À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

L’objectif global de cette procédure est d’imager une cochlée embryonnaire prélevée sur une souris rapporteure fluorescente à des intervalles de 30 minutes sur cinq jours. Ceci est accompli en récoltant d’abord la cochlée embryonnaire du jour 13 sur des souris rapporteures fluorescentes. Ensuite, les cochlées sont cultivées in vitro.

Ensuite, les cultures cochléaires explan sont placées dans un microscope incubateur. Enfin, une routine d’imagerie automatisée est mise en place et la cochlée E est imagée. En fin de compte, l’imagerie à long terme des cultures d’explan cochléaire peut être utilisée pour montrer les mouvements morphogénétiques de l’épithélium cochléaire dans son ensemble, ainsi que les changements dans l’expression des gènes rapporteurs au fil du temps et les effets des agents pharmacologiques à action lente.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la photographie manuelle de cultures X fonds sur une période donnée, est que ce système est entièrement automatisé. Il permet de collecter plus de points temporels et garantit que la même région de la cochlée ou un ensemble de cellules est imagé dans la même orientation à chaque point temporel, tout en se développant dans un incubateur de culture tissulaire irrégulier. Après avoir complété le milieu d’aigle modifié de KO ou DMEM et la solution de sel d’équilibre de Hank ou HBSS selon le protocole de texte d’accompagnement.

Sous une hotte à flux laminaire, utilisez cinq millilitres de DMEM supplémenté en unsu pour remettre en suspension, 200 microlitres de substrat de membrane basale pipetez 150 microlitres au centre de chaque puits de 10 millimètres d’une boîte de culture à fond de verre de 35 millimètres de diamètre. Incuber pendant 40 minutes dans un incubateur à CO2 à 35 degrés Celsius. Pour préparer le poste de travail et les outils, allumez le banc propre à flux laminaire et utilisez de l’éthanol à 70 % pour le pulvériser et pour tremper des pinces, des cuillères et un plat recouvert de silicone noir.

Dans le poste de travail propre, récoltez les embryons de la gestation appropriée dans de la glace. HBSS froid complété par 1 % de tas. À l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent, identifiez les embryons qui présentent une activité rapporteure à l’extérieur ou à l’intérieur d’un organe visible et transférez-les dans des HBSS fraîches et glacées avec 1 % de tas pour collecter les os temporaux, à l’aide d’une source de lumière froide et de pinces fines.

Travaillez rapidement pour couper les vertèbres cervicales et sous la mâchoire pour recueillir les têtes. Après avoir collecté les têtes d’embryons selon le protocole de texte, ouvrez soigneusement le crâne, puis retirez la garniture de cerveau de l’avant de la tête et transférez le crâne postérieur dans un plat avec de la glace fraîche. Froid. HBSS tas, disséquez soigneusement les os temporaux en forme d’arachide, en prenant soin de garder le système vestibulaire intact.

Pour disséquer la cochlée, transférez les os temporaux dans une boîte recouverte d’élastomère de silicone noir dans des tas HBSS glacés. Épinglez la région vestibulaire de l’os en insérant des broches à un angle oblique afin de stabiliser l’os temporal et de créer de l’espace pour la pince. Ensuite, retirez soigneusement le cartilage entourant la cochlée en insérant une attache de la pince dans le cartilage au bord extérieur de la base de la cochlée et en coupant un trou dans le cartilage.

Clipsez horizontalement sur le dessus et en diagonale et soulevez soigneusement la partie avant de la capsule. Insérez une broche de la pince entre le cartilage restant et le canal, et coupez doucement le cartilage restant. La surface apicale de la cochlée est maintenant exposée.

En commençant par la base, attrapez la zone où le toit du conduit rencontre l’épithélium cochléaire et ouvrez le canal cochléaire. Décollez doucement la garniture de toit si nécessaire jusqu’à ce qu’elle soit complètement retirée. Coupez toutes les parties de la membrane qui restent du côté médial du conduit.

Ensuite, nettoyez le canal de l’excès de tissu mésenchymateux et détachez le canal du système vestibulaire pour cultiver des implants. Placez une surface luminale au centre d’une boîte de culture à fond de verre recouverte de substrat. Retirez délicatement le liquide et laissez reposer deux minutes.

