Name: Utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides dauto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Découvrez une méthode de traitement des lésions cervicales de la moelle épinière chez le rat utilisant des peptides auto-assemblants et des cellules neurales précurseurs. Cette approche combinée améliore la régénération tissulaire et la récupération fonctionnelle.

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Nous tenons à souligner l&#39;appui de financement pour ce travail par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), la Fondation Krembil famille, le président Halbert dans Neural Repair and Regeneration, Phillip et Peggy DeZwirek, et Gordon Yao pour la contribution à la figure 2 . Klaus Zweckberger a été financé par une subvention de la &quot;Deutsche Forschungsgesellschaft&quot; (DFG).

NOTE: Le protocole expérimental suivant a été approuvé par le comité de protection des animaux de l&#39;University Health Network (Toronto, Canada) et est conforme aux politiques établies dans le guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire préparés par le Conseil canadien de protection des animaux . 1. cervicale anévrisme clip Contusion / Compression Modèle <ol><li> Avant d&#39;instruments et de chirurgie de l&#39;autoclave maintenir des conditions stériles au cours de la procédure surgcial ensemble en mettant les instruments dans un bain d&#39;alcool à 70%. </li><li> Anesthésier rats Wistar (250-270 g) avec une combinaison de l&#39;oxygène (O 2), l&#39;oxyde nitreux (N 2 O) (1: 1), et de 1.8 à 2.2% isoflurane et soutenir la respiration spontanée via un masque d&#39;anesthésie de gaz. Pour l&#39;induction de l&#39;anesthésie commencer avec 5% d&#39;isoflurane pendant 1 minute et réduire par la suite. Avant de commencer la chirurgie, la profondeur de l&#39;anesthésie de contrôle en donnant un stimulus douloureux (par ex. Dans les pattes). Appliquer pommades grassesdans les yeux pour éviter la sécheresse et pour prévenir les infections ultérieures. </li><li> Mettez les rats sur un coussin de chauffage (37 ° C) et fixer la tête dans un cadre stéréotaxique. </li><li> Rasez la région chirurgicale autour de la colonne cervicale et désinfecter avec povidone iode et 70% d&#39;alcool. </li><li> Faire une incision médiane au-dessus de la colonne vertébrale de la vertèbre cervicale (C2) atteignant au Processus de premier plan du corps vertébral thoracique 2 (T2). </li><li> Couper à travers la couche extérieure des muscles vertébraux directement sur la ligne médiane (pour éviter les saignements) dans une direction cranio-caudale et encore disséquer les couches musculaires profondes carrément jusqu&#39;à ce que vous atteignez le apophyses épineuses et les lames. Insérez écarteurs. </li><li> Orienter l&#39;apophyse épineuse de premier plan du T2 de corps vertébral d&#39;observer les niveaux ciblés pour laminectomie. Après identification et micro-chirurgicale préparation des lames sélectionné, couper à travers la flavae ligamenti pour desserrer les lames et l&#39;apophyse épineuse. Enfin, cut travers les lames avec un latéral clipper os à la moelle épinière et enlever ceux doucement, en évitant toute compression de la moelle épinière elle-même. NOTE: La plupart niveaux communs sont C5 / 6, C6 / 7, ou C7 / T1. Le taux de mortalité périopératoire augmente plus rostrale la gravité des blessures. Saignement du sinus veineux paravertebral est commun et peuvent être traitées par la compression prudent avec éponge. </li><li> Avant d&#39;insérer le clip de traumatiser le cordon, identifier les nouvelles racines nerveuses de leur épargner l&#39;écrêtage (en particulier au niveau C5 / 6). </li><li> Afin d&#39;assurer le bon pince à induction, desserrer la dure-ventrale de la face dorsale des corps vertébraux avec un crochet et préparer un couloir pour le clip. </li><li> Enfin, insérer le clip ouvert et laissez-le se referment (fermeture rapide) pour atteindre une blessure contusion. force de fermeture du plan-séquence et la durée de fermeture de clip à déterminer l&#39;intensité du traumatisme et de l&#39;ampleur de la compression. Couramment utilisés sont des forces clip comprises entre 15-35 g et un clipping durée de 1 min, par exemple. (Figure 1). </li><li> Après le retrait du clip, adapter muscles en