Name: Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par lanalyse de lARN-séquençage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Découvrez l'analyse RNA-seq pour identifier les facteurs de transcription régulant l'auto-renouvellement et la différenciation des cellules EML murines. Cette méthode transcriptomique révèle les mécanismes clés de la biologie des cellules souches hématopoïétiques.

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JQW, SZ, SD et KC sont soutenus par des subventions des National Institutes of Health et du Fonds Staman Ogilvie – Fondation Memorial Hermann.

1. EML culture cellulaire et la séparation des cellules Lin-CD34 + et CD34-Lin en utilisant la cellule magnétique Système et tri cellulaire activé par fluorescence méthode de tri <ol><li> Préparation de rein de bébé hamster (BHK), du milieu de culture de cellules pour la collecte de facteur de cellules souches: <ol><li> Culture des cellules BHK dans un milieu DMEM contenant 10% de FBS en flacon de 25 cm2 (voir le tableau 1) à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Lorsque les cellules se développent à 80 - 90% de confluence, laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS. Ajouter 5 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,25% de la monocouche et on incube les cellules pendant 1-5 min à température ambiante (TA) jusqu'à ce que les cellules sont décollées. </li><li> Pipet la solution et doucement à briser des amas de cellules. Ajouter 5 ml de DMEM complet dans le ballon pour arrêter l'activité de la trypsine. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Enlever le milieu et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu BHK fraîches de culture cellulaire. </li> Transférer 2 ml de la suspension cellulaire de l'étape 1.1.4 dans un nouveau flacon de 75 cm 2 et ajouter 48 ml de milieu de culture de cellules BHK fraîches dans le ballon. </ol></li><li> Culture des cellules BHK pour deux jours et recueillir le milieu de culture. Passage du milieu à travers un filtre de 0,45 um. Conserver dans le milieu à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. </li></ol><li> EML culture cellulaire: <ol><li> Culture des cellules en suspension (EML) en milieu basique EML BHK contenant le milieu de culture des cellules (tableau 1) à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Maintenir les cellules EML à faible densité cellulaire (0,5 à 5 x 10 5 cellules / ml) avec la densité de crête inférieure à 5 x 10 6 cellules / ml. Diviser les cellules tous les 2 à 3 jours, à raison de 1: 5. Passage cellules EML doucement et jetez la culture après repiquage depuis 10 générations. </li></ol></li><li> L'épuisement des cellules positives de la lignée: <ol><li> Récolter les cellules EML par centrifugation à 200 xg for 5 min et laver les cellules une fois avec du PBS. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min. </li><li> Reprendre les cellules avec du PBS et compter les cellules avec un hémocytomètre. Déterminer la concentration d'anticorps dans l'étape de séparation ultérieure des cellules en fonction du nombre de cellules (se il vous plaît consulter les instructions proposées par le fournisseur du système d'isolement des cellules). </li><li> Isoler la lignée négative (Lin-) cellules en utilisant un cocktail d'anticorps de la lignée (cocktail d'anticorps monoclonaux conjugué à la biotine CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G / C), 7-4 et Ter-119 ) et un système magnétique de tri cellulaire activé selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Séparation des cellules Lin-CD34 + et CD34-Lin: <ol><li> Isoler les cellules Lin- de l'étape 1.3.3 à 200 g pendant 5 min. Remettre en suspension le culot de cellules avec du PBS et compter les cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Laver les cellules deux fois avec un tampon FACS et sédimenter les cellules à 200 xgpendant 5 min. </li><li> Étiqueter cinq 1,5 ml microtubes avec le numéro 1, 2, 3, 4, 5 respectivement. Reprendre les cellules avec 100 pi de tampon FACS pour 10 6 cellules (10 6 cellules par tube). </li><li> Ajouter 1 pg d'anticorps anti-souris CD34 FITC dans le tube 1 et tube 2 et mélanger doucement les tubes. </li><li> Incuber tous les tubes à 4 ° C pendant 1 heure dans l'obscurité. </li><li> Ajouter 0,25 pg d'anticorps anti-Sca1 PE-conjugué et 20 pl d'APC conjugué anticorps lignée de cocktail de tube 1, 0,25 pg d'anticorps anti-Sca1 conjugué à PE de tube 3, et 20 ul d'anticorps lignée cocktail de APC conjugué à tube 4. </li><li> Mélanger tous les tubes doucement et incuber les cellules à 4 ° C pendant encore 30 minutes dans le noir. </li><li> Ajouter 300 ul de tampon FACS pour les cellules et centrifuger les cellules à 200 g pendant 5 min. </li><li> Laver les cellules avec 500 pl de tampon FACS à trois reprises. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de FACS buffre. </li><li> Utilisez les cellules dans des tubes 2, 3, 4, et 5 pour la mise en place de compensation. Isoler les cellules Lin-SCA + CD34 + et Lin-SCA-CD34 dans le tube 1 en utilisant FACS Aria. </li></ol></li> 2. Préparation d'ARN et construction de la bibliothèque de séquençage à haut débit <ol><li> L'isolement, la qualité de l'analyse et la quantification de l'ARN: <ol><li> Extrait de l'ARN total de Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34 en utilisant respectivement TRIzol suivant le protocole fabrique ». </li><li> Retirer l'ADN en utilisant la désoxyribonucléase I contaminée (DNase I) selon le protocole du fabricant. Eventuellement, stocker l'ARN à -80 ° C à cette étape pour une utilisation ultérieure. </li><li> Évaluer la qualité des ARN total en utilisant Bioanalyzer selon les instructions offerts par le fournisseur. Utilisez échantillon d'ARN avec l'ARN Nombre intégrité (RIN) de bière à 9. </li></ol></li><li> Construction