Utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides d'auto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures

L’objectif global de cette procédure est d’introduire un modèle de clip de compression de contusion de LME cervicale chez le rat, ainsi qu’un protocole de traitement combiné impliquant l’injection de SAP et la transplantation de NPC. Tout d’abord, une pince d’anévrisme est placée autour de la moelle épinière et maintenue en place pendant une minute. Il en résulte une blessure bilatérale par compression par contusion.

Ensuite, les PAG sont injectés à l’épicentre de la blessure, les PNJ sont injectés immédiatement après l’injection de SAP. Une pompe osmotique avec un cathéter sous-dural est insérée pour l’administration soutenue de facteurs de croissance. Cette procédure entraîne l’administration de NPC à la moelle épinière blessée.

La survie et la greffe des NPC sont soutenues par un traitement combinatoire avec des PAS et des facteurs de croissance. Les implications de cette technique s’étendent à une thérapie pour les lésions traumatiques de la moelle épinière, car elle fournit un modèle cliniquement pertinent qui peut être utilisé pour étudier les thérapies COMBINATOR basées sur les cellules qui favorisent la régénération de la moelle épinière. Le protocole expérimental suivant a été approuvé par le Comité de protection des animaux du Réseau universitaire de santé, à Toronto, au Canada, et est conforme aux politiques établies dans le Guide sur le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation préparé par le Conseil canadien de protection des animaux.

Toutes les interventions chirurgicales doivent être effectuées dans des conditions stériles à l’aide d’équipements et de solutions stériles, et selon les directives de l’établissement et du gouvernement, cette procédure utilise des rats pesant de 250 à 270 grammes avant de commencer la procédure. Donnez aux animaux des antibiotiques dans l’eau de boisson pendant deux jours le jour de l’intervention. Après avoir placé le rat dans une chambre d’anesthésie et induit une anesthésie avec 5 % de fluor ISO dans de l’oxygène et du protoxyde d’azote pendant une minute, réduisez le fluor ISO à 1,8 à 2,2 %, appliquez la pommade lambic sur les yeux et confirmez l’anesthésie chirurgicale en effectuant un pincement de la patte.

Placez ensuite le rat sur un coussin chauffant et fixez la tête dans un cadre stéréotaxique avec un cône nasal. Après avoir rasé la fourrure autour de la colonne cervicale, désinfectez la peau par écouvillonnage avec de la povidone iodée, suivie de 70 % d’éthanol après avoir fait une incision médiane de la région des deux vertèbres cervicales C jusqu’au processus proéminent du corps vertébral thoracique T deux. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la couche externe des muscles vertébraux directement sur la ligne médiane dans une direction de dorlotement crânien, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour disséquer les couches musculaires plus profondes jusqu’à ce que le processis, l’osis et le laminé soient atteints.

Insérez les rapporteurs et maintenez-les. Ouvrez les couches musculaires, puis orientez le processis posis proéminent du corps de la vertèbre T deux et identifiez les niveaux ciblés pour la laminectomie. Ensuite, utilisez un scalpel numéro 15 pour couper le ligament afin de desserrer le lamini et le processis posis.

Ensuite, utilisez un coupe-os pour couper la lame latérale à la moelle épinière et retirez doucement la lame sans comprimer la moelle épinière. Prenez maintenant un moment pour identifier les racines nerveuses émergentes afin de les éviter de se couper. Ensuite, à l’aide d’un crochet, détacher la dure-mère ventrale de la face dorsale des corps vertébraux et préparer un couloir pour le clip.

Assurez-vous que le ressort annulaire du clip est réglé pour fournir la force souhaitée. La force du clip détermine l’étendue du traumatisme et de la compression. Insérez le clip ouvert autour de la moelle épinière et laissez-le se refermer pour induire une contusion.

Des forces de coupe comprises entre 15 et 35 grammes sont souvent utilisées avec une durée de coupe d’une minute après la lésion de la moelle épinière. Retirez le clip et fermez les muscles en deux couches, puis fermez la peau. Une fois la plaie bien refermée, arrêtez l’anesthésie et observez le rat pendant qu’il se réveille.

Une fois que l’animal a repris une conscience suffisante pour le sternal, couché, placez le rat dans une cage propre. En raison de la gravité de ce type de blessure, il est impératif de suivre les traitements postopératoires suivants. Tout d’abord, assurez-vous d’administrer des analgésiques tels que la buprénorphine et le méloxicam pendant trois à cinq jours selon les symptômes.

Prévenez également la déshydratation par voie sous-cutanée. Injecter cinq à 10 millilitres de solution saline deux fois par jour pendant trois jours, et continuer à fournir des antibiotiques dans l’eau potable pendant cinq jours. Après l’opération. Pressez la vessie deux à trois fois par jour jusqu’à ce que la fonction vésicale se rétablisse soit constante, même après que les animaux semblent guéris.

Assurez-vous d’observer les animaux opérés pour détecter les déficits neurologiques et l’état physiologique. L’injection est effectuée 14 jours après la lésion de la moelle épinière. Avant de commencer l’opération, préparez les SAP à une concentration de 1 % en poids par volume dans de l’eau stérile et remplissez un capillaire en verre de 100 micromètres attaché à une seringue Hamilton.

