Name: Purification à grande échelle dorigine porcine ou bovine photorécepteur Outer Segments pour phagocytose essais sur les cellules épithélium pigmentaire rétinien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Apprenez la purification à grande échelle des segments externes de photorécepteurs porcins ou bovins par ultracentrifugation sur gradient de saccharose. Cette méthode permet d'étudier la phagocytose par l'épithélium pigmentaire rétinien.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs à EFN), Fondation Voir et Entendre et la Fondation Bettencourt Schueller (subventions pour jeunes chercheurs à EFN), Centre national de la recherche scientifique (CNRS, poste permanent pour l&#39;EFN) et Le National Eye Institute des National Institutes of Health (R01-EY13295 à EFC). En outre, l&#39;Institut de la Vision est financé par l&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre national de la recherche scientifique et le département de Paris.

Cette expérience de l&#39;isolement de POS prend du temps et peut nécessiter jusqu&#39;à 12 heures pour compléter si POS sont étiquetés avant le stockage. Le protocole a été adapté à partir d&#39;un document publié par RS Molday et ses collègues en 1987 31 et modifié par SC Finnemann et ses collègues en 1997 10. Les animaux ont été traités selon l&#39;Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l&#39;utilisation d&#39;animaux dans ophtalmique et Vision Research. Des protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d&#39;éthique de l&#39;Université Charles Darwin Pierre et Marie Curie-Paris 06 et le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux Université Fordham. 1. Généralités Set Up <ol><li> Obtenir 80 porcs ou de vaches fraîches yeux aussi frais dès après l&#39;abattage que possible et garder réfrigéré dans l&#39;obscurité. Fournir des instructions au fournisseur afin que l&#39;entreprise procède de la même façon. Ce protocole est optimisé pour 80 yeux. Àprocéder à plus d&#39;yeux et obtenir des stocks plus importants (par exemple, à partir de 160 yeux), doubler les quantités de solutions et effectuer deux tours de ultracentrifugation; Des échantillons de la piscine par la suite à l&#39;étape de collecte (voir étape 2.2.2). </li><li> Mis en place sur le banc la lampe inactinique rouge, tampons absorbants, lingettes (Table des matières). Préparer des plats de 15 cm et des sacs de risque biologique pour la collecte des déchets (parties de l&#39;œil vitreux, utilisé ...). Porter blouse moulante, gants, manches protectrices et des lunettes. </li><li> Précautions: <ol><li> Pré-refroidir toutes les solutions, puis les conserver au froid durant toutes les étapes. Gardez les yeux et les gradients réfrigérés sur la glace autant que possible. </li><li> Gardez les yeux et les tissus dérivés dans l&#39;obscurité autant que possible jusqu&#39;à ce que l&#39;étape de collecte après l&#39;ultracentrifugation pour éviter photoblanchiment des pigments visuels et la perte de la couleur orange-rose de la forme active des photopigments. </li></ol></li></ol> 2. Protocole Actions <ol><li> Préparer des solutions et des gradients: <ol><li> Thaw taurine stocks complètement en utilisant un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Préparer toutes les solutions de solutions d&#39;achat d&#39;actions (tableau 1, les solutions mères) et bien mélanger le saccharose et d&#39;autres ingrédients à l&#39;aide d&#39;un agitateur magnétique pour chaque solution. <ol><li> Préparer 15 ml de la solution d&#39;homogénéisation à une concentration finale de 20% de saccharose, 20 mM de Tris pH 7,2 acétate, 2 mM de MgCl2, 10 mM de glucose et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de saccharose à 25% à une concentration finale de 25% de saccharose (en utilisant 70% de saccharose actions), 20 mM d&#39;acétate de Tris pH 7,2, glucose 10 mM et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de saccharose à 60% à une concentration finale de 60% de saccharose (en utilisant une poudre de saccharose), 20 mM de Tris pH 7,2 acétate, 10 mM de glucose et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de lavage à une concentration finale de 20 mM d&#39;acétate de tris pH 7,2 et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de lavage 2à une concentration finale de 10% de saccharose, 20 mM d&#39;acétate de tris pH 7,2 et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de lavage 3 à une concentration finale de 10% de saccharose, 20 mM de phosphate de sodium pH 7,2 et 5 mM de taurine. </li></ol></li><li> Stabiliser le fabricant de gradient sur un agitateur magnétique et d&#39;insérer une barre d&#39;agitation dans la chambre la plus proche de la sortie où la solution de 60% sera inséré. Utiliser un embout pipette P200 coupure placé à la sortie du tube pour atteindre la vitesse de coulée appropriée. </li><li> Fonte gradients linéaires délicatement en diluant et en agitant la solution de saccharose à 60% avec celui de 25% en utilisant 12 ml de chaque solution (à savoir, au total six tubes pour 80 yeux) dans des tubes d&#39;ultracentrifugation de pré-réfrigérés. Agiter la solution progressivement diluer-saccharose 60% ainsi. Stabiliser la vitesse d&#39;écoulement gradient, versant la solution en douceur et pas trop vite. NOTE: Afin d&#39;obtenir un gradient linéaire continue, gardez l&#39;ouverture de la pointe de la pipette à droite à la surface de la solution pour l&#39;ensemble de formatio de gradientn. </li><li> Laissez les gradients sont assis sur la glace pendant environ 1 h pour la stabilisation. Gardez les gradients réfrigérés jusqu&#39;à leur chargement. Ne secouez pas les tubes pour éviter la perturbation du gradient. </li></ol></li><li> collecte de tissu: <ol><li> Recueillir tissus sous faible lumière rouge. Prenez un oeil dans une main et pousser l&#39;avant avec le bord de la lame de rasoir tout en maintenant le regard loin (pour éviter les éclaboussures; Figure 1). Utilisez la lame de