Name: À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Apprenez l'imagerie en accéléré de cinq jours d'explants cochléaires embryonnaires de souris rapporteuses fluorescentes. Cette méthode automatisée révèle les mouvements morphogénétiques et l'expression génique dans le temps.

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Merci à Willy Sun pour l&#39;assistance technique et le Dr Kris Gellynck pour leurs commentaires utiles et trois relecteurs anonymes pour leurs conseils constructifs. Ce travail a été financé par l&#39;Initiative de régénération d&#39;audience Sunnybrook

Tissu souris a été récolté à partir de Sox2 EGFP -reporter souris 12 maintenus et euthanasiés conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux sur pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. La culture embryonnaire cochlées <ol><li> Supplément milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) en mélangeant 8,89 ml de DMEM, 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 100 ul de 100x supplément N2, et 10 pi de 10 mg / ml de la ciprofloxacine. Supplément solution saline équilibrée de Hank (HBSS) en mélangeant 495 ml de HBSS avec 5 ml de HEPES 100%. </li><li> Préparer des boîtes de culture de fond de verre: <ol><li> Dans une hotte à flux laminaire, la remise en suspension de 200 ul de substrat sous-sol extrait de membrane dans 5 ml de DMEM. Préparer 35 mm verre de diamètre des boîtes de culture de 10 mm avec fond des puits. Pipette 150 ul substrat / DMEM dans le centre de chaque fond de verre plat. Ces plats peuvent être utilisés après 40 minutes d&#39;incubation, ou peuvent stockée dans un CO 2 </sub&gt; Incubateur à 35 ° C pendant au moins une semaine. REMARQUE: à fond de verre plats sont utilisés pour les raisons suivantes: veiller à ce que le fond du plat est transparent et adapté pour l&#39;imagerie, pour créer un puits au centre de l&#39;assiette qui permet de régler les explants dans une zone facilement localisé et enfin de sorte que, après une expérience de l&#39;échantillon peut être traité pour une analyse ultérieure et immunocoloration. </li></ol></li><li> Préparer le poste de travail et outils: <ol><li> Tournez sur le banc de nettoyage à écoulement laminaire, et arroser avec EtOH à 70% pour créer un espace de travail propre. Faire tremper pinces, cuillères, et un 184 plat en élastomère de silicone noir (un mélange de 184 élastomère de silicone (10 parties), l&#39;agent (1 partie) et de la poudre de charbon de bois (2,5 g) de durcissement) dans EtOH à 70%. </li></ol></li><li> Dans le poste de travail propre, les embryons de récolte pour l&#39;expérience. Recueillir des embryons de la gestation approprié dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES. <ol><li> Déterminer un organe externe ou visible qui démontreral&#39;activité du rapporteur et examiner les embryons en utilisant un microscope stéréoscopique fluorescent. Recueillir les embryons qui présentent une activité de journaliste dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES que ceux-ci font l&#39;objet de l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Recueillir os temporaux: <ol><li> En travaillant rapidement, à l&#39;aide d&#39;une source de lumière froide et une pince fine, recueillir les têtes des petits. Prenez soin de couper au niveau des vertèbres cervicales et en dessous de la mâchoire pour éviter d&#39;endommager l&#39;os temporal. </li><li> Ouvrez soigneusement le crâne. Retirez le cerveau, coupez le devant de la tête, et de transférer le crâne postérieur à glace fraîche HBSS froid additionné de 1% HEPES dans un plat propre. Disséquer soigneusement les arachides os temporaux en forme en prenant soin de garder le système vestibulaire de tact. </li></ol></li><li> Disséquer la cochlée: <ol><li> Transférer les os temporaux dans un plat recouvert d&#39;élastomère de silicone noir dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES, la broche de la région vestibulaire de l&#39;os. Insérer les broches d&#39;insectes àun angle oblique afin de stabiliser l&#39;os temporal et créer un espace pour la pince. Épingler est une étape cruciale dans le processus comme si l&#39;os temporal est autorisé à se déplacer trop, il est très difficile de récolter une cochlée intacte. </li><li> Retirez délicatement le cartilage entourant la cochlée. Insérer une dent de la pince dans le cartilage sur le bord extérieur de la base de la cochlée et découper un trou dans le cartilage. </li><li> Attachez un rabat sur le côté, insérer la dent de la pince et se séparer en douceur le toit de la gaine du cartilage. Couper horizontalement sur le dessus et en diagonale, et soulevez délicatement la partie avant de la capsule. Insérez un volet de la pince entre le cartilage restant et le conduit et le clip doucement la dernière section. La surface apicale de la cochlée est maintenant exposé. </li><li> À partir de la base, attraper la zone où le toit de la conduite répond l&#39;épithélium cochléaire et ouvrir le canal cochléaire. Retirez délicatement le toit, le paragelorsque cela est nécessaire jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement retiré. Coupez les portions de membrane à gauche sur la face interne de la conduite. Faire ramoner le conduit de tissu mésenchymateux excès et détacher la conduite du système vestibulaire. </li></ol></li><li> Culture: les explants <ol><li> Passer une explantation, surface luminale place, dans le centre d&#39;un verre recouvert boîte de culture bas de substrat, soigneusement prélever tout le liquide et laisser reposer pendant deux