deux couches et fermer la plaie. </li><li> Arrêtez l&#39;anesthésie et de laisser le sillage des animaux sous votre observation continue jusqu&#39;à ce qu&#39;il reprenne conscience suffisante pour décubitus sternal. Enfin, mettre le rat dans une seule cage et suivez les directives de traitement post-opératoires. </li><li> Puisque les animaux se débattent avec la gravité de ce type de blessure, vous devez payer une attention particulière à des traitements post-opératoires: <ol><li> Administrer des analgésiques (buprénorphine et Meloxicam pendant 3 jours et 5 jours, respectivement et selon les symptômes cliniques). </li><li> Donnez solution saline supplémentaire sous-cutanée pendant trois jours (deux fois par jour, 5 à 10 millilitres (ml)). </li><li> Fournir des antibiotiques dans l&#39;eau potable 2 jours avant et jusqu&#39;à ce que la chirurgie de poste sept jours (par exemple, moxifloxacine) </li><li> Pressez la vessie 2-3 fois par jour jusqu&#39;à la récupération de la fonction de la vessie est constantely apparente. </li><li> Respecter les déficits neurologiques et état physiologique des animaux opérés au moins une fois par jour. </li></ol></li></ol> 2. Injection PAS et PNJ (14 jours après la lésion) <ol><li> Induire une anesthésie comme décrit dans 1.1. à 1,3, fixer la tête du rat dans un cadre stéréotaxique, enlever les points de suture ou clips plaies, et désinfecter la plaie et la zone chirurgicale avec de la povidone iode et 70% d&#39;alcool. </li><li> Disséquer soigneusement les muscles paravertébraux, insérez rétracteurs, enlever le tissu cicatriciel au microscope de la dure-mère, et ré-exposer le site de la lésion. </li><li> Préparer SAP à une concentration de 1% (p / v) pour effectuer un gel de matrice extracellulaire. PAS NQ6 ont un pH physiologiquement compatible et ne ont pas besoin d&#39;être tamponnée avant l&#39;injection. Pour la visualisation de programmes d&#39;ajustement structurel de la moelle épinière, utiliser un dérivé fluorescent de NQ6 (NQ6-FITC). </li><li> Injecter PAS (5 microlitres (ul) dans le centre de la lésion, répartis en deux portions, chacune2,5 ul bilatéral de la ligne médiane. Utiliser une seringue Hamilton relié au cadre stéréotaxique avec un micro-capillaire de verre (100 micromètres (um) de diamètre externe (OD)). Ouvrez la dure attentivement avec la pointe d&#39;une aiguille, et insérez le capillaire en verre stéréotaxique 2 millimètres (mm) dans la moelle épinière traumatisé. </li><li> Après l&#39;injection tiers du volume, retirez l&#39;aiguille à 1,5 mm de profondeur, et après un nouveau tiers-1 mm. Après l&#39;injection de la totalité du volume, et avant le retrait de la seringue, attendre 5 minutes afin de stabiliser la formation de gel. </li><li> Pour générer PNJ, utilisez la souris adulte DsRed (ou souris positives YFP, vert) et isoler et les cultiver de la zone paraventrical 4,18,21. </li><li> Évaluer la viabilité de NPC par coloration au bleu Trypan indiquant la présence de ~ 90% de cellules vivantes dans la suspension de cellules. Diluer les cellules dans un milieu de croissance (50 x 103 cellules vivantes / ul), puis les utiliser pour une transplantation de cellules. </li><li> Assurez-quatre 2 pi (8 pi vo totalelume, contenant 4 x 10 5 PNJ) injections intraspinales bilatéralement à 2 mm rostrale et caudale du site de la lésion. Après ouverture de la dure-mère, à insérer le micro-capillaire de Hamilton verre 1,5 mm sous la surface dorsale de la moelle épinière et injecter 2 ul de la suspension cellulaire. Choisissez un taux d&#39;injection à environ 0,5 pl / min (min). </li><li> A la fin de chaque injection et avant le retrait du capillaire sur le cordon, attendre au moins une minute tissu étirage permettant d&#39;accueillir le nouveau volume de la cellule. (Figure 2) </li></ol> 3. Implantation de sous-dural Pompes pour Growth Factor application <ol><li> Afin d&#39;enrichir le liquide céphalo-rachidien (LCR) avec des facteurs de croissance soutenir la survie cellulaire, utiliser des micro-osmotique pompes dilution des facteurs de croissance sous-durally tout au long de 7 à 14 jours, avec un taux de dilution de 0,5 ul / h, un diamètre de cathéter de 0,04 OD cm, et un volume de réservoir de 100 ul. </li><li> Choisissez facteurs de croissance préférés(Par exemple, le cerveau