rasoir pour couper le globe oculaire antérieure en deux moitiés (cornée, plus au moins 5 mm dans la sclérotique). Retirez la lentille et retournez l&#39;œilleton intérieur de telle sorte qu&#39;il peut être tenu sur la pointe d&#39;un doigt exposant ainsi la rétine. </li><li> Utilisation de la lame de rasoir à un angle, grattez délicatement la rétine, détacher facilement et apparaissant comme une couche rose, sur la surface de tapetum et couper à la tête du nerf optique (Figure 1). Collecter toutes les rétines en 2 x 50 ml tubes contenant 15 ml de solution d&#39;homogénéisation sur la glace. </li><li> Homo Retinagenization: <ol><li> Secouez la suspension vigoureusement à la main pendant 2 minutes afin de perturber les différentes couches de cellules, briser POS hors le reste de la cellule de PR, fragment POS et homogénéiser la suspension rétine. </li><li> Filtre 3x par une double couche de gaze propre pour enlever de grands fragments de tissus et de recueillir l&#39;écoulement continu propres tubes de 50 ml (figure 1). La suspension de la rétine étant assez épais, afin de maximiser le rendement, appuyez doucement sur la gaze pour libérer restants tissus fragmentés après chaque filtration. </li></ol></li></ol></li><li> Photorécepteur extérieure fragment de segment (POS) l&#39;isolement: <ol><li> Posez délicatement la rétine prep brut, autour de 6-7 ml par tube, plus de 6 x 30 ml tubes d&#39;ultracentrifugation contenant chacun 24 ml de fraîches, réfrigérées continue 25 - gradient de saccharose à 60% (figure 1). Équilibrer les tubes opposés, le cas échéant pour le rotor à utiliser. Ultracentrifugeuse à 106 000 g pendant 50 min à 4 ° C. </li&gt; <li> Éliminer la majeure partie de la solution au-dessus de la bande orange-rose dans le tiers supérieur de gradient par aspiration (figure 2A). Recueillir la bande orange-rose avec une pointe de P1000 coupure dans un bécher. Jeter le reste après neutralisation en utilisant l&#39;eau de Javel (biologique des déchets). </li><li> Diluer avec ~ 4-5 volumes de glace froide Laver une solution. Séparer en autant de tubes de 30 ml au besoin. Centrifuger à 3000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Prenez soin de le surnageant. </li><li> granulés de remettre en suspension dans 10 ml Laver deux solution et tournent à 3000 g pendant 10 min comme détaillé ci-dessus. granulés de remettre en suspension dans 15 ml Laver 3 et tourner de nouveau à 3000 g pendant 10 min. Combinez suspensions de plusieurs pastilles de réduire le nombre de tubes nécessaires avant centrifugation dans Wash 2 et 3 Lavez solutions. </li></ol></li><li> POS aliquotage sans marquage: <ol><li> Remettre en suspension POS dans 10-20 ml de DMEM. Prédilué 10 pi à 490 pi DMEM (01h50) et le comte allongé ainsi que POS tourbillonnait dans unchambre de comptage de cellules (figure 2B). Calculer le rendement et la concentration en particules POS par ml. NOTE: Le rendement varie en fonction principalement sur ​​l&#39;âge et la souche de porcs / vaches et la taille des yeux, par exemple, une bonne préparation est comprise entre 5 - yeux 8 x 10 9 POS de 80 de porcs. </li><li> Décider sur le volume de DMEM final (typiquement de 10 à 20 ml) et ajouter du saccharose pour obtenir une concentration finale de 2,5% de saccharose. </li><li> Préparer des aliquots de la taille souhaitée, par exemple, 5 x 10 7 POS par tube pour la remise en suspension d&#39;un volume de 2 ml pour une expérience de 96 puits à 40 uL / puits. Spin une aliquote pendant 5 min à 2300 xg à température ambiante et d&#39;évaluer la taille de culot. Préparer différentes tailles aliquotes pour différents volumes de la demande comme POS devrait PAS être congelé et décongelé deux fois. </li><li> Congeler aliquotes POS à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. NOTE: Des aliquotes sont stables pendant de nombreux mois. Dans nos mains, non marqué ou étiqueté POS peut être conservé pendant au moins un an. </li></ol></li><li> étiquetage POS et aliquotage: NOTE: Nous utilisons généralement FITC à étiqueter POS pour la quantification des tests de phagocytose, mais d&#39;autres colorants peuvent être utilisés aussi bien en fonction des besoins. <ol><li> Remettre en suspension 1 10 mg FITC flacon à 2,5 mg / ml de concentration de 0,1 M Na tampon carbonate pH 9,5 en mélangeant 2,6 ml 0,1 M NaHCO 3 pH 8,4 à 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tableau 2, des solutions d&#39;achat d&#39;actions). Tourner pendant une heure à température ambiante tout en protégeant de la lumière et de spin pendant 5 min à vitesse maximale pour sédimenter solides FITC non remises en suspension. </li><li> Reprendre le culot de POS dans 10 ml de solution de lavage 3 (ou DMEM) et ajouter 2 ml de solution pour 80 FITC yeux. Conservez les restes FITC congelé à -80 ° C. Tourner pendant au moins 1,5 heure à température ambiante. Protéger de la lumière en utilisant une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Laver POS marqué deux fois en utilisant Wash 3 solution comme décrit dans la section 2.3.4, puis une fois ou deux fois dans du DMEM jusqu&#39;à ce que presque aucune FITC libre est vu dans le surnageant fraction. Remettre en suspension dans du DMEM POS et procédez comme pour POS non marqué pour le comptage et aliquotage (section 2.4). </li></ol></li><li> Utilisation de POS dans les expériences: <ol><li> POS décongeler à température ambiante, et de les garder dans l&#39;obscurité autant que possible se ils sont marqués par fluorescence. Spin pendant 5 min à 2300 xg à température ambiante. Aspirer le surnageant. </li><li> Immédiatement remettre en suspension dans un volume approprié de la solution de dosage comme dicté par l&#39;expérience. En cas de différents moments de défi POS, POS magasin remis en suspension à la température ambiante dans l&#39;obscurité entre les points de temps pendant plusieurs heures. </li></ol></li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêt financier concurrent.

