indique que l’échantillon total d’ARN utilisé est de haute qualité. Le signal très brillant dans la région des 25 nucléotides du gel est un excès d’ARN synthétique à trois premiers liants non ligaturés indique une ligature réalisée avec cinq picomoles de micro-ARN synthétique et un trois premiers liants, qui a été purifié sur gel.

Voici un autoradiogramme de trois réactions de ligature primaire réalisées avec P 32 5 prime et des micro-ARN synthétiques marqués. Le nombre d’heures pendant lesquelles la réaction a pu se dérouler est indiqué en haut, et les chiffres en bas indiquent les quantités ligaturées en pourcentage de la somme des non ligaturés et des ligaturés. Cet autoradiogramme est constitué de cinq réactions de ligature primaire réalisées avec des micro-ARN synthétiques marqués à 5 extrémités primaires P 32, trois hybrides de liaison primaires.

Les chiffres en bas indiquent les quantités ligaturées en pourcentage de la somme des non ligaturés et des ligaturés, et révèlent l’importance d’utiliser une forte concentration de PEG 8 000 petits R-N-A-A-D-N-A. Des banques compatibles avec le séquençage à haut débit sont ensuite générées par PCR. Le nombre approprié de cycles de PCR est déterminé empiriquement.

Dans cet exemple, la taille du produit d’ADN attendu est de 146 paires de bases Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée correctement en seulement deux jours. Lors de l’exécution de cette technique, il est important de se rappeler de garder toutes les pointes et tous les tubes exempts d’ARN.