minutes. Ajouter 150 ul complétée DMEM goutte à goutte à l&#39;expiant, en prenant soin de ne pas déranger. Si l&#39;expiant flotter librement, repositionner avec une pince, mais veiller à ce que l&#39;explantation se dépose au fond de la boîte de sorte qu&#39;il peut se brancher sur le substrat. </li><li> Placez les plats à fond de verre dans un 12 cm de diamètre plat de Pétri de profondeur, avec un petit plat d&#39;eau stérile pour maintenir l&#39;humidité. Mettre les cultures dans un incubateur à 35 ° pendant une nuit pour que l&#39;expiant pour fixer au substrat et l&#39;aplatir. </li></ol></li></ol> 2. direct ImagING <ol><li> Sélectionnez échantillons explants. Utilisation d&#39;un microscope stéréoscopique fluorescent pour évaluer l&#39;état de chaque cochlée explantée. Sélectionner uniquement explants où le canal est intact et attaché au verre à partir de la base au sommet. </li><li> Régler l&#39;incubateur à 35 ° C avec 5% de CO 2 à la culture de tissus cochléaire. Mettez les cultures dans le microscope de l&#39;incubateur: <ol><li> Aspirer doucement le DMEM supplémenté et remplacer avec au moins 500 pi de milieu frais. Pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à 6 jours, de 1-1,5 ml est mieux. Dans les cas où explants sont mal fixés, une pipette un anneau de médias autour du bord du plat. Ce liquide supplémentaire fera une &quot;chambre humide&quot; miniature sans perturber l&#39;expiant alors qu&#39;il continue à attacher à la matrice. <ol><li> Vous pouvez aussi utiliser articulé plat couvre pour ouvrir les couvercles alors que le plat reste dans sa mise en place dans le microscope si les réactifs doivent être échangés pendant les intervalles entre les collections d&#39;images. Couvercles plat charnières permettent aux couvercles d&#39;êtreouvert sans déranger les échantillons ou de retirer les plats de leurs paramètres. Cela permet de maintenir leur position exacte des captures d&#39;images suivantes. </li></ol></li><li> Insérez les plats en verre fond contenant des échantillons appropriés dans le support de plat de l&#39;échantillon. Le microscope dans cet exemple a une plate-forme rotative qui contient huit plats de 35 mm de l&#39;échantillon. </li><li> Sous la hotte à flux laminaire remplacer les couvercles en plastique avec couvercles en verre et insérer les plats dans le support de plat de l&#39;échantillon. Placez le support de plat de l&#39;échantillon à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur en prenant soin de ne pas déloger les explants du fond du plat ou de perturber les médias. </li></ol></li><li> Mettre en place la routine d&#39;imagerie: <ol><li> Allumez le microscope, lampe UV et l&#39;appareil, ouvrez le logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Repérez les échantillons, choisir une zone d&#39;imagerie, plan de mise au point et ajuster les temps d&#39;exposition pour chaque plat en séquence. Choisir le plan de mise au point en fonction non seulement de la vue de l&#39;explant au moment du démarrage, mais alen gardant à l&#39;esprit la façon dont le tissu se déplace et combien de temps le cours du temps sera exécuté. </li><li> Définir une pile Z de centrage dans le plan focal sélectionné dans le canal de fluorescence. Réglez la fréquence et la durée de l&#39;échantillonnage pour l&#39;expérience. La fréquence d&#39;échantillonnage est limitée par le temps qu&#39;il faut pour recueillir des images, ce qui devrait être déterminée après la sélection de champs de vision et la fixation d&#39;un empilement de Z. Dans ce cas, le prélèvement est effectué toutes les 30 min pendant cinq jours. La durée de l&#39;expérience peut aller jusqu&#39;à 14 jours. </li></ol></li><li> Générer un film: <ol><li> A la fin de la période de laps de temps d&#39;ouvrir les fichiers d&#39;image. Dans ce cas, le logiciel Metamorph qui ouvre des points de collecte séquentielles est utilisé. Image par image choisir le meilleur plan focal pour montrer la population cellulaire d&#39;intérêt. </li><li> Convertir ces images dans un fichier .avi, ou les exporter sous forme d&#39;un montage pour produire un ensemble d&#39;images qui peuvent être ouverts et analysés dans le logiciel de traitement d&#39;image ou convertis en forma multiplets en utilisant un logiciel de traitement vidéo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li>
<li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auditory+sensory+epithelium%3A+the+instrument+of+sound+perception%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li>
<li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li>
<li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+for+canonical+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li>
<li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+%3A+the+official+journal+of+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+of+America%2C+Microbeam+Analysis+Society%2C+Microscopical+Society+of+Canada%22%5BJournal%5D)">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6(2013).</li>
<li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li>
<li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li>
<li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly%28dimethylsiloxane%29+microwells+and+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+sterility%22%5BJournal%5D)">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li>
<li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).</li>
<li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27%28Kip1%29+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à divulguer.

