A Novel In vitro Modèle pour l'étude des interactions entre les droits du sang total et de l'endothélium

L’objectif général de cette procédure est d’étudier les interactions entre le sang et les cellules endothéliales à l’aide d’un nouveau test de chambre endothéliale sanguine. Ceci est accompli en prélevant d’abord du sang d’un volontaire en bonne santé par ponction veineuse en système ouvert. Dans la deuxième étape, le sang est soigneusement superposé sur des cavités sanguines recouvertes d’héparine couplées à des lames de culture de cellules endothéliales.

Ensuite, ces chambres cellulaires endothéliales sanguines sont doucement tournées pour faciliter l’interaction entre le sang et les cellules endothéliales. En fin de compte, les interactions de cellule à cellule entre le sang et les cellules endothéliales et la production de complexe thrombine-antithrombine qui en résulte peuvent être évaluées respectivement par microscopie d’immunofluorescence et par Eliza. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme celles utilisant des modèles animaux est qu’ici, un système de modèle humain peut être utilisé pour étudier les maladies vasculaires avant de commencer l’expérience.

Couplez une aiguille hypodermique de calibre 18 à un morceau de tube en silicone recouvert d’héparine de deux millimètres de diamètre intérieur. Les surfaces en plastique sont recouvertes d’héparine afin d’éviter l’activation non spécifique de la coagulation. Par exemple, sur cette image, un caillot est clairement visible dans cette chambre non revêtue.

Après 30 minutes de contact avec le sang, le traitement de la chambre avec de l’héparine en surface protège le sang de l’activation incontrôlée, garantissant que les résultats sont dus aux interactions sanguines des cellules endothéliales. Ce n’est qu’après avoir connecté le tube que vous devez prélever soigneusement un échantillon de sang d’un donneur sain par ponction veineuse à système ouvert dans un tube recouvert d’héparine de 50 millilitres. Complétez le sang prélevé avec de l’héparine non fractionnée pour atteindre une concentration finale de 0,75 UI par millilitre et retournez le tube deux à trois fois pour un mélange doux.

Pour l’analyse de la concentration initiale de protéines sanguines, mélangez soigneusement un millilitre de sang par tube dans des microtubes à centrifuger contenant 30 microlitres de 10 millimolaires de K trois EDTA, et placez les tubes sur de la glace. Ensuite, utilisez une pointe de pipette recouverte d’héparine pour transférer 1,5 millilitres de sang dans chaque chambre cellulaire endothéliale sanguine recouverte d’héparine, en prenant soin de laisser le sang circuler lentement et sans créer de bulles pour éviter l’activation. Ensuite, retirez les parois en plastique des lames de culture de cellules endothéliales selon les instructions du fabricant et lavez doucement les cellules endothéliales.

Avec le PBS, nous évacuons autant que possible le lavage des cellules sans laisser les cultures se dessécher et plaçons les lames sur le dessus des chambres sanguines avec les cellules face au sang. Ensuite, à l’aide de glissières en plastique pour un soutien supplémentaire. Pour éviter la rupture des lames de culture cellulaire, placez une pince autour de chaque chambre cellulaire endothéliale sanguine pour fixer les lames.

Maintenant, faites pivoter les chambres sur une roue rotative dans un bain-marie à 37 degrés Celsius à 0,5 G pendant 30 minutes. Après la rotation, démontez les chambres cellulaires endothéliales sanguines, lavez les lames de culture cellulaire dans du PBS et fixez les cellules dans du paraldéhyde à 1 % glacé pendant 10 minutes. Enfin, pour l’évaluation de la concentration en protéines sanguines activées, mélangez un millilitre de sang de chaque chambre dans des tubes de micro-centrifugeuse contenant 30 microlitres de K trois EDTA de 0,34 molaire, et placez les tubes sur de la glace pendant une heure maximum.

Ensuite, après avoir fait tourner les cellules, stockez le plasma dans de nouveaux microtubes à centrifuger à moins 70 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. L’activation des facteurs de coagulation est plus susceptible de se produire dans le sang stagnant, car la probabilité d’une interaction entre les facteurs activés augmente. En effet, le volume de sang sans aucun mouvement par bulles d’air est deux fois et demie plus important.

Lorsque 1,75 millilitre de sang est ajouté dans la chambre par rapport à 1,5 millilitre de sang utilisé, les valeurs mesurées de thrombine antithrombine suggèrent une augmentation de la formation de thrombine antithrombine avec une augmentation du volume sanguin. Il est intéressant de noter que lorsque les enfants sont incubés avec l’un ou l’autre volume de sang total, aucune différence n’est notée entre les deux groupes, ce qui suggère que les cellules endothéliales peuvent moduler l’activation de la coagulation pour étudier l’effet du TNF alpha sur le recrutement des leucocytes. Dans cette expérience, les qve ont été traités avec 20 nanogrammes par millilitre de TT NF alpha quatre heures avant le contact sanguin, après quoi le nombre de cellules positives au CD 16 a été quantifié.

Le recrutement des cellules positives pour le CD 16 a augmenté de manière significative avec le traitement par le TNF alpha, passant de 100 à 256 cellules positives pour le CD 16 par millimètre carré et 1,5 litre de sang, et de 172 à 378 et 1,75 millilitres de sang. La formation des complexes thrombine-antithrombine a ensuite été mesurée dans les échantillons de plasma correspondants provenant du sang incubé avec des cellules traitées ou non traitées au TNF alpha. Comme prévu, les cellules stimulées par le TNF alpha ont induit un doublement approximatif des complexes thrombine-antithrombine par rapport aux témoins non traités après son développement.

Cette technique permettra aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie d’explorer, de compléter et de coaguler dans un modèle in vitro utilisant des cellules primaires humaines et du sang total humain.