Puis goutte à goutte. Ajoutez 150 microlitres de DMEM supplémenté à l’explan X, en prenant soin de ne pas le déranger afin qu’il puisse se déposer sur le substrat. Placez les plats à fond de verre dans une boîte de Pétri profonde de 12 centimètres de diamètre avec un petit plat d’eau stérile pour maintenir l’humidité.

Mettez les cultures dans un incubateur à 35 degrés Celsius pendant la nuit afin que l’explan se fixe au substrat et s’aplatisse pour effectuer une imagerie en direct. Après avoir sélectionné les échantillons, utilisez un stéréomicroscope fluorescent pour évaluer l’état de chaque cochlée explantée, et ne sélectionnez que les explants dont le conduit est intact et se fixent au verre de la base à l’apex. Réglez l’incubateur à 35 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pour la culture.

Le tissu cochléaire aspire doucement le DMEM supplémenté des cultures et le remplace par au moins 500 microlitres de milieu frais. Dans les cas où les explans sont fixés lâchement, pipetez un anneau de milieu autour du bord du bol. Ce liquide supplémentaire fera une chambre humidifiée miniature sans perturber l’explan pendant qu’il continue à se fixer à la matrice.

Dans cet exemple, le microscope est doté d’une plate-forme rotative qui contient 8 boîtes d’échantillonnage de 35 millimètres sous la hotte à flux laminaire. Remplacez les couvercles en plastique par des couvercles en verre et insérez les plats dans le porte-plat d’échantillonnage. S’il est nécessaire de changer de support au cours de l’expérience.

Pour éviter de perturber l’explan, utilisez des couvercles de plat à charnières qui permettront l’ouverture des couvercles pendant que le plat reste dans son ajustement dans le microscope, placez le porte-plat d’échantillon à l’intérieur du microscope de l’incubateur en prenant soin de ne pas déloger l’explan du fond du plat ou de déranger le milieu. Pour configurer la routine d’imagerie, allumez le microscope, la lampe UV et la caméra, puis ouvrez le logiciel d’imagerie. Pour chaque échantillon localisé, choisissez un plan de mise au point et d’exposition de la zone d’imagerie, en gardant à l’esprit non seulement la vue de l’explan au moment de commencer, mais aussi la façon dont le tissu se déplacera au cours de l’analyse.

Dans le canal de fluorescence, placez une pile Z centrée autour du plan focal sélectionné. Définissez ensuite la fréquence et la durée de l’échantillonnage pour l’expérience. Cela sera limité par le temps nécessaire pour collecter les images afin de générer un film à la fin d’une période de time-lapse.

Utilisez un logiciel tel que METAMORPH pour ouvrir les fichiers d’image pour un échantillon image par image. Choisissez le meilleur plan focal pour afficher la population cellulaire d’intérêt. Enfin, convertissez les images en un point dans un fichier VI, ou exportez-les sous forme de montage pour générer un ensemble d’images qui peuvent être ouvertes et analysées dans un logiciel de traitement d’images ou converties dans d’autres formats.

Voici un film montrant comment un explan cochléaire organotypique se développera s’il est plaqué. Sur E 13.5, une souris SOX à deux rapporteurs a été utilisée pour visualiser la région sensorielle pros comme vue en vert lorsque les cellules des régions non sensorielles se divisent et se déplacent. La région sensorielle non proliférative en vert subit des réarrangements tissulaires et des mouvements d’extension convergents.

Une deuxième expérience en accéléré centrée sur la base médiane d’un autre explan cochléaire démontre qu’à mesure qu’elle s’étend, la région sensorielle se rétrécit lors de la première culture. L’épaisseur du tissu permet d’identifier des régions d’expression mais pas des cellules individuelles.

Cependant, après trois jours de culture, le tissu s’est considérablement aplati, ce qui permet de visualiser les cellules fluorescentes individuelles après cette procédure. D’autres méthodes telles que la coloration immunofluorescente ou l’extraction de protéines et d’ARN peuvent être effectuées afin d’évaluer les changements dans l’expression des gènes au niveau moléculaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer et de cultiver la cochlée et comment utiliser un microscope d’incubateur pour effectuer une imagerie en direct sur l’ensemble de l’explan sur une période de plusieurs jours.