Il ya plusieurs points techniques à prendre en compte lorsque les cultures sont établies et à mettre en place le microscope time-lapse pour que l&#39;imagerie à long terme. Nous utilisons sous-sol matrice de la membrane comme substrat pour la culture des explants cochléaires, mais le substrat doit être adapté au type de cellule. Par exemple, à l&#39;image des cultures de neurones, il peut être préférable de fournir un revêtement de fibronectine. La température d&#39;incubation et la composit...

La cochlée des mammifères est un organe complexe très ordonnée. Chez la souris, entre l&#39;émergence de l&#39;oreille interne primitif de la vésicule otique le jour E11 et l&#39;achèvement du programme de développement à des stades postnatales, de multiples vagues de signalisation cellulaire et des changements coordonnés dans l&#39;expression génique ont lieu. Exécution de la base au sommet de la cochlée est la détection épithélium sensoriel, ou organe de Corti son. Développement de l&#39;organe de Corti est superbement contrôlé de telle sorte que d&#39;ici la fin du développement, il sera composé d&#39;une seule rangée de cellules ciliées internes, trois rangées de cellules ciliées externes entrecoupées de cinq rangées de cellules de soutien (deux rangées de cellules de pilier, trois des rangées de cellules de Deiters 1). Déviation de cette précises résultats d&#39;ordre dans la perte d&#39;audition, heighlighting l&#39;importance de studye DELA genèse et la structuration de la epithemlium sensorielle 2. Dans la culture in vitro de l&#39;embryon de souris cochLea est un outil essentiel dans l&#39;étude des mécanismes de développement de l&#39;organe de Corti. Cette technique a été créé en 1974 et au cours des 40 dernières années, a été utilisé pour élucider bon nombre des mécanismes par lesquels l&#39;épithélium sensoriel est spécifié et l&#39;organe de Corti établi 3. La cochlée est un organe complexe avec les processus dynamiques de développement; une manipulation peut prendre aussi longtemps que sept jours pour manifester 1. Par exemple, lors de l&#39;ajout d&#39;inhibiteurs de GSK 3β à une culture d&#39;explant cochléaire à E13, la période d&#39;incubation optimal pour observer un effet robuste du composé 4 est de six jours. Imagerie en temps réel de la cochlée développement permet l&#39;étude des changements dans la morphologie de l&#39;organe de Corti, les changements dans l&#39;expression des gènes, le suivi de migration, prolifération ou mourants cellules, et il permet d&#39;observer en temps réel les résultats des agents pharmaceutiques et la perturbation de la signalisation voies. Jusqu&#39;à présent, vivre l&#39;imagerie de la cochléea principalement été effectués en utilisant la microscopie confocale à l&#39;image de petites zones de l&#39;organe de Corti sur des périodes courtes 5-8, mais cette technique a des limites dues à la viabilité explant. Dans l&#39;imagerie des effets de manipulations à long terme sur les processus de développement lent, le milieu de formation d&#39;image est cruciale. Typiquement, un système d&#39;imagerie confocale en direct utilise une boîte en plastique humidifié qui se trouve sur le microscope. La chaleur et l&#39;humidité peuvent échapper à travers les lacunes dans la boîte incubation où il rencontre la table de microscope, à travers les fenêtres