facteur de croissance dérivé (BDGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance des fibroblastes (FGF)), à remplir les pompes 10.06 h implantation avant, et équilibrer pompes dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Immédiatement après injections NPC, préparer une cavité sous-cutanée de placer la pompe. Endroits préférés sont les flancs latéraux de thoraco région abdominale en évitant l&#39;inconfort local majeur causé par la pompe elle-même. </li><li> Pour obtenir la plus forte concentration de facteurs de croissance, se assurer que la pointe ouverte du cathéter se termine à proximité du site de la lésion. Par conséquent, effectuer un saut-laminectomie du niveau supérieur ou inférieur adjacent. Par exemple, si la SCI est au C7 / T1, effectuer une petite laminectomie C5. </li><li> Mettez la pompe dans la cavité sous-cutanée, de raccourcir le cathéter à la longueur nécessaire, et le fixer avec plusieurs sutures (6,0) sur les muscles paravertébraux évitant toute dislocation mouvement associé. </li><li> Après l&#39;ouverture de la dure-mère (par exemple, à C5) avec le bout pointud&#39;une aiguille, introduire le cathéter dans l&#39;espace sous-dural et laissez-le glisser dans une direction caudale sans résistance et sans blesser le cordon. La lame de sautée par exemple C6 sert point de fixation et la stabilisation du cathéter supplémentaire. </li><li> Assurez-vous que le cathéter fonctionne bien et ne plie pas. </li><li> Fermer muscles par couche, et la peau, avec des sutures ou des clips. (Figure 3) </li><li> Arrêtez l&#39;anesthésie et de laisser le sillage des animaux sous votre observation continue jusqu&#39;à ce qu&#39;il reprenne conscience suffisante pour décubitus sternal. Enfin, les remettre dans une seule cage et suivez les directives de traitement post-opératoires. </li><li> Fournir un traitement postopératoire spécial, même si, les animaux auraient récupéré en partie à ce point dans le temps: <ol><li> Administrer des analgésiques (Buprenorthine et Meloxicam pendant 3 jours et 5 jours, respectivement et selon les symptômes cliniques). </li><li> Fournir des antibiotiques dans des bouteilles d&#39;eau jusqu&#39;à 2 jours avant7 jours après la chirurgie (par exemple moxifloxacine). </li><li> Continuez à comprimer la vessie, se il est encore nécessaire. </li><li> Donnez fluides sous-cutanés supplémentaires, si les rats apparaissent déshydraté. </li><li> Gardez observant la fonction neurologique et l&#39;état physiologique des animaux opérés au moins une fois par jour. </li><li> Administrer un traitement immunosuppresseur deux jours injection PNJ préalable et jusqu&#39;à sept jours après transplanation (minocycline) et jusqu&#39;au sacrifice (Sandimmune), respectivement. </li></ol></li></ol> 4. évaluation de tissus <ol><li> Sacrifice des animaux à la fin de la période d&#39;observation (par ex. 4 semaines après la SCI) en anesthésie profonde (isoflurane à 5% pendant 2-3 min) et perfuser les transcardiaque avec 50 ml froid (4 ° C) suivie d&#39;une solution saline froide 150 ml 4 % de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Retirer la moelle épinière et le mettre dans 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS) pendant 24 heures. </li><li&gt; Mettez la moelle épinière dans une solution de saccharose de 25% pour cryoprotection pendant 48 heures. </li><li> Fournir cryosections longitudinales avec une épaisseur de &lt;30 pm. </li><li> Pour la coloration immunohistochimique de tous les noyaux cellulaires offrant une utilisation de fond DAPI (1: 1000). PNJ positifs DsRed apparaissent en rouge, QL-six FITC apparaît en vert, et les deux donc pas besoin d&#39;être teinté spécialement. (Figure 4). </li><li> Pour la microscopie électronique à balayage (MEB) permettent échantillons tremper dans glutaraldéhyde à 4 ° C pendant 2 heures, déshydratent les lentement en 10 étapes d&#39;incrémentation% d&#39;éthanol pendant 5 min et les placer dans un liquide sous pression CO 2 siphon pendant 1 heure. échafaudages Coat avec de l&#39;or à l&#39;aide d&#39;une coucheuse de pulvérisation. Prenez des photos avec un microscope électronique à balayage Hitachi S-3400N. (Figure 5) </li></ol>

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</ol>

Covidien a fourni le SAP QL6 pour cette étude.