d'une bibliothèque et séquençage à haut débit: NOTE: Ce protocole décrit ARN-Seq en utilisant la plate-forme Illumina. Pourd'autres plates-formes de séquençage, différentes méthodes de préparation de bibliothèques sont nécessaires. <ol><li> Utilisez 0,1-4 ug d'ARN total de haute qualité par exemple pour la préparation bibliothèque. Normalement 2 ug d'ARN total peut être extrait à partir de 10 5 cellules EML. </li><li> Utiliser un système de préparation d'échantillons ARN-séquençage pour la purification d'ARN et de la fragmentation, premier et deuxième synthèse brin d'ADNc, réparation de fin, les extrémités 3 'adénylation, adaptateur ligature et l'amplification par PCR, en suivant les procédures standard détaillées par rapport aux instructions du fournisseur. <ol><li> Sélectionner positivement PolyA ARNm en utilisant oligo-dT billes magnétiques et fragmenter l'ARNm. </li><li> Effectuer transcription inverse en utilisant des amorces aléatoires pour obtenir l'ADNc et ensuite synthétiser le deuxième brin d'ADNc pour générer de l'ADNc double brin. </li><li> Retirez les surplombs »et remplir la 5 '3 surplombs par l'ADN polymérase. L'adénylate extrémités 3 'pour empêcher la ligature des fragments d'ADNc à partir d'une autre.</li><li> Ajouter adaptateurs d'indexation multiplex aux deux extrémités de l'ADNc-bc. Effectuer la PCR pour l'enrichissement de fragments d'ADN. </li></ol></li><li> Mesurer la A260 / A280 pour obtenir des informations sur la concentration de bibliothèque à l'aide d'un spectrophotomètre. </li><li> Évaluer la qualité de la bibliothèque et de mesurer la gamme de taille des fragments d'ADN en utilisant un Bioanalyzer. </li></ol></li></ol> 3. Analyse des données Pour référence des logiciels utilisés dans cette partie, se il vous plaît voir (tableau 2). <ol><li> le traitement des fichiers de données pour l'analyse en aval: <ol><li> Convertir .bcl (fichier d'appel de base) à déposer .fastq fichier en utilisant un logiciel de CASAVA (Illumina, la version 1.8.2). <ol><li> Lancez le 'Terminal' dans le système Linux. Allez dans le dossier de données qui contient le fichier de données à partir d'une machine de séquençage Illumina HiSeq2000. Supposons que le dossier de résultat est «NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX / ', le typedans la commande de la figure S1A, et entrer dans le dossier de données. </li><li> Installez CASAVA 1.8.2 dans le système Linux. Supposons que le outputfolder est «non aligné», utilisez la commande à la figure S1B pour préparer le fichier de configuration pour la conversion. Utilisez l'option --fastq-cluster-comptage 0 à assurer un seul fichier .fastq est créé pour chaque échantillon. Le fichier généré est .fastq au format .gz. Décompressez-le pour l'analyse en aval (Figure S1B). </li><li> Une fois le dossier 'Unaligned' a été généré, allez dans le dossier "Unaligned '(Figure S1C). </li><li> Utilisez la commande de la figure S1D pour commencer le processus de conversion. Le paramètre '-j' fournit le numéro d'unité centrale de traitement qui sera utilisé. </li><li> Après que le système a terminé le processus de conversion, allez dans le dossier de résultat sous dossier «non aligné» (Figure S1E). </li><li> Utilisez la commande de la figure S1F &lt;/ Strong&gt; pour décompresser le fichier .fastq.gz dans .fastq fichier sous chaque dossier de l'échantillon. </li></ol></li></ol></li><li> Détecter de nouveaux relevés de notes et d'évaluer le niveau d'expression en utilisant Tuxedo Suite 26: <ol><li> Plan de la fin de l'ARN-Seq couplé lit au génome de référence de la souris (UCSC version mm9, obtenu à partir de <a href="http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html" target="_blank">http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html</a> ) en utilisant un logiciel de Tophat (version 1.3.3) 27, qui utilise la Bowtie lire mappeur (version 0.12.7) 28. Tophat est fourni avec l'option "-no-nouveaux-juncs" pour améliorer la précision de l'estimation du niveau de l'expression. <ol><li> Mettez les fichiers .fastq dans un dossier où le processus de cartographie sera mise en œuvre. Supposons qu'il y ait 2 fichiers (renommer .fastq à Example1.read1, Example1.read2) pour un échantillon de séquençage paired fin, utilisez la commande à la figure S2 pour faire la cartographie (ajuster les paramètres en fonction de la configuration du système).Le paramètre "-p" fournit le nombre de CPU qui sera utilisé. Les paramètres "-r" et "-mate-STD-dev" peuvent être obtenus à partir de la bibliothèque QC ou déduites à partir d'un sous-ensemble de lit alignés (Figure S2). </li></ol></li><li> Assemblez la cartographie lit en transcrits d'ARN en utilisant le logiciel de manchette (version 1.3.0) 29. Boutons de manchette analyse avec le fichier d'annotation de gènes connus (même fichier .gtf utilisé par Tophat) et le fichier .bam produite par Tophat. <ol><li> Après Tophat terminé la course, dans le même dossier, utilisez la commande à la figure S3A afin de fonctionner boutons de manchette pour construire transcriptome et transcription estimer le niveau d'expression. Le 'mm9_repeatMasker.gtf' et les fichiers de séquence du génome dans le dossier 'GenomeSeqMM9' peuvent être obtenus à partir du navigateur UCSC Genome. </li><li> Les fichiers genes.expr et transcripts.expr obtenus contiennent la valeur de l'expression des gènes et des transcriptions (isoformes). Copier et collerle contenu du fichier dans un fichier Excel et de manipuler avec tableur (Figure S3B). </li><li> Utilisez la commande de la figure S3C à comparer la «transcripts.gtf 'fichier à la référence« mm9_genes.gtf' fichier résultant afin d'identifier de nouveaux relevés de notes. </li><li> Le fichier résultant contient .tmap le résultat de la comparaison. Copiez et collez le contenu du fichier dans un fichier Excel et manipuler avec