d&#39;accès, à travers les ouvertures à charnières et à travers les interstices autour des différentes parties de la microscope- comme la source de lumière ou objectif. Ce ne sont pas optimales pour le maintien en bonne santé explants pendant plus de deux ou trois jours. Nous définissons «incubateur microscope» comme un microscope inversé scellé à l&#39;intérieur d&#39;une norme incubateur à CO2, plutôt que d&#39;un incubateur construit autour du microscope. Un ex incubateur de microscopetend la vie de l&#39;expérience, de telle sorte que, plutôt que l&#39;imagerie sur deux ou trois jours, les échantillons peuvent être imagés par un maximum de deux semaines. Un microscope incubateur offre un excellent environnement pour la croissance et la différenciation cellulaire, avec une perturbation minimale de explantation des cultures et des conditions standard contrôlée. Dans les études qui se déroulent sur plusieurs jours, il est courant de recourir à des échantillons d&#39;imagerie sur une base quotidienne en les retirant de l&#39;incubateur et les portant à un microscope à fluorescence inversé. Bien que cette approche peut travailler, de sortir la vaisselle de l&#39;incubateur inflige une tension sur le tissu développement sensible. Les variations de l&#39;acidité du milieu de culture et les fluctuations de température dues à l&#39;enlèvement de l&#39;incubateur peuvent se traduire par le développement et des tissus sous-optimale malsain. L&#39;imagerie de la même région au même plan focal et dans la même orientation à chaque point de temps est extrêmement difficile. En utilisant un système automatisé à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur, il est possible de maintenir en bonne santétissu, de recueillir des images à plusieurs points dans le temps et à veiller à ce que la même zone est capturée dans chaque image. Au cours des dernières années, plusieurs incubateurs de tissus au microscope intégrés ont été développés, ceux-ci ont été utiles non seulement dans la pratique clinique 9 mais aussi sur les cellules souches et le cancer recherche 10,11. Nous présentons ici un protocole d&#39;imagerie en temps réel à long terme de embryonnaires explants cochléaires de la souris. On utilise un système de microscopie automatisée à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur à CO 2 standard qui est capable de capturer des images de plusieurs échantillons à des instants de consigne. Le système se compose d&#39;un microscope inversé posée dans un incubateur. Les échantillons sont placés dans une estrade tournante qui permet l&#39;imagerie d&#39;échantillons multiples à chaque point de temps. Illumination, capture d&#39;images, et la rotation de l&#39;estrade sont contrôlés par un système automatisé exploité par le logiciel Metamorph. En définissant une routine d&#39;imagerie utilisant le logiciel d&#39;exploitation, nous pouvons définir une expérience à fonctionner jusqu&#39;à two semaines avec une intervention humaine minimale. Dans cet exemple, nous utilisons deux champs lumineux et fluorescence d&#39;afficher une croissance à grande échelle et le réarrangement de la cochlée, et plus précisément, la région prosensory. Dans cette expérience, cochlée sera disséqué de souris rapporteurs Sox2 EGFP le jour embryonnaire E13. Cultures in vitro sera établi et imagé sur cinq jours.

