Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l'analyse de l'ARN-séquençage

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les régulateurs clés potentiels de l’auto-renouvellement et de la différenciation des cellules EML de souris en utilisant la technologie de séquençage de l’ARN. Ceci est accompli en séparant d’abord les cellules EML CD 34 positives négatives de lignée et les cellules EML négatives CD 34 négatives de lignée en fonction de marqueurs de surface. La deuxième étape consiste à isoler l’ARNm, à convertir l’ARNm en ADNc et à préparer la banque pour le séquençage.

Ensuite, la banque d’ADN est soumise à un séquençage à haut débit. La dernière étape consiste à analyser les résultats du séquençage et à rechercher des facteurs de transcription exprimés de manière différentielle. En fin de compte, la technologie de séquençage de l’ARN est utilisée pour montrer les facteurs de transcription exprimés de manière différentielle dans les cellules CD-34 positives et CD-34 négatives

Le principal avantage du séquençage de l’ARN par rapport à d’autres méthodes d’expression G telles que les microrayons, est qu’il a une sensibilité, une précision et une plage dynamique plus larges, et qu’il ne repose pas sur des informations d’annotation de gènes préexistantes. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des cellules souches, telles que quels sont les facteurs clés de transcription régulant l’auto-renouvellement et la différenciation cellulaires. L’implication de cette technique s’étend à l’endroit où le traitement des maladies du sang, car une meilleure compréhension du régulateur clé contrôlant les cellules précurseurs hématopoïétiques, l’auto-renouvellement et la différenciation peuvent conduire au développement de traitements efficaces.

En général, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car divers outils bioinformatiques sont nécessaires pour l’analyse de séquençage. Les cellules de rein de bébé hamster ou BHK pour la collecte du facteur de cellules souches sont cultivées dans un milieu dmem contenant 10 % de FBS dans un flacon de 25 centimètres carrés, à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Lorsque les cellules ont atteint 80 à 90 % de confluence trypsine yeux et qu’elles sont collectées par centrifugation à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante, jeter le snat et remettre en suspension la palette cellulaire dans 10 millilitres de milieu de culture cellulaire BHK frais.

Transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans un nouveau flacon de 75 centimètres carrés dans une application et ajoutez 48 millilitres de culture cellulaire BHK fraîche. Moyenne à la culture en flacon. Les cellules BHK pendant deux jours.

Après deux jours, récupérez le milieu de culture et passez-le à travers un filtre ponctuel de 45 micromètres. Conservez le fluide à moins 20 degrés Celsius. Les cellules érythroïdes, myéloïdes et lymphocytaires ou EML de souris utilisées dans ce protocole sont cultivées en suspension dans un milieu de base EML contenant un milieu de culture cellulaire BHK à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Maintenez les cellules EML à une faible densité de cellules avec une densité maximale de moins de 600 000 cellules par millilitre. Divisez les cellules tous les deux à trois jours dans un rapport de un à cinq passages aux cellules doucement, mais pas pendant plus de 10 générations pour épuiser les cellules positives de la lignée. Récoltez les cellules EML par centrifugation à 200 G pendant cinq minutes.

Lavez les cellules une fois avec du PBS et centrifugez-les à nouveau après avoir jeté le surnageant. Mettez à nouveau les cellules en suspension dans le PBS et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Le nombre de cellules est nécessaire pour déterminer la concentration d’anticorps dans l’étape suivante.

Isolez les cellules négatives de lignée ou négatives à l’aide d’un cocktail d’anticorps de lignée et d’un système de tri cellulaire activé magnétiquement selon les instructions du fabricant. Pour commencer cette procédure, faites tourner les cellules négatives à 200 G pendant cinq minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec du PBS et comptez les cellules avec un hémocytomètre.

Lavez les cellules deux fois avec un tampon de télécopie. Après le deuxième lavage, granulez les cellules à 200 G pendant cinq minutes. Étiquetez les cinq microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre avec les chiffres 1, 2, 3, 4 et cinq respectivement.

Remettre en suspension les cellules avec un volume approprié de faits tamponner à une concentration de 1 million de cellules par 100 microlitres. Ensuite, aliquote 100 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des cinq microtubes à centrifuger. Ajoutez un microgramme d’anticorps anti-souris CD 34 FE dans le tube un et le tube deux.

Mélangez doucement les tubes, incubez tous les tubes à quatre degrés Celsius pendant une heure dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez le point 25 microgrammes d’antica conjugué au PE, un anticorps et 20 microlitres d’une lignée conjuguée au PC. Cocktail d’anticorps à deux, ajoutez un point de 25 microgrammes d’antica conjugué PE, un anticorps au tube trois et 20 microlitres d’une lignée conjuguée PC.

Anticorps cocktail au tube quatre. Mélangez doucement les tubes et incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires dans l’obscurité. Après 30 minutes, ajoutez 300 microlitres de tampon de télécopie à tous les tubes et faites tourner les cellules à 200 G pendant cinq minutes.

