Name: Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez un test de fluorescence pour mesurer l'activité de PAD4, une enzyme impliquée dans la conversion de l'arginine en citrulline. Cette méthode permet un criblage à haut débit des inhibiteurs de PAD4.

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Ce travail a été soutenu par le Lehigh University Start-up Package. Nous remercions le Dr Walter Fast d’avoir fourni le plasmide GST-PAD4 pour l’expression des protéines.

1. PAD4 transformation, expression et la purification <ol><li> Pour PAD4 Transformation, transformer le plasmide pGEX contenant PAD4 TPS fusion dans E. chimiquement compétent Coli (BL21 (DE3)), les cellules pour l&#39;expression de protéine en utilisant la procédure suivante. Préparer chimiquement compétente (chlorure de calcium) E. Coli (BL21 (DE3)), les cellules selon les protocoles standards. <ol><li> 50 ul de dégel préalablement préparée chimiquement compétente BL21 (DE3), les cellules sur de la glace et mélanger avec 1 ul du plasmide pGEX PAD4 contenant le gène dans un tube de culture de 5 ml. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 min en agitant doucement toutes les 2 min. </li><li> Choc thermique des cellules en plaçant le mélange dans un bain d&#39;eau à 42 ° pendant 40 secondes. Placer immédiatement le mélange cellulaire plasmide retour sur la glace pendant 2 min pour permettre aux cellules de se rétablir. Ajouter 1 ml de bouillon LB stérile pour le mélange et le placer sur de la glace pendant 1 min. </li><li> Incuber la chaleur cellules choqué à 37 ° C, en agitant à 250 rpm pendant 1h. Introduire à la pipette 75 ul de cellules transformées sur une plaque de gélose à l&#39;ampicilline et résistant à incuber à 37 ° C pendant 15 heures. plaque de magasin à 4 ° C. </li></ol></li><li> Expression PAD4. <ol><li> Choisissez une colonie de BL21 (DE3) de la plaque de gélose à l&#39;ampicilline et le lieu dans 5 ml de LB contenant de l&#39;ampicilline 1x. Lieu dans l&#39;incubateur et secouer O / N à 37 ° C. </li><li> Transférer les 5 ml de LB (entrée) dans 1 L de milieu LB stérile contenant 1x trihydrate d&#39;ampicilline (MW 403,45 g / mol). Lieu croissance dans un incubateur à agitation à 37 ° C. Surveiller la DO 600 de la croissance. Lorsque la croissance atteint une DO 600 de 0,3, se déplacer en croissance de 16 ° C en secouant incubateur. </li><li> Après avoir atteint une DO 600 de 0,6, induire les cellules avec isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238,30 g / mol). Permettent aux cellules de secouer pendant 15 heures à 16 ° C. </li><li> cellules de récolte par centrifugation à 4000 g pendant 20 min à 0 ° C. Verser le surnageant et magasin culot à -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Purification <ol><li> Remettre en suspension le culot contenant la PAD4 exprimée dans BL21 (DE3), les cellules dans un tampon de 50 mM de NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM de NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM d&#39;imidazole (68,077 MW g / mol), 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, MW 174,94 g / mol) et mM de dithiothréitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0 1. </li><li> Lyser les cellules par traitement aux ultrasons pendant 15 min à 4 ° C. Suite à la sonification, centrifuger le lysat cellulaire à 20 000 x g pendant 20 min à 0 ° C. Décanter et conserver le surnageant. Lot le surnageant avec le glutathion (GSH), des billes d&#39;agarose pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Égoutter surnageant de la TPS perles / colonne par gravité. Laver les billes avec 4 x 25 ml de 1 x PBS (solution saline tamponnée au phosphate, pH = 8,0) à la température ambiante. </li><li> Eluer PAD4 avec 2 x 10 ml de tampon d&#39;élution, 50 mM de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM de glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Concentrez PAD4 utilisant 100k MW coupe-otubes à centrifuger ff et centrifuger à 4000 g pendant 20 min à 4 ° C. protéines aliquote dans 200 volumes ul dans 1,0 ml microtubes et conserver à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des solutions d&#39;achat d&#39;actions pour tampons <ol><li> Peser le chlorure de sodium (NaCl, MW 58,44 g / mol) et préparer une solution à 2 m. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris base, MW 121.14 g / mol) et préparer une solution 2 M, pH = 8,0. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser le chlorure de calcium dihydraté (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) et de préparer une solution 500 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE, MW 250.19 g / mol) et préparer une solution de 200 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. </li><li> Peser dithiothréitol (DTT, MW 154.25 g / mol) et préparer une solution à 1 M. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. </li><li> Préparerune solution à 0,5% de Triton X-100. </li><li> Peser acide éthylène (EDTA, MW 292,24 g / mol) et préparer une solution à 100 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Z- Arg Arg 7- amido 4- méthylcoumarine chlorhydrate (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) et de préparer une solution à 10 mM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 test à 37 ° C <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 125 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 125 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, et 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2 et 6,25 mM de DTT (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et stocker à -20° C. Ce sera la solution D. </li><li> Obtenir une plaque de 96 puits et de désigner un certain nombre de puits pour les contrôles (pas PAD4) et les puits d&#39;essai (+ de pAD4). </li><li> Pipette 160 ul de solution B dans les puits d&#39;essai et pipette 160 ul de la solution C dans les puits de contrôle. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Introduire à la pipette 40 ul de la solution A dans tous les puits et incuber à 37 ° C pendant 45 min. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de dH 2 O à la moitié des puits de contrôle et la moitié des puits d&#39;essai. Pour l&#39;autre moitié des puits de contrôle et des commandes de test, la pipette 10 ul de la solution D. incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 test à température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution à 50 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution de ZRcoum 50 uM sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 100 mM NaCl, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, et 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, et 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution D. </li><li> Obtenir une plaque de 384 puits et désigner puits pour les contrôles (pas pAD4) et les puits d&#39;essai (+ de pAD4). </li><li> Pipette 25 ul de solution B dans les puits d&#39;essai et pipette 25 ul de la solution C dans les puits de contrôle. Autoriser tampon avec / sans PAD4 à incuber dans les puits pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 25 ul de la solution C dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de dH 2 O à la moitié des puits de contrôle et la moitié des puits d&#39;essai. Pour l&#39;autre moitié des puits de contrôle et des commandes de test, pipette 10 ul de solution D. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 5. pAD4 Temps cours dosages à 37 ° C et la température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 125 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 125 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, et 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution C. </li><li> Obtenir 2 plaques à 96 puits et pipette 160 ul de solution B dans # montant de puits (nombre de puits dépendra du nombre de points de temps). </li><li> Incuber une plaque de 96 puits à 37 ° C. Incuber la plaque 96 autre bien à température ambiante. </li><li> Topette 40 pi de la solution A dans tous les puits dans les plaques à 96 puits et immédiatement pipette 10 ul de la solution dans les puits C t = 0 min. Continuer l&#39;ajout de 10 ul de la solution C à des points de temps spécifiques jusqu&#39;à ce que tous les puits ont été trempés. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 test d&#39;inhibition à la température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 83 M de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution de ZRcoum 83 uM sera la solution A. </li><li> Peser Cl-amidine (MW 424,8 g / mol) et préparer une solution stock de 100 pm. Ce sera la solution B. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, et 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, et 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Thest sera la solution D. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution E. </li><li> Obtenir une plaque de 384 puits et désigner puits pour les contrôles (pas pAD4), puits d&#39;essai (+ pAD4), et les puits d&#39;inhibition (PAD4 + Cl-amidine). </li><li> Pipette 25 ul de la solution C dans les puits d&#39;essai et pipette 25 ul de la solution D dans les puits de contrôle. Autoriser tampon avec / sans PAD4 à incuber dans les puits pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Pipette de 10 pi de solution B dans les puits d&#39;inhibition et incuber pendant 20 min à RTE. </li><li> Introduire à la pipette 15 ul de la solution A dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de la solution E à tous les puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 7. cellulaire brut lysat Assayà la température ambiante <ol><li> Après la récolte des cellules à partir de PAD4 croissance de 1 L, remettre les cellules dans 10 ml de Tris 50 mM, NaCl 50 mM, 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, MW 174,94 g / mol) et 1 mM de dithiothréitol (DTT, 154,25 g / mol), le pH = 8,0. </li><li> Lyser les cellules par traitement aux ultrasons pendant 15 min à 4 ° C. Centrifuger le lysat cellulaire à 20 000 x g pendant 20 min à 0 ° C. Concentrer le surnageant clair à la moitié du volume par centrifugation à 4000 rpm à 4 ° C en utilisant 100k MW tubes à centrifuger coupure. </li><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution de 250 M de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 250 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, CaCl2 20 mM, et 2 mM de TCEP (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution C. </li><li> Obtenir une plaque et la conception de 384 puits noirmangé puits de contrôle (pas de lysat cellulaire) et des puits de test (+ lysat cellulaire). </li><li> Introduire à la pipette 100 ul de solution B dans tous les puits et la pipette 60 ul de lysat de cellules dans des puits d&#39;essai. Incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 40 ul de la solution A dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de la solution C à tous les puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur le lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce contexte, un test basé sur la fluorescence a été mis au point avec succès pour surveiller l’activité de PAD4. Le test s’est avéré incroyablement robuste dans un certain nombre de conditions à haut débit et est également compatible avec les lysats de cellules entières37.
L’affinité entre les protéines d’histones et les brins d’ADN qui les entourent se relâche en raison de la neutralisation de la charge positive sur la chaîne latérale de l’arginine lors de la citrullination. I...

Un grand nombre de protéines de mammifères sont fortement modifiées par l&#39;action d&#39;enzymes suivant la biosynthèse des protéines par le ribosome. Ces modifications post-traductionnelles (MPT) peuvent augmenter considérablement la diversité fonctionnelle du protéome en changeant la taille, la charge, la structure et l&#39;état d&#39;oligomérisation (entre autres fonctions) de protéines 1-3. En conséquence, le changement de structure de la protéine peut avoir des conséquences physiologiques, tels que la dégradation des protéines, la différenciation cellulaire, la signalisation, la modulation de l&#39;expression génique, et les interactions protéine-protéine. Bien que ces modifications sont répandues dans un grand pourcentage de toutes les protéines humaines, le terminal se termine sur des protéines histones subissent un nombre anormalement élevé de modifications covalentes 4. protéines histones sont une famille de protéines de structure qui facilitent la condensation de l&#39;ADN génomique. Des modifications covalentes des queues d&#39;histones non structurées sont effectuées et réglées par une séries d&#39;enzymes capables de catalyser la modification covalente de résidus (écrivains), inverser les mêmes modifications (gommes à effacer), et la distinction entre les changements étant imprimé sur les queues d&#39;histones (lecteurs) 5-7. En fait, la plupart des PTM connus peut être observé dans ce court segment de l&#39;histone y compris la méthylation, phosphorylation, acétylation, sumoylation, ubiquitination, et citrullination 8. Citrullination implique la conversion de peptidyl-arginine de l&#39;ARN t non codé peptidyl-citrulline (figure 1A). Les protéines, responsables de cette neutralisation de la chaîne latérale, sont membres de la PAD (p eptide un d eiminase rginine) famille de protéines, qui sont des enzymes dépendant du calcium. 