Ce protocole a été développé pour permettre au lecteur de réaliser un modèle de lésion cervicale chez les rats et d&#39;utiliser une approche de traitement combiné avec les PAS et les PNJ favorisant une meilleure récupération après cervicale SCI. Surtout en comparaison à d&#39;autres modèles de traumatismes cervicaux, comme le (hémi) -transection modèle ou les modèles de chute de poids et une commotion cérébrale, le clip contusion / modèle de compression représente à la fois les principaux m...

Plus de 50% des lésions de la moelle épinière sont liés à la colonne cervicale. Dans la mise en clinique deux mécanismes physiopathologiques principaux sont décrits: le premier contusion de la moelle épinière et ensuite, la compression permanente causée par des fractures osseuses, des hémorragies ou de gonflement des tissus. Les mimétiques contusion / modèle de compression du clip d&#39;anévrisme deux mécanismes physiopathologiques: encliquetage du clip produit une contusion et la durée de coupure correspond à la composante de compression, en admettant que la compression dans les milieux cliniques causés par des fractures osseuses, des hémorragies ou de gonflement des tissus dernière étape de plus. Le clip d&#39;anévrisme utilisé est modifié par un ressort annulaire garantissant force de pincement exacte et reproductible. Surtout en comparaison avec l&#39;hémi-transection ou le modèle de contusion, ce clip d&#39;anévrisme imite modèle meilleurs paramètres cliniques. Bien que les patients souffrant de lésions thoraciques souffrent de paraplégie, la plupart des patients avec inj col de l&#39;utérusuries sont tétraplégique et complètement dépendante. La structure anatomique de la moelle cervicale, cependant, montre des différences significatives par rapport à la thoracique ou lombaire, et donc, se adresse en particulier dans ce protocole. Le développement des cavités médullaires et des cicatrices de tissus sont des obstacles pour la récupération et la régénération. Pour surmonter ces obstacles à l&#39;utilisation de matériel d&#39;échafaudage est une approche prometteuse. peptides auto-assemblage peuvent être injectés directement dans l&#39;épicentre de la lésion. Là, ils se assemblent en échafaudages nano-fibres de transition de la cavité et à améliorer l&#39;environnement en réduisant l&#39;inflammation inhibitrice et effarouchement des tissus. Bien que les matériaux rigides provoquent des dommages considérables de la moelle épinière lors de l&#39;implantation, les peptides peuvent être injectés de fluide en toute sécurité et sans dommage sévère supplémentaire. Amélioration de l&#39;environnement d&#39;inhibition avec des peptides d&#39;auto-assemblage avant la transplantation de cellules souches, par conséquent, supporte la cellule iNTÉGRATION, la différenciation et, enfin, la récupération fonctionnelle après lésion de la moelle épinière cervicale.