Trois étapes ou conditions sont cruciales pour une purification optimisé: qualité de gradient coulée et délicate manipulation des tubes de gradient, en gardant les tissus frais et dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à l&#39;étape de la collecte, de la force de la secousse d&#39;homogénats rétiniennes pour obtenir l&#39;isolement de POS bon du reste de la PR cellule. Si certaines questions se posent à voir la bande orange correctement, ils sont très probablement due à l&#39;une des trois raisons ci-dessus (voir également le d...

Dans la rétine, la vision est provoquée par isomérisation des molécules photosensibles appelées opsines, avant d&#39;être transformé en un signal qui peut être transmis entre les neurones jusqu&#39;à des zones visuelles du cerveau. Ces molécules sont intégrées dans des piles de disques membraneuses ressemblant à crêpes qui constituent les parties de segments extérieurs des cellules photoréceptrices (PR). Être soumis à une exposition constante à des niveaux considérables donc du stress oxydatif et de la lumière, les PR renouveler continuellement leurs segments extérieurs à limiter les dommages oxydatifs potentiel. Photoréceptrices segments extérieurs sont en contact étroit avec microvillosités apicale des cellules voisines épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Cellules RPE constitue la partie extérieure de la barrière hémato-rétinienne et assurent de nombreuses tâches qui sont cruciaux pour photorécepteurs santé et de la fonction 1, telles que la trempe des rayons lumineux par l&#39;intermédiaire de pigments mélaniques, re-isomérisation du photoréactif rétine de composante de opsine, fournissant des nutriments et de gCROISSANCE facteurs, en participant à l&#39;élimination PR métabolite. En outre, les cellules RPE éliminent passé POS et recyclent leurs composants, une occupation quotidienne qui est réglementée par le rythme circadien dans la rétine des mammifères 2,3. La clairance du hangar POS est absolument nécessaire pour la survie de PR. Quand il est complètement abrogée, les débris se accumulent POS et PRS dégénèrent provoquant rapide de 4,5 perte de vision. Si le profil rythmique est perdu et remplacé par une activité constante, PR et RPE défauts se accumulent avec l&#39;âge de 6. Par conséquent, il est très important de caractériser la régulation moléculaire d&#39;un EPR phagocytose in vitro afin de comprendre phénotypes liés à son dysfonctionnement. Fait intéressant, la machinerie moléculaire dans les cellules RPE est très similaire à celle utilisée par les macrophages pour effacer les cellules apoptotiques et les deux dépendent de la reconnaissance de la phosphatidylsérine exposée sur les débris phagocytaire 9.7. Pourtant, les cellules macrophages et RPE réguler le pHagocytosis différemment, comme les macrophages optent pour l&#39;élimination immédiate de cellules apoptotiques au moment de la rencontre tandis que les cellules RPE engloutir rythmiquement POS seulement une fois par jour en dépit de leur contact permanent avec des segments extérieurs. Cela suggère des mécanismes de régulation spécifiques qui ne sont pas encore bien compris. Un grand nombre de molécules impliquées dans le mécanisme de phagocytose RPE ont été identifiés validé ou grâce à l&#39;utilisation de POS isolé et culture de cellules tests de phagocytose. Le récepteur d&#39;intégrine alphavbeta5 située à la surface apicale des cellules RPE, en coordination avec son ligand MFG-E8, se lie spécifiquement à POS 10-12, qui sont ensuite internalisée par l&#39;intermédiaire du récepteur de kinase de tyrosine MerTK 13-15. Le récepteur scavenger CD36 a été montré pour participer à la prise de point de vente et d&#39;influer sur sa vitesse 16,17 et peut servir de capteur de phospholipides oxydés à la surface de 18 points de vente. L&#39;internalisation doit le recrutement de F-cytosquelette d&#39;actine-assdes protéines telles que l&#39;annexine ociated 2 19, la myosine II 20 et de la myosine VIIA 21,22. POS native ou oxydée in vitro sont également utilisés pour comprendre le vieillissement phénotypes de cellules RPE in vivo liés à l&#39;accumulation de mal digéré POS oxydé 23-28. La génération de cellules RPE dérivées de cellules souches a lancé une nouvelle application pour POS isolé qui sont utilisés pour prouver