tableur. Transcriptions avec le code de la classe «u» peuvent être considérés comme «roman» par rapport à la référence .gtf fichier fourni (Figure S3D). REMARQUE: Pour l'analyse en aval commodité, définissez les valeurs de FPKM à 0,1 si les valeurs sont en dessous de 0,1. REMARQUE: L'étape 3.2.3 - 3.2.6 est facultative pour ceux qui souhaitent améliorer la précision de l'estimation expression de nouveaux relevés de notes. Cela va prendre beaucoup plus de temps, parce que la cartographie et la construction du transcriptome doivent être rnon plus d'une fois. </li></ol></li><li> Exécutez Tophat en utilisant les paramètres par défaut et puis exécutez à boutons de manchette fichier .gtf généré à l'aide de la commande à la figure S3E. </li><li> Comparez le fichier de .gtf résultant dans le fichier .gtf du génome de référence en utilisant la commande à la figure S3F. </li><li> Analyser le fichier .tmap entraîné comme décrit à l'étape 3.2.2.4. Copiez et collez le contenu du fichier dans un fichier Excel et manipuler avec tableur. Transcriptions avec le code de la classe «u» peuvent être considérés comme «roman» par rapport à la référence .gtf fichier fourni. </li><li> Après l'étape 3.2.5, il existe un fichier de .combined.gtf dans le dossier qui peut être utilisé en tant que fichier de .gtf de référence. Une deuxième série de boutons de manchette Tophat et peut être réalisée comme décrit dans l'étape 3.2.1 et 3.2.2 pour obtenir une estimation plus précise de FPKM de nouveaux relevés de notes. </li></ol></li><li> Détecter differentially exprime des gènes en utilisant DESeq paquet de 30. <ol><li> L'entrée de DESeq est une brute tableau des chiffres de lecture. Pour obtenir un tel tableau, utilisez le script htseq comptage distribué avec le paquet HTSeq Python qui peut être téléchargé à partir du site HTSeq ( <a href="http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html" target="_blank">http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html</a> ) . <ol><li> Assurez-vous que samtools, python, et htseq comptage programsare installés dans le système. Obtenir des chiffres bruts de comptage de lecture de sortie de tophat en utilisant la commande à la figure S4A. </li><li> Préparer, des fichiers "ExperimentDesign.txt 'aide d'Excel' Raw_Count_Table.txt. Copiez et enregistrez le contenu au format .txt pour le paquet DESeq R (Figure S4B). </li><li> Installez programme de R dans le système. Dans le terminal, de type «R» et appuyez sur ENTER.A message sur écran appearas montré à la figure S4C. </li><li> Lire «Raw_Count_Table.txt »,« ExperimentDesign.txt 'dans R en utilisant la commande à la figure S4D. </li><li> Chargez paquet DESeq aide de la commande à la figure S4E. </li><li> Conditions factoriser dans R (Figure S4F). </li><li> Utilisez la commande de la figure S4G de réaliser des essais binominal négatif sur la table de comptage normalisée. </li><li> Utilisez la commande de la figure S4H de gènes exprimés sortie différentiels importants dans un fichier .csv. </li></ol></li></ol></li><li> Recherche des facteurs de transcription »(TFS) valeurs de FPKM à travers les échantillons en utilisant Excel. Intersection DE Table de gène et la table TF. Les gènes appartiennent à la fois à la table sont exprimés de manière différentielle des facteurs de transcription. <ol><li> Allez sur le site <a href="http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php" target="_blank">http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php</a> et télécharger les facteurs de transcription. Cherchez ensuite les facteurs de transcription de Dans le Excel (&lt; strong&gt; Figure S5). </li></ol></li><li> Génération fichier .bigwig pour UCSC navigateur génome visualisation. <ol><li> Télécharger le logiciel 'bedtools de partir du site Web <a href="https://github.com/arq5x/bedtools2" target="_blank">https://github.com/arq5x/bedtools2</a> et installer le logiciel dans le système 31. Télécharger de bedGraphToBigWig «les outils UCSC du site <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</a> et installer le logiciel dans le système. </li><li> Dans le dossier contenant le fichier de .bam, utilisez la commande à la figure S6A pour convertir le fichier généré par .bam tophat dans le fichier .bed. </li><li> Une fois le fichier .bed est produit, utilisez la commande à la figure S6B pour générer un fichier .bigwig. Le fichier 'ChromInfo.txt »peut être obtenu à partir de l'URL suivante:Arget = "_blank"&gt; http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz. </li><li> Observer un circuit personnalisé sur navigateur UCSC Genome. Consultez le site Web <a href="http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html</a> sur la façon d'afficher une piste personnalisée à l'aide UCSC navigateur génome. </li></ol></li></ol><img alt="Figure S1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig1.jpg"> Figure S1: Conversion de fichier .bcl à .fastq fichier en utilisant un logiciel de CASAVA. <img alt="Figure S2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig2.jpg"> Figure S2: Cartographie lit pour référencer génome en utilisant Tophat. <img alt="Figure S3" fo:contente-width='"5' pouces src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig3.jpg" files ftp_upload> Figure S3: détection de nouveaux relevés de notes et estimation du niveau d'expression. <img alt="Figure S4" fo:content-width="3.4in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig4.jpg"> Figure S4: Appel différentiel gène exprimé à l'aide DESeq paquet. <img alt="Figure S5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig5.jpg"> Figure S5: Identification des facteurs de transcription exprimés de manière différentielle. <img alt="Figure S6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig6.jpg"> Figure S6: Conversion résultat de la cartographie pour la visualisation des données.