<table><tbody><tr><td>Le média Eagle modifié de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Plusieurs marques fabriquent cet</td></tr><tr><td>extrait de membrane basale.</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. D’autres produits similaires sont disponibles auprès d’autres fournisseurs. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellulaire+Matrice+Protéine+ECM+et+Attachement+Facteurs %28Sciences de la vie %29|Matrigel+Babas+Membrane+Matrice+ %28Lifesciences %29</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Plusieurs marques fabriquent ce http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Plusieurs marques fabriquent ce http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x supplément N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Plusieurs marques fabriquent ce http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Plusieurs marques fabriquent ce http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&region=CA</td></tr><tr><td>la solution saline équilibrée de Hank</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>plusieurs marques fabriquent ceci. Doit être refidgé avant utilisation. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720 :s</td></tr><tr><td>Pince</td><td>fine Outils de science fine</td><td>11254-20</td><td>Numéro de taille 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&nbsp ;</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>10080-05</td><td>taille 1 mm&nbsp ; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118</td></tr><tr><td>Épingles à insectes</td><td>Outils scientifiques</td><td>fins 26001-35</td><td>Doit être en acier inoxydable http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>Plats en plastique de 50 mm</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Plusieurs marques fabriquent ce</td></tr><tr><td>charbon</td><td>de bois Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Plusieurs marques fabriquent des articles similaires http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&region=CA</td></tr><tr><td>184 élastomère de silicone</td><td>Dow/Corning&nbsp ;</td><td>KIT SILICONE ÉLASTOMÈRE SYLGARD&REG ; 184 La</td><td>vaisselle est faite maison plusieurs semaines à l’avance. L’élastomère de silicone peut provenir de n’importe quel fournisseur.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td></tr><tr><td>Plats à fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Les dimensions de la parabole sont déterminées par les spécifications du système d’imagerie.&nbsp ; 35 mm de diamètre, Puits de 10 mm, lamelle numéro 0 pour Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15& products_id=2</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss&nbsp ;</td><td>495101-9804-000</td><td>&nbsp ; Modèle Stemi 2000. plusieurs marques fabriquent des articles similaires http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Source de lumière froide</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Plusieurs marques fabriquent des articles similaires http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope fluorescent&nbsp ;</td><td>Leica microsystems</td><td>Contactez Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Plusieurs marques fabriquent des articles similaires http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr> <tr><td>Incubateur Microscope + logiciel d’imagerie</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Microcope inversée scellée à l’intérieur d’un incubateur de CO2. Microscope incubateur Vivaview FL avec logiciel d’imagerie propriétaire Metamorpoh. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0</td></tr><tr><td>Banc propre</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Plusieurs marques fabriquent des articles similaires http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Plusieurs marques fabriquent des articles similaires http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Plusieurs marques fabriquent des articles similaires http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

À long terme accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Nous présentons ici une méthode à long terme imagerie time-lapse de direct embryonnaires explants cochléaires de la souris. Le programme de développement responsable de la construction de la très ordonnée, la structure complexe de la cochlée des mammifères produit une dizaine de jours. Afin d&#39;étudier les changements dans l&#39;expression des gènes au cours de cette période et leur réponse aux pharmaceutique ou manipulation génétique, l&#39;imagerie à long terme est nécessaire. Auparavant, l&#39;imagerie en temps réel a généralement été limitée par la viabilité des tissus expiantes dans une chambre humidifiée au sommet d&#39;un microscope standard. La difficulté dans le maintien des conditions optimales pour la croissance de la culture en ce qui concerne l&#39;humidité et la température a placé les limites de la longueur d&#39;expériences d&#39;imagerie. Un microscope intégré dans un incubateur de culture tissulaire modifié fournit un excellent environnement pour imagerie longue durée en direct. Dans cette méthode, nous démontrons comment établir explants cochléaires embryonnaires de souris et comment utiliser un microscope incubateur de mener laps de temps Imaging utilisant à la fois champ lumineux et la microscopie à fluorescence pour examiner le comportement d&#39;une journée typique embryonnaire (E) 13 explant cochléaire et Sox2, un marqueur des cellules prosensory de la cochlée, sur 5 jours.

Ici, nous montrons un montage (figure 1) et un film (Figure 2) montrant comment un explant cochléaire organotypique typique va croître si plaqué sur E13.5. Un journaliste souris Sox2 a été utilisé pour visualiser la région prosensory. Le film montre que la cochlée est soumis à une croissance et à la convergence et l'extension, les cellules dans la région latérale du domaine de Sox2 vert ne semblent pas se diviser le tissu environnant comme il se dilate. Ceci est une ca...