la fonctionnalité des cellules avant qu&#39;elles sont transplantées à des animaux ou patients 29,30,27. Première décrit par Molday et ses collègues en 1987 31, le protocole pour l&#39;isolement de POS bovine combine une étape d&#39;ultracentrifugation d&#39;homogénats rétiniennes sur des gradients de saccharose continues avec l&#39;observation de l&#39;apparition d&#39;orange caractéristique de la rétine photopigment écrus (portant 11- rétinien cis). Au cours des 10 dernières années, en raison de précautions prises afin de minimiser le risque de maladie de la vache folle, l&#39;utilisation des yeux porcins est devenu increasingly important. Le protocole décrit ici montre comment obtenir de grandes quantités de POS de porc ou les yeux bovins qui peuvent être aliquotés et conservés pendant de longues périodes de temps. Ceci élimine la nécessité de préparer POS des regards de rongeurs, ce qui nécessite l&#39;aide d&#39;un grand nombre d&#39;animaux par la préparation de POS et le dosage 32,33,21,22. En outre, des détails concernant l&#39;étiquetage POS avant stockage en utilisant des molécules fluorescentes sont données, pour quantifier et visualiser POS de manière simplifiée et comparables pour certaines applications par rapport à l&#39;étiquetage POS après l&#39;essai de phagocytose 32,10. Par conséquent, ces stocks importants pour permettre la reproductibilité et la facilité d&#39;utilisation dans de nombreux types d&#39;expériences.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Spécifique Matériel/Équipement</td></tr><tr><td>Fabricant de dégradé à 2 chambres Fabricant</td><td></td><td></td> de <td>dégradé avec chambres de 30 ml</td></tr><tr><td>Tube en</td><td></td><td></td> silicone de 3 mm de diamètre <td>pour coulée dégradée</td></tr><tr>Barre <td></td><td></td><td>d’agitation magnétique de petite taille</td><td>Barre d’agitation adaptée à la chambre du fabricant de dégradé</td></tr><tr><td>Lampe</td><td></td><td></td> de sécurité rouge <td>Lampe inactinique pour la dissection dans le Tubes Ultra</td></tr><tr><td>Clear foncé 25 x 89 cm</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Tubes d’ultracentrifugation</td></tr><tr><td>PP Oak Ridge Tubes</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>Tubes de centrifugation de 30 ml</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>Ultracentrifugeuse</td></tr><tr><td>SW 32Ti Rotor pivotant</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td>Rotor pivotant pour ultracentrifugeuse</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>393124</td></tr><tr><td>Centrifugeuse JA-25.50 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td>pour centrifugeuse Avanti J-26 XP</td></tr><tr><td>FITC Isomère I</td><td>Life Technologies</td><td>F-1906</td><td>Colorant</td></tr><tr> fluorescent<td colspan="4">Autre matériau/équipement</td></tr><tr><td>Chambre de comptage (comme Neubauer ou Malassez)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seaux à glace foncés avec couvercles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balances</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur magnétique et pôle</td><td></td><td></td><td></td>de maintien</tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td>réfrigérée</tr><tr><td>37 &deg ; C bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>-80 &deg ; C congélateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consommables</td></tr><tr><td>Blouse</td><td></td><td></td><td>de laboratoire Santé et sécurité</td></tr><tr><td>Gants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protège-manches Lunettes</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>protection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>absorbants Sacs et poubelles</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>pour risques biologiques<td>Lames Weck-Prep Dissection</td><td></td><td></td><td>Lames de rasoir de 60 mm/2,25 pouces de large Plat</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>en plastique de 15 cm</td></tr><tr><td>Feuilles de</td><td></td><td></td><td></td>gaze stériles</tr><tr>Tubes <td></td><td></td> de<td>15 et 50 ml</td><td>Consommables courants</td></tr><tr><td>Microtubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feuille</td><td></td><td></td><td></td> d’aluminium</tr></tbody></table>