<table><tbody><tr><td>Clip anévrismal</td><td>SharpTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope chirurgical</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de micro-injection</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil stéréotaxique pour petits animaux</td><td>David Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompes sous-durales</td><td><a href="http://www.alzet.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Pompe micro-osmotique Alzet 1007D</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument chirurgical</td><td>Fine Science tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection de chlorure de sodium 0,9 % USP</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodée 7,5 %</td><td>Purdue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique 70 % USP</td><td>GreenField Ethanol Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QL6 SAP</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleu de trypan 0,4 %</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (EGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes (FGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides d&#39;auto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Lésions de la moelle épinière (SCI) provoquent des troubles neurologiques graves et les conséquences psychologiques, économiques et sociales pour les patients et leurs familles. Cliniquement, plus de 50% de la SCI affecte la colonne cervicale 1. En conséquence de la lésion primaire, une cascade de mécanismes secondaires, y compris l&#39;inflammation, l&#39;apoptose et la démyélinisation se produisent finalement conduit à la cicatrisation des tissus et du développement de cavités intramédullaires 2,3. Tous deux représentent des barrières physiques et chimiques à la transplantation de cellules, l&#39;intégration et la régénération. Par conséquent, l&#39;environnement de mise en forme et d&#39;inhibition de pontage cavités pour créer un milieu propice à la transplantation de cellules et de régénération est une cible thérapeutique prometteuse 4. Ici, un modèle contusion / compression du col de l&#39;utérus SCI en utilisant un clip à anévrisme est décrite. Ce modèle est plus cliniquement pertinent que d&#39;autres modèles expérimentaux, puisque section complète ou ruptures du cordon sont rares. Toujours dans COMPARAISOn au modèle de perte de poids, ce qui en particulier les dommages colonnes de dos, la compression circonférentielle de la moelle épinière apparaît avantageux. force de fermeture Clip et la durée peuvent être ajustées pour obtenir différente gravité des blessures. Un ressort annulaire facilite étalonnage précis et la constance de pince vigueur. Dans des conditions physiologiques, les peptides d&#39;auto-assemblage synthétiques (SAP) auto-assembler en nanofibres et donc, lancent un appel pour l&#39;application de la SCI 5. Ils peuvent être injectés directement dans la lésion en minimisant les dommages au cordon. PAS sont des structures biocompatibles ériger des échafaudages pour combler les cavités médullaires et donc, équiper le cordon endommagé pour des traitements régénérateurs. K2 (QL) 6K2 (NQ6) est un roman de SAP introduit par Dong et un l. 6 En comparaison à d&#39;autres peptides, NQ6 auto-assemble en β-feuilles à pH neutre 6 0,14 jours après la SCI, après la phase aiguë, PAS sont injectés dans le centre de la lésion et les cellules précurseurs neurales (NPC) sont injeDECT dans les colonnes dorsales adjacentes. Afin de soutenir la survie des cellules, la transplantation est combinée avec l&#39;administration sous-dural continue de facteurs de croissance de micro-pompes osmotiques pendant 7 jours.

Lors de l'exécution de la procédure décrite ci-dessus, vous obtiendrez un SAP échafaudage combler la cavité et offrant une amélioration de l'environnement inhibitrice, moins effarouchement des tissus et une augmentation de la survie de l'APN. La figure 4 montre une section longitudinale d'une moelle épinière de rat obtenu au site de la lésion six semaines après SCI et quatre semaines après l'injection NQ6 SAP et PNJ transplantation. Peptides NQ6 ont été injectés avec succès dans le cordon, agrégée à l'é...

Le traitement des lésions de la moelle épinière cervicale à l’aide de peptides auto-assemblés (SAP) et de cellules précurseurs neurales (NPC), ainsi que de facteurs de croissance, est une approche prometteuse pour favoriser la régénération et la récupération. Un modèle de clip d’anévrisme de contusion/compression chez le rat de LME cervicale et un traitement combiné impliquant l’injection de SAP et la transplantation de NPC sont établis.

Utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides d&#39;auto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