Imagerie en temps réel de la cochlée des mammifères embryonnaire est difficile parce que les processus de développement de la main fonctionnent sur un gradient temporel de plus de dix jours. Nous présentons ici une méthode pour la culture et l&#39;imagerie des tissus embryonnaires des explants cochléaire pris d&#39;une souris rapporteur fluorescent sur cinq jours.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

L’objectif global de cette procédure est d’imager une cochlée embryonnaire prélevée sur une souris rapporteure fluorescente à des intervalles de 30 minutes sur cinq jours. Ceci est accompli en récoltant d’abord la cochlée embryonnaire du jour 13 sur des souris rapporteures fluorescentes. Ensuite, les cochlées sont cultivées in vitro.Ensuite, les cultures cochléaires explan sont placées dans un microscope incubateur. Enfin, une routine d’imagerie automatisée est mise en place et la cochlée E est imagée. En fin de compte, l’imagerie à long terme des cultures d’explan cochléaire peut être utilisée pour montrer les mouvements morphogénétiques de l’épithélium cochléaire dans son ensemble, ainsi que les changements dans l’expression des gènes rapporteurs au fil du temps et les effets des agents pharmacologiques à action lente.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la photographie manuelle de cultures X fonds sur une période donnée, est que ce système est entièrement automatisé. Il permet de collecter plus de points temporels et garantit que la même région de la cochlée ou un ensemble de cellules est imagé dans la même orientation à chaque poin

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Cette vidéo montre le processus d’isolement des explants de ganglions spiralés de l’oreille interne et de leur co-culture avec l’organe de Corti sur un réseau de multiélectrodes. Les ganglions en spirale sont soigneusement extraits et sectionnés en sections de tissus plus petites ou en explants. Ces explants sont cultivés sur la zone active du réseau de multiélectrodes pour favoriser la croissance des processus neuronaux.

Culture d’explants de neurones du ganglion spiralé murin sur des réseaux de multiélectrodes

Source : Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage de virus adéno-associés clairsemés de populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo montre l’utilisation de la microscopie confocale pour visualiser la dynamique dendritique dans des explants rétiniens de souris vivantes. Il décrit les étapes de stabilisation de la rétine au microscope confocal, d’imagerie par épifluorescence pour...

Imagerie confocale en accéléré de la dynamique dendritique neuronale dans des explants rétiniens de souris

Nous présentons une méthode qui décrit l’isolement et la culture d’explants cochléaires à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris.  Nous démontrons également une méthode de transfert de gènes dans des explants cochléaires par électroporation à ondes carrées. La culture d’explants in vitro couplée à la technique de transfert de gènes permet aux chercheurs d’étudier les effets de la modification de l’expression des gènes au cours du développement.

Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d'autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Le but de ce protocole est de démontrer la préparation, la culture, le traitement et l'immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La technique peut être utilisée comme outil de dépistage in vitro dans la recherche auditive.

Technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que<em&gt; In Vitro</em&gt; Outil de dépistage dans la recherche auditive

Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l'utilisation d'un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l'immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

Ici, nous présentons une méthode pour visualiser l’apaisement de 3 kDa Texas Red-labeled dextran dans les cellules ciliées auditives avec des canaux fonctionnels de mécannotransduction. En outre, dextrans de 3 à 10 kDa peuvent être utilisés pour étudier l’endocytose dans les cheveux et les cellules de soutien de l’organe de Corti.

Étiquetage Dextran et prise en vie et fonctionnelle cellules courines Murine

Dans cette étude, nous présentons une méthode d’imagerie en temps réel utilisant la microscopie confocale pour observer les cellules se déplaçant vers le tissu endommagé par incubation ex vivo avec l’épithélium cochléaire contenant l’organe de Corti.

Imagerie in vitro de cellules vivantes en accéléré pour explorer la migration cellulaire vers l’organe de Corti

Un microscope à feuille de lumière a été développé pour imager et numériser la cochlée entière.

Imagerie de la cochlée vieillissante avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière

Le protocole actuel met à jour les protocoles précédents et intègre des approches relativement simples pour la culture d’explants cochléaires de haute qualité. Cela permet une acquisition de données fiable et une imagerie haute résolution dans les cellules vivantes et fixes. Ce protocole s’inscrit dans la tendance actuelle à l’étude des cellules de l’oreille interne.

Explants cochléaires néonatals entiers comme modèle in vitro

Le protocole présente un nouvel outil pour simplifier l’imagerie intravitale à l’aide de la microscopie confocale inversée.

Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Apprenez l'imagerie en accéléré de cinq jours d'explants cochléaires embryonnaires de souris rapporteuses fluorescentes. Cette méthode automatisée révèle les mouvements morphogénétiques et l'expression génique dans le temps.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

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