purification à grande échelle d&#39;origine porcine ou bovine photorécepteur outer segments pour phagocytose essais sur les cellules épithélium pigmentaire rétinien

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analyse de l&#39;une des fonctions vitales de l&#39;épithélium rétinien pigmentaire (RPE) des cellules, la phagocytose des fragments passés distales âgées de segments externes des photorécepteurs (OP) peut être effectuée in vitro. Photoréceptrices segments extérieurs avec des piles de disques membraneuses contenant les machines de phototransduction sont constamment renouvelés dans la rétine. POS usés sont éliminés quotidiennement par des cellules RPE. Rongeur, porcin / bovin et cellules RPE humaines reconnaître POS partir de diverses espèces d&#39;une manière similaire. Pour faciliter l&#39;exécution grande série d&#39;expériences avec peu de variabilité, un stock important de POS peut être isolé de yeux porcins et conservé congelé en aliquotes. Ce protocole prend avantage de la caractéristique de photopigments qui affichent une couleur orange lorsqu&#39;il est maintenu dans l&#39;obscurité. Sous une lumière rouge sombre, rétines sont collectés dans un tampon d&#39;œilletons ouverts coupées en deux. La suspension de cellules de la rétine est homogénéisé, filtré et chargé sur un gradient de sucrose continu. Après centrifugation, POS sont situés dans une bande distincte dans la partie supérieure de la pente qui a une couleur orange caractéristique. POS sont ensuite collectés, filés, remises en suspension séquentielle dans des tampons de lavage, comptés et aliquotés. POS obtenus de cette manière peuvent être utilisées pour des essais et l&#39;analyse de l&#39;activation des protéines, la localisation ou l&#39;interaction à différents moments après la provocation POS phagocytose. Alternativement, POS peut être étiqueté avec des fluorophores, e. G., FITC, avant aliquotage pour la fluorescence ultérieure quantification des POS de liaison ou engloutissement. Autres applications possibles comprennent l&#39;utilisation de défi POS ou POS modifié combiné à des conditions de stress pour étudier l&#39;effet du stress oxydatif ou de vieillissement sur les cellules de l&#39;EPR.