<ol><li>Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+aging%3A+wrinkles+in+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential.</a> Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS genetics. 8, (2012).</li>
<li>Ye, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interactions+in+EML+cell+stimulation+by+stem+cell+factor+and+IL-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).</li>
<li>Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+progenitors+immortalized+by+a+retroviral+vector+harboring+a+dominant-negative+retinoic+acid+receptor+can+recapitulate+lymphoid%2C+myeloid%2C+and+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development.</a> Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).</li>
<li>Weiler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D3%3A+a+gene+induced+during+myeloid+cell+differentiation+of+Linlo+c-Kit%2B+Sca-1%28%2B%29+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells.</a> Blood. 93, 527-536 (1999).</li>
<li>Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+precursor+cells+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Chu, Y., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+platform+selection%2C+experimental+design%2C+and+data+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation.</a> Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).</li>
<li>Hornett, E. A., Wheat, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RNA-Seq+analysis+in+non-model+species%3A+assessing+transcriptome+assemblies+as+a+scaffold+and+the+utility+of+evolutionary+divergent+genomic+reference+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species.</a> BMC genomics. 13, 361(2012).</li>
<li>Eswaran, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+cancer+reveals+novel+splicing+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations.</a> Scientific reports. 3, 1689(2013).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptomes+during+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+revealed+by+short%2C+long%2C+and+paired-end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).</li>
<li>Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+of+Arabidopsis+pollen+uncovers+novel+transcription+and+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing.</a> Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).</li>
<li>Edgren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fusion+genes+in+breast+cancer+by+paired-end+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.</a> Genome biology. 12, 6(2011).</li>
<li>Ilott, N. E., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+long+non-coding+RNAs+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing.</a> Methods. 63, 50-59 (2013).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+novel+long+non-coding+RNAs+based+on+RNA-Seq+data+of+mouse+Klf1+knockout+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study.</a> BMC bioinformatics. 13, 331(2012).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sequencing+of+the+siRNAs+associated+with+peach+latent+mosaic+viroid+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection.</a> BMC molecular biology. 11, 16(2010).</li>
<li>Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+nucleotide+variations+in+expressed+exons+of+the+human+genome+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq.</a> Nucleic acids research. 37, 106(2009).</li>
<li>Djari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-based+single+nucleotide+polymorphism+discovery+in+bovine+muscle+using+next-generation+transcriptomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing.</a> BMC genomics. 14, 307(2013).</li>
<li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+studies+using+microarrays%3A+principles%2C+problems%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+physiology+education%22%5BJournal%5D)">Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects.</a> Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+characterization+of+spinal+cord+injury+transcriptome+in+acute%2Fsubacute+phases%3A+a+resource+for+understanding+the+pathology+at+the+systems+level%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level.</a> PLoS one. 8, 72567(2013).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome research. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+analyze+gene+expression+using+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">How to analyze gene expression using RNA-sequencing data.</a> Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).</li>
<li>Glenn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+guide+to+next-generation+DNA+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Field guide to next-generation DNA sequencers.</a> Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nature protocols. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome biology. 11, 106(2010).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Cheranova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+transcriptomes+in+thrombin-treated+and+control+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnimalTFDB%3A+a+comprehensive+animal+transcription+factor+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database.</a> Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+transcribed+loci+in+ENCODE+regions+using+RACE+sequencing+reveals+extensive+transcription+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome.</a> Genome Biol. 9, 3(2008).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li>
<li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction%2C+RT-PCR%2C+and+direct+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li>
<li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human%2C+mouse%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li>
<li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+J+%22Characterize+Mammalian+Transcriptome+Complexity%22">Characterize Mammalian Transcriptome Complexity</a>. , LAP Lambert Academic Publishing. (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Transcriptome des mammifères est très complexe 34-38. technologie de l&#39;ARN-Seq joue un rôle de plus en plus important dans les études d&#39;analyse du transcriptome, roman détection des transcriptions et seul nucléotide découverte de variation etc. Il présente de nombreux avantages par rapport aux autres méthodes d&#39;analyse de l&#39;expression des gènes. Comme mentionné dans l&#39;introduction, il surmonte les artefacts d&#39;hybridation de micro-réseau et peut être utilisé pour identif...