L’objectif global de cette procédure est d’introduire un modèle de clip de compression de contusion de LME cervicale chez le rat, ainsi qu’un protocole de traitement combiné impliquant l’injection de SAP et la transplantation de NPC. Tout d’abord, une pince d’anévrisme est placée autour de la moelle épinière et maintenue en place pendant une minute. Il en résulte une blessure bilatérale par compression par contusion.Ensuite, les PAG sont injectés à l’épicentre de la blessure, les PNJ sont injectés immédiatement après l’injection de SAP. Une pompe osmotique avec un cathéter sous-dural est insérée pour l’administration soutenue de facteurs de croissance. Cette procédure entraîne l’administration de NPC à la moelle épinière blessée.La survie et la greffe des NPC sont soutenues par un traitement combinatoire avec des PAS et des facteurs de croissance. Les implications de cette technique s’étendent à une thérapie pour les lésions traumatiques de la moelle épinière, car elle fournit un modèle cliniquement pertinent qui peut être utilisé pour étudier les thérapies COMBINATOR basées sur les cellules qui favorisent la régénération de la moelle épinière. Le protocole expérimental suivant a été approuvé par le Comité de protection des animaux du Réseau universitaire de santé, à Toronto, au Canada, et est conforme aux politiques établies dans le Guide sur le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation préparé par le Conseil canadien de protection des animaux.Toutes les interventions chirurgicales doivent être effectuées dans des conditions stériles à l’aide d’équipements et de solutions stériles, et selon les directives de l’établissement et du gouvernement, cette procédure utilise des rats pesant de 250 à 270 grammes avant de commencer la procédure. Donnez aux animaux des antibiotiques dans l’eau de boisson pendant deux jours le jour de l’intervention. Après avoir placé le rat dans une chambre d’anesthésie et induit une anesthésie avec 5 % de fluor ISO dans de l’oxygène et du protoxyde d’azote pendant une minute, réduisez le fluor ISO à 1,8 à 2,2 %, appliquez la pommade lambic sur les yeux et confirmez l’anesthésie chirurgicale en effectuant un pincement de la patte.Placez ensuite le rat sur un coussin chauffant et fixez la tête dans un cadre stéréotaxique avec un cône nasal. Après avoir rasé la fourrure autour de la colonne cervicale, désinfectez la peau par écouvillonnage avec de la povidone iodée, suivie de 70 % d’éthanol après avoir fait une incision médiane de la région des deux vertèbres cervicales C jusqu’au processus proéminent du corps vertébral thoracique T deux. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la couche externe des muscles vertébraux directement sur la ligne médiane dans une direction de dorlotement crânien, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour disséquer les couches musculaires plus profondes jusqu’à ce que le processis, l’osis et le laminé soient atteints.Insérez les rapporteurs et maintenez-les. Ouvrez les couches musculaires, puis orientez le processis posis proéminent du corps de la vertèbre T deux et identifiez les niveaux ciblés pour la laminectomie. Ensuite, utilisez un scalpel numéro 15 pour couper le ligament afin de desserrer le lamini et le processis posis.Ensuite, utilisez un coupe-os pour couper la lame latérale à la moelle épinière et retirez doucement la lame sans comprimer la moelle épinière. Prenez maintenant un moment pour identifier les racines nerveuses émergentes afin de les éviter de se couper. Ensuite, à l’aide d’un crochet, détacher la dure-mère ventrale de la face dorsale des corps vertébraux et préparer un couloir pour le clip.Assurez-vous que le ressort annulaire du clip est réglé pour fournir la force souhaitée. La force du clip détermine l’étendue du traumatisme et de la compression. Insérez le clip ouvert autour de la moelle épinière et laissez-le se refermer pour induire une contusion.Des forces de coupe comprises entre 15 et 35 grammes sont souvent utilisées avec une durée de coupe d’une minute après la lésion de la moelle épinière. Retirez le clip et fermez les muscles en deux couches, puis fermez la peau. Une fois la plaie bien refermée, arrêtez l’anesthésie et observez le rat pendant qu’il se réveille.Une fois que l’animal a repris une conscience suffisante pour le sternal, couché, placez le rat dans une cage propre. En raison de la gravité de ce type de blessure, il est impératif de suivre les traitements postopératoires suivants. Tout d’abord, assurez-vous d’administrer des analgésiques tels que la buprénorphine et le méloxicam pendant trois à cinq jours selon les symptômes.Prévenez également la déshydratation par voie sous-cutanée. Injecter cinq à 10 millilitres de solution saline deux fois par jour pendant trois jours, et continuer à fournir des antibiotiques dans l’eau potable pendant cinq jours. Après l’opération. Pressez la vessie deux à trois fois par jour jusqu’à ce que la fonction vésicale se rétablisse soit constante, même après que les animaux semblent guéris.Assurez-vous d’observer les animaux opérés pour détecter les déficits neurologiques et l’état physiologique. L’injection est effectuée 14 jours après la lésion de la moelle épinière. Avant de commencer l’opération, préparez les SAP à une concentration de 1 % en poids par volume dans de l’eau stérile et remplissez un capillaire en verre de 100 