La combinaison du gradient de saccharose linéaire et l'ultracentrifugation permet la séparation des différents composants de la suspension de la rétine par densité. Les cellules RPE et les débris plus grande rétiniennes lourds tombent au ou près du bas de la pente (figure 2A). POS plus léger et plus légers des cellules individuelles ou des débris de cellules de la rétine migrent bandes distinctes pour atteindre la moitié supérieure de la pente d'ici la fin de la période de centrifugation. En gardant les...

Cet article décrit le protocole de purification des fragments du segment externe des photorécepteurs (POS) par ultracentrifugation à partir de rétines porcines/bovines par homogénéisation et centrifugation par gradient de saccharose. Ce protocole permet de préparer d’importants stocks d’aliquotes POS, étiquetées ou non, qui peuvent ensuite être stockées à -80 °C.

Purification à grande échelle d&#39;origine porcine ou bovine photorécepteur Outer Segments pour phagocytose essais sur les cellules épithélium pigmentaire rétinien

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des stocks à grande échelle de segments externes de photorécepteurs, purifiés à partir de signes de guerre ou d’yeux de bovins. Étudier l’une des fonctions les plus importantes du pigment rétinien, les cellules épithéliales, leur activité rythmique quotidienne de l’acide OC. Ceci est accompli en coulant d’abord des gradients de 25 à 60 % de saccharose dans des tubes d’ultracentrifugation.Ensuite, les yeux de porc ou de bovin sont disséqués et les Rey sont collectés et homogénéisés. Ensuite, les re sont filtrés et chargés sur le gradient de saccharose et la centrifugeuse pour séparer les segments externes des photorécepteurs. Enfin, la bande orange contenant les segments externes des photorécepteurs est soit recueillie dans une aliquote stockée telle quelle, soit étiquetée avant Ali, citation et stockage.Enfin, le balayage fluorescent automatisé, la microscopie fluorescente ou l’immuno-transfert sont utilisés pour étudier l’activité phagocytaire de lignées cellulaires, de cellules différenciées dérivées de cellules souches ou de cultures primaires dans diverses conditions. Le principal avantage de cette technique par rapport à l’isolement des segments automatiques de la masse ou des yeux pour chaque expérience est que le même pool de matériau peut être utilisé pour plusieurs expériences, permettant ainsi un degré de reproductibilité plus élevé. La démonstration visuelle de cette méthode est pratique car une étape critique réside dans la coulée d’ions car elle conditionne la gamme de segments extérieurs isolés.La démonstration de la procédure sera faite par Celia Parino, une étudiante diplômée, et un technicien satisfait de mon laboratoire. Après avoir obtenu 80 yeux de porc ou de vache frais selon le protocole de texte, gardez-les dans l’obscurité et refroidis sur de la glace autant que possible. Pour éviter le photoblanchiment des pigments visuels et la perte de couleur rose orangé installée sur le banc, la lampe rouge à lumière sûre tampons absorbants et lingettes. Préparez un plat de 15 centimètres, des sacs à risques biologiques pour la collecte des déchets et des lames de rasoir.Une fois que toutes les solutions ont été préparées, selon le protocole textuel, pré-refroidissez-les et conservez-les au froid pendant toutes les étapes. Stabilisez le générateur de gradient sur une plaque d’agitation magnétique et insérez la barre d’agitation dans la chambre la plus proche de la sortie où la solution à 60 % sera versée. Utilisez une pointe de pipette P 200 coupée placée à la sortie du tube pour obtenir une vitesse de coulée appropriée avec 12 millilitres de chaque solution de saccharose à 25 % et 60 %.Et tout en agitant la solution à 60 %, coulez un gradient linéaire de saccharose dans un tube à centrifuger pré-refroidi, en maintenant l’ouverture de la pointe de la pipette à la surface de la solution à gradient en montée continue. Pour effectuer le prélèvement de tissus, portez une blouse de laboratoire bien ajustée, des gants, des protège-manches et des lunettes de protection sous une lumière rouge tamisée tout en tenant un œil dans une main avec la surface de coupe tournée, utilisez le bord d’une lame de rasoir pour percer l’avant de l’œil. Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour couper le globe oculaire antérieur en deux moitiés.Retirez l’objectif et retournez l’œilleton afin qu’il puisse être tenu sur le bout d’un doigt. Ainsi, en exposant la rétine à l’aide de la lame de rasoir en biais, grattez doucement la rétine, qui se détachera facilement et apparaîtra comme une couche rosâtre à la surface du tetum et coupera la tête du nerf optique. Transférez les rétines dans l’un des deux tubes de 50 millilitres contenant 15 millilitres de solution d’homogénéisation sur de la glace.Après avoir recueilli toutes les rétines, secouez vigoureusement la suspension à la main pendant deux minutes. Afin de perturber les différentes couches cellulaires, détachez les segments externes