Les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules sanguines rares qui se trouvent principalement dans la niche de la moelle osseuse adulte. Ils sont responsables de la production de cellules nécessaires pour reconstituer le sang et le système immunitaire 1. Comme une sorte de cellules souches, cellules souches hématopoïétiques sont capables à la fois de l&#39;auto-renouvellement et de différenciation. Mécanismes qui contrôlent la décision de sort de CSH élucider, soit vers l&#39;auto-renouvellement ou de la différenciation, offrira de précieux conseils sur la manipulation de cellules souches hématopoïétiques pour les recherches de maladies du sang et de l&#39;utilisation clinique 2. Un problème rencontré par les chercheurs est que les CSH peuvent être maintenues et développées in vitro dans une mesure très limitée; la grande majorité de leur progéniture sont partiellement différenciées en culture 2. Afin d&#39;identifier les principaux régulateurs qui contrôlent les processus d&#39;auto-renouvellement et de différenciation à l&#39;échelle de l&#39;ensemble du génome, nous avons utilisé une primitive hématopoïétique ligne de cellules souches de souris EML en tant que système modèle. Thest la lignée cellulaire a été dérivée à partir de 3,4 murin de la moelle osseuse. Lorsque nourris avec différents facteurs de croissance, les cellules peuvent se différencier en EML érythroïdes, myéloïdes, lymphoïdes et des cellules in vitro 5. Surtout, cette lignée cellulaire peut être propagé en grande quantité dans le milieu de culture contenant un facteur de cellules souches (SCF) et en conservant leur multipotentialité. EML cellules peuvent être séparés en sous-groupes d&#39;auto-renouvellement Lin-SCA + CD34 + et les cellules différenciées partiellement Lin-SCA-CD34 sur la base de marqueurs de surface CD34 et SCA 6. Similaire à court terme CSH, SCA + CD34 + cellules sont capables d&#39;auto-renouvellement. Lorsqu&#39;ils sont traités avec SCF, Lin-SCA + des cellules CD34 + peut régénérer rapidement une population mixte de Lin-SCA + et les cellules CD34 + Lin-SCA-CD34 et continuent à proliférer 6. Les deux populations sont similaires dans la morphologie et des niveaux similaires de c-kit ARNm et la protéine 6. Des cellules Lin-SCA-CD34 sont capables de se propager dans un milieu contenant IL-3 à la place de SCF 3. Unveiling régulateurs clés dans la décision du destin cellulaire EML à offrir une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires à transition précoce de développement au cours de l&#39;hématopoïèse. Afin d&#39;étudier les différences moléculaires sous-jacents entre le Lin-SCA auto-renouvellement + CD34 + et les cellules Lin-SCA-CD34 partiellement différenciées, nous avons utilisé l&#39;ARN-Seq pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle. En particulier, nous nous concentrons sur les facteurs de transcription, des facteurs de transcription jouent un rôle crucial dans la détermination du destin cellulaire. ARN-Seq est une approche développée récemment qui utilise les capacités de séquençage de nouvelle génération (NGS) technologies de profil et de quantifier les ARN transcrits à partir de 7,8 génome. En bref, l&#39;ARN total est le poly-A et fragmenté choisi comme modèle initial template.The ARN est ensuite converti en ADNc en utilisant la transcriptase inverse. Afin de cartographier des transcrits d&#39;ARN de pleine longueur, en utilisant intact, l&#39;ARN non dégradé pour la construction de la banque d&#39;ADNc est importante. Pour le purpose de séquençage, des séquences d&#39;adaptation spécifiques sont ajoutées aux deux extrémités de l&#39;ADNc. Ensuite, dans la plupart des cas, les molécules d&#39;ADNc sont amplifiés par PCR et séquences d&#39;une manière à haut débit. Après séquençage, résultant lectures peut être aligné sur un génome de référence et une base de données de transcriptome. Le numéro de la carte qui lit le gène de référence est prise en compte et cette information peut être utilisée pour estimer le niveau d&#39;expression du gène. Le lit peut également être assemblé de novo sans un génome de référence, ce qui permet l&#39;étude de transcriptome dans les organismes non-modèles 9. la technologie de l&#39;ARN-seq a également été utilisé pour détecter les isoformes d&#39;épissage 10 à 12, de nouveaux transcrits 13 et 14 des fusions de gènes. En plus de la détection de gènes codant pour des protéines, de l&#39;ARN-Seq peut également être utilisé pour détecter et analyser nouveau niveau d&#39;ARN non codants, tels que la transcription de l&#39;ARN de long 15,16, 17 micro-ARN, etc. siRNA 18 non codante. En raison de til précision de cette méthode, il a été utilisé pour la détection de variations nucléotidiques simples 19,20. Avant l&#39;avènement de la technologie de l&#39;ARN-Seq, puces à ADN est la principale méthode utilisée pour analyser le profil d&#39;expression génique. Sondes pré-synthétisées sont conçus et ensuite fixés à une surface solide pour former une lame de microréseau 21. L&#39;ARNm est extrait et converti en ADNc. Au cours du processus de transcription inverse, les nucleotides marqués par fluorescence sont incorporés dans l&#39;ADNc et l&#39;ADNc peuvent être hybridés sur les lames de puces à ADN. L&#39;intensité du signal recueilli à partir d&#39;un endroit précis dépend de la quantité d&#39;ADNc de liaison à la sonde spécifique à cet endroit 21. Par rapport à la technologie de l&#39;ARN-Seq, puces à ADN a plusieurs limites. Tout d&#39;abord, puces à ADN repose sur la connaissance préalable de l&#39;annotation des gènes, tandis que la technologie de l&#39;ARN-Seq est capable de détecter de nouveaux relevés de notes au niveau de fond élevé relative, ce qui limite son utilisation lorsque geniveau d&#39;expression ne est faible. En outre, la technologie de l&#39;ARN-Seq a beaucoup plus dynamique portée de détection (8000 fois) 7, tandis que, en raison de fond et la saturation des signaux, l&#39;exactitude des puces à ADN est limitée pour les deux gènes fortement exprimés et humble 7,22. Enfin, des sondes de puces à ADN diffèrent dans leur efficacité d&#39;hybridation, ce qui rend les résultats moins fiables lors de la comparaison des niveaux d&#39;expression relatifs des différents produits de transcription au sein d&#39;un échantillon 23. Bien que l&#39;ARN-Seq a de nombreux avantages par rapport aux puces à ADN, l&#39;analyse des données est complexe. Ceci est une des raisons pour lesquelles de nombreux chercheurs utilisent encore microarray la place de l&#39;ARN-Seq. Divers outils de bioinformatique sont nécessaires pour le traitement et l&#39;analyse des données 24 ARN-Seq. Parmi plusieurs séquençage de nouvelle génération (NGS), les plates-formes 454, Illumina, Torrent SOLIDE et Ion sont les plus largement utilisés. 