Lavez les cellules trois fois avec 500 microlitres de tampon de télécopie après le lavage final. Resus suspend chaque pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de fax isole lin négatif SCA positif CD 34 positif et lin négatif SCA négatif CD 34 cellules négatives dans le tube un par tri cellulaire activé par fluorescence. L’ARN total est extrait des cellules CD 34 positives et CD 34 négatives à l’aide de triol et l’ADN contaminé est éliminé à l’aide de la nucléase désoxyribo one.

En suivant le protocole du fabricant, évaluer la qualité de l’ARN total à l’aide d’un bioanalyseur En suivant les instructions du fabricant, seuls des échantillons d’ARN ayant un indice d’intégrité de l’ARN ou un RIN supérieur à neuf sont utilisés pour l’extraction de l’ARNm et les procédures ultérieures de construction de la bibliothèque. Cette figure montre le résultat d’un échantillon d’ARN de haute qualité avec un RIN égal à 9,4. Le protocole de construction de bibliothèque utilisé ici est spécifique à la plateforme de séquençage d’ARN Illumina et utilise un kit de préparation d’échantillons d’ARN.

Suivez les instructions fournies par le fabricant, car seules les étapes sélectionnées sont illustrées dans cette vidéo. Commencez par sélectionner positivement le poly MNA à l’aide de billes magnétiques oligo DT. Ensuite, fragmentez le polyARNm et effectuez une transcription inverse à l’aide d’amorces aléatoires pour convertir l’ARNm en CD NA. Par la suite, le deuxième brin synthétisé CD NA est utilisé pour générer de l’ADN double brin.

Ensuite, les trois surplombs principaux sont retirés et les cinq surplombs principaux sont remplis par l’ADN polymérase denate. Les trois premiers extrémités des fragments de CD NA de se ligaturer les uns aux autres. Ajoutez des adaptateurs d’indexation multiplex aux deux extrémités du CD NA double brin pour le séquençage.

Enfin, effectuer une PCR pour l’enrichissement du CD NA pour les fragments à l’aide d’un spectrophotomètre : mesurer l’absorbance deux 60 sur l’absorbance deux 80 de l’ADN amplifié. Pour obtenir des informations sur la concentration de la banque, il faut évaluer la qualité de la banque et mesurer la gamme de tailles des fragments d’ADN à l’aide d’un bioanalyseur. Les méthodes d’analyse des données de séquençage de l’ARN se trouvent dans le protocole d’accompagnement Text et comprennent le traitement de fichiers de données pour l’analyse en aval, la détection de nouveaux transcrits et l’évaluation du niveau d’expression, la détection de gènes exprimés de manière différentielle et l’identification de facteurs de transcription exprimés de manière différentielle.

Les cellules EML négatives de la lignée ont été colorées avec des anticorps anti-CD 34 antica one et cocktail de lignée et un sca positif pour le crâne positif au lin et un sca négatif pour le crâne. Les cellules négatives du CD 34 ont été séparées à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence uniquement. Les cellules négatives de Lin ont été contrôlées pour l’analyse de l’expression de SCA one et de CD 34.

Deux populations de cellules EML ont été observées à la fin de la construction de la bibliothèque. La taille des fragments d’ADN dans la bibliothèque a été vérifiée à l’aide d’un bioanalyseur. Ces données représentatives montrent une bibliothèque de bonne qualité, mais la taille des fragments culminant à environ 300 paires de bases.

L’algorithme D-E-S-E-Q a été utilisé pour l’analyse de l’expression différentielle, en mettant l’accent sur les facteurs de transcription exprimés de manière différentielle, car les facteurs de transcription sont cruciaux pour la détermination du sulfate. Des facteurs de transcription qui changent de plus de 1,5 fois entre le CD 34 négatif positif et le CD 34 négatif négatif ont été trouvés et sont illustrés dans cette carte thermique. Notamment, le niveau d’expression relatif de TCF sept dans les cellules CD 34 positives négatives est plus de 100 fois plus élevé que celui des cellules CD 34 négatives négatives.

Ainsi, TCF sept a été choisi pour une analyse plus poussée de l’immunoprécipitation et du séquençage de la chromatine et des tests fonctionnels afin de confirmer sa fonction dans la régulation de l’auto-renouvellement et de la différenciation dans les cellules EML. Une fois maître, la banque d’ARN peut être terminée en quelques jours et l’ensemble de la procédure peut être terminée en environ un mois si elle est effectuée correctement après son développement. Cette technologie a ouvert la voie aux chercheurs qui sont prêts à explorer de manière différentielle l’expression génique entre divers types de cellules et de tissus tels que les cellules B et les cellules B malignes.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser un ARNt carrossable élevé, car c’est la base de toute la procédure de malade de l’ARN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon d’identifier les principaux régulateurs contrôlant le renouvellement et la différenciation des cellules EML.