micromètres attaché à une seringue Hamilton.Avec la solution, fixez la seringue Hamilton au cadre stéréotaxique. Après l’anesthésie, le rat fixe la tête dans le cadre stéréotaxique et désinfecte le site de la chirurgie avec de la povidone iodée et de l’alcool à 70 %. Comme précédemment, une fois de plus, après avoir ouvert la peau, disséquez soigneusement la paire de muscles vertébraux et insérez des écarteurs.Utilisez un scalpel numéro 15 pour retirer le tissu cicatriciel de la dure-mère et réexposer le site de la lésion. Utilisez ensuite la pointe d’une aiguille pointue pour ouvrir la dure-mère avec précaution. Enfin, par stéréotaxie, insérez le capillaire de verre à une profondeur de deux millimètres dans la moelle épinière traumatisée et injectez les SAP.Après l’injection des SAP, laissez le capillaire rester au site d’injection pendant une minute avant de le retirer pour permettre l’étirement des tissus afin de s’adapter à la solution injectée. Ensuite, répétez l’injection au site suivant. Ici, des NPC ont été isolés de la zone paraventriculaire d’une souris rouge SD adulte et cultivés selon des procédures précédemment publiées.Juste avant la micro-injection, diluez les NPC dans un milieu de croissance à une concentration de 50 fois 10 à la troisième cellules vivantes par microlitre pour la transplantation cellulaire et chargez-les dans un capillaire en verre sur une seringue Hamilton. Les NPC sont injectés immédiatement après l’injection des PAS. Pour ce faire, insérez le capillaire en verre de la seringue Hamilton à 0,2 millimètre rostral du site de la blessure et à 1,5 millimètre sous la surface dorsale de la moelle épinière.Injectez deux microlitres de suspension cellulaire à un rythme d’environ 0,5 microlitre par minute. Une fois la première injection terminée, laissez le capillaire rester dans la moelle épinière pendant une minute comme auparavant, puis rétractez le capillaire, déplacez-le vers un site adjacent et répétez la procédure d’injection. Après avoir attendu une minute, comme précédemment, rétractez le capillaire et déplacez-le de deux millimètres de codding jusqu’au site de la blessure.Effectuez deux injections de deux microlitres à cet endroit. Cette image montre tous les sites d’injection relatifs à la lésion de la moelle épinière. L’implantation de mini-pompes osmotiques sous-durales pour le soutien du facteur de croissance est effectuée immédiatement après les injections de NPC.Choisissez d’abord un site d’implantation. Les sites préférés sont les flancs latéraux de la région thoraco-abdominale pour éviter l’inconfort causé par la pompe elle-même. Après avoir désinfecté la région comme auparavant, un renfoncement sous-cutané pour la pompe est préparé.Ensuite, effectuez une laminectomie sautée des vertèbres supérieures ou inférieures adjacentes à la lésion de la moelle épinière. Ici, la lésion de la moelle épinière a été réalisée à C sept T un, et donc la laminectomie est effectuée à C cinq. Placez maintenant la pompe dans l’évidement sous-cutané, puis coupez le cathéter à la longueur nécessaire et enfin utilisez des sutures 6.0 pour le fixer à la paire de muscles vertébraux.Éviter toute luxation associée au mouvement. Utilisez la pointe d’une aiguille pointue pour ouvrir la dure-mère sous la laminectomie. Introduisez ensuite le cathéter dans l’espace sous-dural et laissez-le glisser dans le sens du dorlotage sans résistance et sans blesser le cordon.Vérifiez maintenant que le cathéter fonctionne correctement et qu’il n’a pas de plis ou de plis comme indiqué ici. Fermez ensuite les muscles couche par couche à l’aide de sutures ou de clips, puis fermez la peau. Une fois la plaie bien refermée, arrêtez l’anesthésie et observez l’animal pendant qu’il se réveille.Une fois que l’animal a repris suffisamment de conscience pour être couché sternal, placez le rat dans une cage propre. Assurez-vous de suivre toutes les procédures de traitement postopératoire, y compris la surveillance de l’animal et l’analgésie post-chirurgicale. Administrer le traitement immunosuppresseur deux jours avant l’injection de NPC et jusqu’à sept jours après la transplantation et jusqu’au sacrifice, respectivement.Cette image de microscopie à fluorescence montre une coupe longitudinale de la moelle épinière traumatisée d’un rat. La coloration est des SAP de fluorescence DPI marqués avec QL six. Fite apparaissent verts et se sont agrégés à l’épicentre de la lésion.Les NPC rouges positifs pour le DS injectés se sont diffusés dans les directions rostrale et dorlotée indiquées par la fluorescence rouge. La barre d’échelle représente cinq millimètres. Ici, une image au microscope électronique à balayage montre la formation d’un échafaudage en nanofibres de SAP assemblés.La barre d’échelle représente un micromètre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des procédures chirurgicales impliquées dans la compression de clips, SCI, et comment l’approche prometteuse du traitement combiné avec des SAP et des NPC peut être étudiée dans ce modèle.

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