454 a été la première plate-forme commerciale NGS. A la différence des autres plates-formes de séquençagelongueur comme Illumina et solide, la plate-forme 454 génère plus lus (moyenne 700 BASE lit) 25. Plus de lectures est mieux pour la caractérisation initiale de transcriptiome en raison de leur plus assembler efficacité 25. Le principal inconvénient de la plate-forme 454 est son coût élevé par mégabase de séquence. Le Illumina et solides plates-formes de générer lit avec une augmentation du nombre et de courtes longueurs. Le coût par mégabase de séquence est beaucoup plus faible que la plate-forme 454. En raison du grand nombre de court interprète pour l&#39;Illumina et solides plates-formes, l&#39;analyse des données est beaucoup plus de calculs. Le prix de l&#39;instrument et des réactifs pour le séquençage de la plate-forme Ion Torrent est moins cher et le temps de séquençage est plus courte de 25. Cependant, le taux d&#39;erreur et le coût par mégabase de séquence sont plus élevés par rapport à la Illumina et les plates-formes solides. Différentes plates-formes ont leurs propres avantages et inconvénients et nécessitent des méthodes d&#39;analyse des données. Le platform devraient être choisis en fonction du but de séquençage et la disponibilité des fonds. Dans cet article, nous prenons plate-forme Illumina ARN-Seq comme un exemple. Nous avons utilisé cellule EML en tant que système modèle pour étudier les régulateurs clés dans EML cellule auto-renouvellement et de différenciation, et a fourni une des méthodes détaillées de la construction de la bibliothèque de l&#39;ARN-Seq et l&#39;analyse de données pour le calcul du niveau d&#39;expression et roman détection de transcription. Nous avons montré dans notre précédente publication de cette étude de l&#39;ARN-Seq dans EML système modèle 2, lorsqu&#39;il est couplé avec un test fonctionnel (par exemple shRNA de knockdown) fournir une approche puissante dans la compréhension du mécanisme moléculaire des premiers stades de la différenciation hématopoïétique, et peut servir de modèle pour l&#39;analyse de cellules auto-renouvellement et de différenciation en général.

<table><tbody><tr><td>Antibiotique-Antimycosique</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Culture cellulaire BHK</td></tr><tr><td>Anti-souris CD34 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-81</td><td>Tri FACS</td></tr><tr><td>Anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-81</td><td>Tri</td></tr><tr><td>FACS Lignée de souris Cocktail d’anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>558074</td><td>Tri FACS</td></tr> BD <tr><td>Trieur de cellules FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td>Offre spéciale sysmtem</td><td>FACS tri</td></tr><tr><td>Corning&trade ; Fioles traitées pour culture cellulaire 75 cm2</td><td>Corning incorporé</td><td>430641</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Corning&trade ; Culture cellulaire Flacons traités 25 cm2</td><td>Corning incorporé</td><td>430639</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I, Amplification Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015 Préparation de</td><td>la bibliothèque</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>BHK culture cellulaire</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140071</td><td>Culture cellulaire BHK</td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Invitrogen</td><td>16050-122</td><td>Culture cellulaire EML</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>HyClone</td><td>SH30228.02</td><td>Culture cellulaire EML</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Kit de déplétion cellulaire de lignée, souris</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Isolement des cellules négatives de lignée</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoVue Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9569-62</td><td>Contrôle de la qualité</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade ; Napco&commerce ; 8000 Incubateurs CO2 à chemise d’eau</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-497-002</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Culture cellulaire EML</td></tr><tr><td>TRIzol&reg ; Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Exraction d’ARN</td></tr><tr><td>TruSeq&trade ; Kit de préparation d’échantillons d’ARN v2 -Set B (48 rxn)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2002 Préparation de</td><td>la bibliothèque</td></tr><tr><td>2100 Électrophorèse Bioanalyseur Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td>Contrôle qualité</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>0,45 & micro ; m Seringue Filtres</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td>Culture cellulaire</td></tr></tbody></table>

identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs eml par l&#39;analyse de l&#39;arn-séquençage

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont utilisés en clinique pour le traitement de la greffe à reconstruire le système hématopoïétique d&#39;un patient dans de nombreuses maladies telles que la leucémie et le lymphome. Élucider les mécanismes contrôlant CSH auto-renouvellement et de différenciation est important pour l&#39;application de CSH pour la recherche et les utilisations cliniques. Cependant, il est impossible d&#39;obtenir des CSH en grande quantité en raison de leur incapacité à proliférer in vitro. Pour surmonter cet obstacle, nous avons utilisé une lignée de cellules dérivées de la moelle osseuse de souris, la lignée cellulaire EML (érythroïde, myéloïde et lymphoïde), en tant que système modèle pour cette étude. ARN-séquençage (ARN-Seq) a été de plus en plus utilisés pour remplacer les puces à ADN pour les études d&#39;expression génique. Nous rapportons ici une méthode détaillée de l&#39;utilisation de la technologie de l&#39;ARN-Seq pour enquêter sur les facteurs clés potentiels dans la régulation de la cellule EML auto-renouvellement et de différenciation. Le protocole fourni dans le présent document est divisé en trois parties. La première part explique comment la culture de cellules EML et séparé Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34. La deuxième partie du protocole propose des procédures détaillées pour la préparation d&#39;ARN total et la construction de la bibliothèque ultérieure pour le séquençage à haut débit. La dernière partie décrit la méthode d&#39;analyse de données RNA-Seq et explique comment utiliser les données pour identifier les facteurs de transcription exprimés de manière différentielle entre Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34. Les facteurs de transcription plus nettement exprimés de manière différentielle ont été identifiés comme les principaux régulateurs potentiels contrôle cellule EML auto-renouvellement et de différenciation. Dans la section de discussion de cet article, nous mettons en évidence les étapes clés de la performance réussie de cette expérience. En résumé, ce document propose une méthode d&#39;utilisation de la technologie de l&#39;ARN-Seq pour identifier des régulateurs potentiels de l&#39;auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules EML. Les principaux facteurs identifiés sont soumis à l&#39;analyse fonctionnelle en aval in vitro et in vivo.