des photorécepteurs ou POS du reste des photorécepteurs, fragmentez le POS et homogénéisez la suspension de la rétine. Pour éliminer les gros fragments de tissu, utilisez la double couche de gaze propre pour filtrer la suspension trois fois dans un tube de 50 millilitres.Appuyez doucement sur la gaze pour libérer les tissus fragmentés restants. Après chaque filtration, déposez délicatement la préparation brute de rétine sur six à 24 millilitres, 25 à 60 % de gradients de saccharose. Après avoir équilibré les tubes, centrifugez l’Ultra à 106 000 G pendant 50 minutes à quatre degrés Celsius.Lorsque la rotation est terminée, aspirez la majeure partie de la solution au-dessus de la bande rose orangé dans le tiers supérieur du dégradé. Ensuite, à l’aide d’une pointe P 1000, récupérez la bande rose orangé dans un bécher. Utilisez environ quatre à cinq volumes de lavage pour diluer la solution et aliquote dans autant de tubes de 30 millilitres que nécessaire.Centrifugez à 3000 GS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jetez soigneusement le surnageant. Ensuite, avec la solution de lavage deux, suspendez les granulés avant de les essorer à nouveau. Utilisez la solution de lavage trois pour laver les granulés.Une troisième fois. Pour aliquote le POS, utilisez 10 à 20 millilitres de DMM pour remettre les cellules en suspension.Utilisez ensuite 490 microlitres de DMM pour diluer 10 microlitres de cellules et recalculez le rendement et la concentration en particules POS par millilitre. Décidez d’un volume final de DMM et ajoutez du saccharose à une concentration finale de 2,5 %. Préparez les aliquotes souhaitées. Faites tourner une seule aliquote à 2 300 GS pendant trois à cinq minutes à température ambiante.Évaluez la taille des granules et préparez divers volumes d’aliquote pour éviter de les geler et de les décongeler plus d’une fois. Pour étiqueter les cellules avant l’allumage d’Eloqua. Utilisez un tampon de carbonate de sodium de 0,1 molaire pour remettre en suspension un flacon de 10 milligrammes de ZI à une concentration de 2,5 milligrammes par millilitre.Tournez pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité et tournez à vitesse maximale pendant cinq minutes pour granuler les solides ZI restants. À l’aide de 10 millilitres de solution wash three ou de dmm, remettez en suspension la pastille POS et ajoutez deux millilitres de la solution Fite pour 80 yeux. Utilisez du papier d’aluminium pour vous protéger de la lumière et tournez pendant au moins 1,5 heure.À température ambiante. Utilisez une solution de lavage trois fois pour laver les cellules comme décrit plus haut dans la vidéo, puis DM EM une à deux fois jusqu’à ce qu’il n’y ait presque plus de fluide libre dans le surnageant. Utilisez DM EM pour suspendre le POS et compter un quat similaire à un POS non étiqueté, comme on le voit ici.En gardant les yeux et les échantillons dans l’obscurité jusqu’à la fin de l’étape de centrifugation, l’interdiction du gradient de saccharose contenant POS peut être immédiatement reconnue par sa couleur orange vif. Et s’ils sont endommagés, ils apparaîtront comme des morceaux beaucoup plus petits, un peu comme un fond poussiéreux. En règle générale, lorsqu’il est correctement isolé, le point de vente doit apparaître allongé, droit ou plié.Lorsqu’ils sont observés au microscope, selon le plan de mise au point du microscope, ils peuvent apparaître sombres ou brillants. S’ils ne sont pas remis en suspension correctement, ils resteront en touffes. Les POS isolés servent à tester directement la capacité phagocytaire des cellules APR mutantes.Dans cet exemple, les POS sont facilement phagocytés par les cellules primaires de l’EPR de souris de type sauvage, tandis que les cellules de souris bêta-cinq intégrine et MFG huit knock-out sont tito moins de POS dans le même laps de temps. La quantification de la phagocytose POS peut être effectuée soit en comptant manuellement les POS marqués FSE sur des images de microscope, en mesurant l’intensité de la fluorescence, soit par cytométrie en flux après trypsine cellulaire. Cette figure analyse le recrutement des protéines à l’aide de l’immunofluorescence, des tests de colocalisation, et le recrutement ou l’activation des protéines peut être validé sur des blocs immunitaires après l’immunoprécipitation, ou en vérifiant la phosphorylation après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la phagocytose médiée par le phosphate sein pour explorer et caractériser la machinerie moléculaire dans les cellules pétales pigmentaires rétiniennes, et comparer les résultats à d’autres cellules phagocytaires telles que les macrophages.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous décrivons une technique permettant d’isoler les cellules épithéliales de l’iris et du pigment rétinien des yeux porcins afin d’obtenir leurs cultures primaires pour des études in vivo et ex vivo. Ces cellules pigmentaires pourraient être génétiquement modifiées pour étudier des approches régénératives pour traiter les troubles oculaires.