Avec la solution, fixez la seringue Hamilton au cadre stéréotaxique. Après l’anesthésie, le rat fixe la tête dans le cadre stéréotaxique et désinfecte le site de la chirurgie avec de la povidone iodée et de l’alcool à 70 %. Comme précédemment, une fois de plus, après avoir ouvert la peau, disséquez soigneusement la paire de muscles vertébraux et insérez des écarteurs.

Utilisez un scalpel numéro 15 pour retirer le tissu cicatriciel de la dure-mère et réexposer le site de la lésion. Utilisez ensuite la pointe d’une aiguille pointue pour ouvrir la dure-mère avec précaution. Enfin, par stéréotaxie, insérez le capillaire de verre à une profondeur de deux millimètres dans la moelle épinière traumatisée et injectez les SAP.

Après l’injection des SAP, laissez le capillaire rester au site d’injection pendant une minute avant de le retirer pour permettre l’étirement des tissus afin de s’adapter à la solution injectée. Ensuite, répétez l’injection au site suivant. Ici, des NPC ont été isolés de la zone paraventriculaire d’une souris rouge SD adulte et cultivés selon des procédures précédemment publiées.

Juste avant la micro-injection, diluez les NPC dans un milieu de croissance à une concentration de 50 fois 10 à la troisième cellules vivantes par microlitre pour la transplantation cellulaire et chargez-les dans un capillaire en verre sur une seringue Hamilton. Les NPC sont injectés immédiatement après l’injection des PAS. Pour ce faire, insérez le capillaire en verre de la seringue Hamilton à 0,2 millimètre rostral du site de la blessure et à 1,5 millimètre sous la surface dorsale de la moelle épinière.

Injectez deux microlitres de suspension cellulaire à un rythme d’environ 0,5 microlitre par minute. Une fois la première injection terminée, laissez le capillaire rester dans la moelle épinière pendant une minute comme auparavant, puis rétractez le capillaire, déplacez-le vers un site adjacent et répétez la procédure d’injection. Après avoir attendu une minute, comme précédemment, rétractez le capillaire et déplacez-le de deux millimètres de codding jusqu’au site de la blessure.

Effectuez deux injections de deux microlitres à cet endroit. Cette image montre tous les sites d’injection relatifs à la lésion de la moelle épinière. L’implantation de mini-pompes osmotiques sous-durales pour le soutien du facteur de croissance est effectuée immédiatement après les injections de NPC.

Choisissez d’abord un site d’implantation. Les sites préférés sont les flancs latéraux de la région thoraco-abdominale pour éviter l’inconfort causé par la pompe elle-même. Après avoir désinfecté la région comme auparavant, un renfoncement sous-cutané pour la pompe est préparé.

Ensuite, effectuez une laminectomie sautée des vertèbres supérieures ou inférieures adjacentes à la lésion de la moelle épinière. Ici, la lésion de la moelle épinière a été réalisée à C sept T un, et donc la laminectomie est effectuée à C cinq. Placez maintenant la pompe dans l’évidement sous-cutané, puis coupez le cathéter à la longueur nécessaire et enfin utilisez des sutures 6.0 pour le fixer à la paire de muscles vertébraux.

Éviter toute luxation associée au mouvement. Utilisez la pointe d’une aiguille pointue pour ouvrir la dure-mère sous la laminectomie. Introduisez ensuite le cathéter dans l’espace sous-dural et laissez-le glisser dans le sens du dorlotage sans résistance et sans blesser le cordon.

Vérifiez maintenant que le cathéter fonctionne correctement et qu’il n’a pas de plis ou de plis comme indiqué ici. Fermez ensuite les muscles couche par couche à l’aide de sutures ou de clips, puis fermez la peau. Une fois la plaie bien refermée, arrêtez l’anesthésie et observez l’animal pendant qu’il se réveille.

Une fois que l’animal a repris suffisamment de conscience pour être couché sternal, placez le rat dans une cage propre. Assurez-vous de suivre toutes les procédures de traitement postopératoire, y compris la surveillance de l’animal et l’analgésie post-chirurgicale. Administrer le traitement immunosuppresseur deux jours avant l’injection de NPC et jusqu’à sept jours après la transplantation et jusqu’au sacrifice, respectivement.

Cette image de microscopie à fluorescence montre une coupe longitudinale de la moelle épinière traumatisée d’un rat. La coloration est des SAP de fluorescence DPI marqués avec QL six. Fite apparaissent verts et se sont agrégés à l’épicentre de la lésion.

Les NPC rouges positifs pour le DS injectés se sont diffusés dans les directions rostrale et dorlotée indiquées par la fluorescence rouge. La barre d’échelle représente cinq millimètres. Ici, une image au microscope électronique à balayage montre la formation d’un échafaudage en nanofibres de SAP assemblés.

La barre d’échelle représente un micromètre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des procédures chirurgicales impliquées dans la compression de clips, SCI, et comment l’approche prometteuse du traitement combiné avec des SAP et des NPC peut être étudiée dans ce modèle.