Afin d'analyser les gènes exprimés de manière différentielle dans Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34 EML, nous avons utilisé la technologie de l'ARN-Seq. La figure 1 montre le flux de travail des procédures. Après isolement de cellules de la lignée négatifs par tri magnétique de cellules, nous nous sommes séparés Lin-SCA + CD34 + et les cellules Lin-SCA-CD34 en utilisant FACS Aria. EML cellules Lin-enrichis ont été colorées avec anti-CD34, anti-Sca1 et anticorps de cocktail de la lignée. Seules les cel...

Analyses ARN de séquençage et de bioinformatique ont été utilisés pour identifier les facteurs de transcription de manière significative et exprimés de manière différentielle dans des sous-populations Lin-CD34 + et CD34 Lin-des EMLcells de souris. Ces facteurs de transcription peuvent jouer un rôle important dans la détermination de l&#39;interrupteur entre les cellules Lin-CD34 auto-renouvellement Lin-CD34 + et partiellement différenciés.

Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l&#39;analyse de l&#39;ARN-séquençage

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les régulateurs clés potentiels de l’auto-renouvellement et de la différenciation des cellules EML de souris en utilisant la technologie de séquençage de l’ARN. Ceci est accompli en séparant d’abord les cellules EML CD 34 positives négatives de lignée et les cellules EML négatives CD 34 négatives de lignée en fonction de marqueurs de surface. La deuxième étape consiste à isoler l’ARNm, à convertir l’ARNm en ADNc et à préparer la banque pour le séquençage.Ensuite, la banque d’ADN est soumise à un séquençage à haut débit. La dernière étape consiste à analyser les résultats du séquençage et à rechercher des facteurs de transcription exprimés de manière différentielle. En fin de compte, la technologie de séquençage de l’ARN est utilisée pour montrer les facteurs de transcription exprimés de manière différentielle dans les cellules CD-34 positives et CD-34 négatives négatives.Le principal avantage du séquençage de l’ARN par rapport à d’autres méthodes d’expression G telles que les microrayons, est qu’il a une sensibilité, une précision et une plage dynamique plus larges, et qu’il ne repose pas sur des informations d’annotation de gènes préexistantes. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des cellules souches, telles que quels sont les facteurs clés de transcription régulant l’auto-renouvellement et la différenciation cellulaires. L’implication de cette technique s’étend à l’endroit où le traitement des maladies du sang, car une meilleure compréhension du régulateur clé contrôlant les cellules précurseurs hématopoïétiques, l’auto-renouvellement et la différenciation peuvent conduire au développement de traitements efficaces.En général, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car divers outils bioinformatiques sont nécessaires pour l’analyse de séquençage. Les cellules de rein de bébé hamster ou BHK pour la collecte du facteur de cellules souches sont cultivées dans un milieu dmem contenant 10 % de FBS dans un flacon de 25 centimètres carrés, à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Lorsque les cellules ont atteint 80 à 90 % de confluence trypsine yeux et qu’elles sont collectées par centrifugation à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante, jeter le snat et remettre en suspension la palette cellulaire dans 10 millilitres de milieu de culture cellulaire BHK frais.Transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans un nouveau flacon de 75 centimètres carrés dans une application et ajoutez 48 millilitres de culture cellulaire BHK fraîche. Moyenne à la culture en flacon. Les cellules BHK pendant deux jours.Après deux jours, récupérez le milieu de culture et passez-le à travers un filtre ponctuel de 45 micromètres. Conservez le fluide à moins 20 degrés Celsius. Les cellules érythroïdes, myéloïdes et lymphocytaires ou EML de souris utilisées dans ce protocole sont cultivées en suspension dans un milieu de base EML contenant un milieu de culture cellulaire BHK à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.Maintenez les cellules EML à une faible densité de cellules avec une densité maximale de moins de 600 000 cellules par millilitre. Divisez les cellules tous les deux à trois jours dans un rapport de un à cinq passages aux cellules doucement, mais pas pendant plus de 10 générations pour épuiser les cellules positives de la lignée. Récoltez les cellules EML par centrifugation à 200 G pendant cinq minutes.Lavez les cellules une fois avec du PBS et centrifugez-les à nouveau après avoir jeté le surnageant. Mettez à nouveau les cellules en suspension dans le PBS et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Le nombre de cellules est nécessaire pour déterminer la concentration d’anticorps dans l’étape suivante.Isolez les cellules négatives de lignée ou négatives à l’aide d’un cocktail d’anticorps de lignée et d’un système de tri cellulaire activé magnétiquement selon les instructions du fabricant. Pour commencer cette procédure, faites tourner les cellules négatives à 200 G pendant cinq minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec du PBS et comptez les cellules avec un hémocytomètre.Lavez les cellules deux fois avec un tampon de télécopie. Après le deuxième lavage, granulez les cellules à 200 G pendant cinq minutes. Étiquetez les cinq microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre avec les chiffres 1, 2, 3, 4 et cinq respectivement.Remettre en suspension les cellules avec un volume approprié de faits tamponner à une concentration de 1 million de cellules par 100 microlitres. Ensuite, aliquote 100 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des cinq microtubes à centrifuger. Ajoutez un microgramme d’anticorps