Isolement des cellules IPE et RPE : une technique pour obtenir des cellules épithéliales pigmentées à partir d’un œil porcin isolé

Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) et des cellules épithéliales pigmentaires de l’iris (EPI) à partir d’yeux bovins prélevés. Les cellules isolées peuvent être cultivées pour étudier leur rôle dans le traitement des maladies oculaires.

Isolement des cellules EPR et IPE de l’œil bovin : une procédure de récolte et de culture de cellules épithéliales pigmentaires primaires bovines

Ici, un protocole pour isoler et transfecter les cellules épithéliales pigmentaires primaires de l’iris et de la rétine de divers mammifères (souris, rats, lapins, porcs et bovins) est présenté. La méthode est parfaitement adaptée à l’étude des approches de thérapie génique oculaire dans diverses configurations pour des analyses ex vivo et des études in vivo transférables à l’homme.

Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales pigmentaires primaires de mammifères pour la thérapie génique non virale

Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 20161, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules RPE de souris, qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. La procédure dure environ 3 heures.

Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

Ce manuscrit décrit un protocole simplifié pour l’isolement progressif des cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules EPR.

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

Ici, une méthode facile à suivre pour cultiver in vitro des cellules épithéliales pigmentaires primaires de la rétine porcine est présentée.

Culture primaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines

Nous décrivons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Cette procédure permet des études de biologie moléculaire de suivi sur l’EPR isolé, y compris des analyses d’expression génique.

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

Ce protocole décrit un modèle d’accumulation de lipofuscine dans des cultures épithéliales de pigment rétinien humain (EPR) hautement différenciées et polarisées et un test de phagocytose du segment externe (SG) amélioré pour détecter la capacité totale de consommation/dégradation de la SG de l’EPR. Ces méthodes surmontent les limites des modèles précédents de lipofuscine et des tests classiques de phagocytose du segment externe par impulsions.

Amélioration des modèles de lipofuscine et quantification de la capacité de phagocytose du segment externe dans des cultures épithéliales de pigments rétiniens humains hautement polarisés

Ce protocole décrit la procédure d’obtention et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires (EPR) à partir d’yeux porcins d’origine locale. Ces cellules constituent une alternative de haute qualité aux cellules souches et conviennent à la recherche rétinienne in vitro .

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines primaires pour la modélisation in vitro

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Apprenez la purification à grande échelle des segments externes de photorécepteurs porcins ou bovins par ultracentrifugation sur gradient de saccharose. Cette méthode permet d'étudier la phagocytose par l'épithélium pigmentaire rétinien.

Purification à grande échelle dorigine porcine ou bovine photorécepteur Outer Segments pour phagocytose essais sur les cellules épithélium pigmentaire rétinien (Vidéo) | JoVE Journal

Purification à grande échelle d'origine porcine ou bovine photorécepteur Outer Segments pour phagocytose essais sur les cellules épithélium pigmentaire rétinien

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