anti-souris CD 34 FE dans le tube un et le tube deux.Mélangez doucement les tubes, incubez tous les tubes à quatre degrés Celsius pendant une heure dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez le point 25 microgrammes d’antica conjugué au PE, un anticorps et 20 microlitres d’une lignée conjuguée au PC. Cocktail d’anticorps à deux, ajoutez un point de 25 microgrammes d’antica conjugué PE, un anticorps au tube trois et 20 microlitres d’une lignée conjuguée PC.Anticorps cocktail au tube quatre. Mélangez doucement les tubes et incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires dans l’obscurité. Après 30 minutes, ajoutez 300 microlitres de tampon de télécopie à tous les tubes et faites tourner les cellules à 200 G pendant cinq minutes.Lavez les cellules trois fois avec 500 microlitres de tampon de télécopie après le lavage final. Resus suspend chaque pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de fax isole lin négatif SCA positif CD 34 positif et lin négatif SCA négatif CD 34 cellules négatives dans le tube un par tri cellulaire activé par fluorescence. L’ARN total est extrait des cellules CD 34 positives et CD 34 négatives à l’aide de triol et l’ADN contaminé est éliminé à l’aide de la nucléase désoxyribo one.En suivant le protocole du fabricant, évaluer la qualité de l’ARN total à l’aide d’un bioanalyseur En suivant les instructions du fabricant, seuls des échantillons d’ARN ayant un indice d’intégrité de l’ARN ou un RIN supérieur à neuf sont utilisés pour l’extraction de l’ARNm et les procédures ultérieures de construction de la bibliothèque. Cette figure montre le résultat d’un échantillon d’ARN de haute qualité avec un RIN égal à 9,4. Le protocole de construction de bibliothèque utilisé ici est spécifique à la plateforme de séquençage d’ARN Illumina et utilise un kit de préparation d’échantillons d’ARN.Suivez les instructions fournies par le fabricant, car seules les étapes sélectionnées sont illustrées dans cette vidéo. Commencez par sélectionner positivement le poly MNA à l’aide de billes magnétiques oligo DT. Ensuite, fragmentez le polyARNm et effectuez une transcription inverse à l’aide d’amorces aléatoires pour convertir l’ARNm en CD NA. Par la suite, le deuxième brin synthétisé CD NA est utilisé pour générer de l’ADN double brin.Ensuite, les trois surplombs principaux sont retirés et les cinq surplombs principaux sont remplis par l’ADN polymérase denate. Les trois premiers extrémités des fragments de CD NA de se ligaturer les uns aux autres. Ajoutez des adaptateurs d’indexation multiplex aux deux extrémités du CD NA double brin pour le séquençage.Enfin, effectuer une PCR pour l’enrichissement du CD NA pour les fragments à l’aide d’un spectrophotomètre : mesurer l’absorbance deux 60 sur l’absorbance deux 80 de l’ADN amplifié. Pour obtenir des informations sur la concentration de la banque, il faut évaluer la qualité de la banque et mesurer la gamme de tailles des fragments d’ADN à l’aide d’un bioanalyseur. Les méthodes d’analyse des données de séquençage de l’ARN se trouvent dans le protocole d’accompagnement Text et comprennent le traitement de fichiers de données pour l’analyse en aval, la détection de nouveaux transcrits et l’évaluation du niveau d’expression, la détection de gènes exprimés de manière différentielle et l’identification de facteurs de transcription exprimés de manière différentielle.Les cellules EML négatives de la lignée ont été colorées avec des anticorps anti-CD 34 antica one et cocktail de lignée et un sca positif pour le crâne positif au lin et un sca négatif pour le crâne. Les cellules négatives du CD 34 ont été séparées à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence uniquement. Les cellules négatives de Lin ont été contrôlées pour l’analyse de l’expression de SCA one et de CD 34.Deux populations de cellules EML ont été observées à la fin de la construction de la bibliothèque. La taille des fragments d’ADN dans la bibliothèque a été vérifiée à l’aide d’un bioanalyseur. Ces données représentatives montrent une bibliothèque de bonne qualité, mais la taille des fragments culminant à environ 300 paires de bases.L’algorithme D-E-S-E-Q a été utilisé pour l’analyse de l’expression différentielle, en mettant l’accent sur les facteurs de transcription exprimés de manière différentielle, car les facteurs de transcription sont cruciaux pour la détermination du sulfate. Des facteurs de transcription qui changent de plus de 1,5 fois entre le CD 34 négatif positif et le CD 34 négatif négatif ont été trouvés et sont illustrés dans cette carte thermique. Notamment, le niveau d’expression relatif de TCF sept dans les cellules CD 34 positives négatives est plus de 100 fois plus élevé que celui des cellules CD 34 négatives négatives.Ainsi, TCF sept a été choisi pour une analyse plus poussée de l’immunoprécipitation et du séquençage de la chromatine et des tests fonctionnels afin de confirmer sa fonction dans la régulation de l’auto-renouvellement et de la différenciation dans les cellules EML. Une fois maître, la banque d’ARN peut être terminée en quelques jours et l’ensemble de la procédure peut être terminée en environ un mois si elle est effectuée correctement après son développement. Cette technologie a ouvert la voie aux chercheurs qui sont prêts à explorer de manière différentielle l’expression génique entre divers types de cellules et de tissus tels que les cellules B et les cellules B malignes.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser un ARNt carrossable élevé, car c’est la base de toute la procédure de malade de l’ARN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon d’identifier les principaux régulateurs contrôlant le renouvellement et la différenciation des cellules EML.

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