9,10. À ce jour, cinq membres de la famille de PAD ont été décrits (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, et PAD6). Chaque membre de cette famille semble cibler des protéines cellulaires distincts et affiche également uniprofils de distribution tissulaire Qué. PAD4 est le seul membre de cette famille de protéines connues pour être localisée dans le noyau par l&#39;intermédiaire d&#39;une séquence de localisation nucléaire 11. En conséquence, il a été démontré que deiminate un certain nombre de cibles nucléaires, y compris les chaînes latérales d&#39;arginine sur les queues N-terminales des histones H2A arginine résidu 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, et H3R26) et H4 (H4R3) 12, 13. Bien que chacune des isoenzymes de la PAD ont des fonctions physiologiques spécifiques et critiques, PAD4 a reçu beaucoup plus d&#39;attention en raison de son rôle dans un certain nombre de processus humains à la fois les cellules saines et malades. Récemment, PAD4 a été montré pour être un membre du réseau de la transcription de la pluripotence 14. Les deux niveaux d&#39;expression et de l&#39;activité pAD4 ont été montrés à être élevé lors de la reprogrammation et l&#39;Etat-sol Etats pluripotentes chez la souris. En contrôlant la régulation des gènes de cellules souches, PAD4 peut conserver un rôle central dans l&#39;efficacité de la reprogrammation cellulaire. PAD4 a également été impliquée dans laformation de pièges extracellulaires neutrophiles, qui lors de la liaison des agents pathogènes permettre leur dégagement du système. Le hypercitrullination de protéines histones par PAD4 induit la décondensation de la chromatine, qui sert de matériau de base pour l&#39;encapsulation de bactéries pathogènes par le piège extracellulaires, ainsi éloigner les infections bactériennes 15,16. En outre, PAD4 a été trouvé à jouer un rôle actif dans un certain nombre de maladies humaines. Il a été précédemment montré que l&#39;expression aberrante de PAD4 est associé à l&#39;apparition et la gravité de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques et 17. En fait, la présence d&#39;anticorps anti-protéine est une citrullinés des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques fiables et les plus définitives de la polyarthrite rhumatoïde 18. De même, l&#39;activité dérégulée PAD4 a récemment été observé dans un certain nombre de cancers humains, y compris de l&#39;ovaire, du sein, du poumon, und cancers de l&#39;œsophage 19-22. Le lien entre PAD4 et le cancer a été montré être médiée par l&#39;oncogène ELK1 ou via la p53 protéine suppresseur de tumeur et 22,23 travaux antérieurs ont suggéré que PAD4 pourrait être un anti-cancer cible thérapeutique 17,24,25. En tant que preuve de principe étude, l&#39;épuisement des PAD4 via shRNA dans la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 a été révélée être suffisante pour induire l&#39;apoptose et arrêt du cycle cellulaire 26. Inhibiteur irréversible de PAD4 récemment développé a conduit à une réduction de soixante-dix pour cent de la masse tumorale chez les souris 27. Tout à fait remarquable, PAD4 inhibition semble agir comme une thérapie ciblée qui conduit à une destruction sélective des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules non transformées. L&#39;utilisation de petites molécules pour désactiver la fonction de PAD4 peut se révéler être une nouvelle stratégie efficace pour cibler les cellules cancéreuses ou d&#39;augmenter les agents chimiothérapeutiques contre le cancer 28 existantes. Malheureusement, un poinhibiteur de PAD4 réversible de la tente n&#39;a pas encore été découvert. Un certain nombre d&#39;inhibiteurs covalents ont été développés en utilisant la chloro / poignée de imidine fluoro qui imite le substrat arginine 27,29,30 et se sont révélés être des outils pratiques pour comprendre le rôle de PAD4 dans les cellules de l&#39;État sains et malades. Cependant, ces molécules inhibent tous les DPA actifs avec une activité similaire. Par conséquent, la nécessité d&#39;un dosage facile que les rapports sur l&#39;activité de PAD4 est crucial. À ce jour, pAD4 essais ont été décrits qui pointent le rejet de l&#39;ammoniac à partir de la réaction à une lecture colorimétrique 31, utiliser un analogue de substrat de chloroamidine marqué par fluorescence pour l&#39;analyse de polarisation de fluorescence 32, compter sur la réaction acide-assistée entre glyoxal et citrulline 33, et coupler l&#39;activité PAD4 à une fluorescence étape 34 dequenching. Parmi ceux-ci, seul le modificateur de stratégie haloacetamidine covalente est avéré être compatible avec scre à haut débitplates-formes Ening 32,35,36. Nous décrivons un test basé sur la fluorescence facile qui mesure de façon fiable l&#39;activité de PAD4. L&#39;essai, qui présente un fort rapport signal-sur-bruit, la vitesse d&#39;analyse, et la robustesse de la mesure, est susceptible de découvrir un inhibiteur de PAD4 vraiment puissant et sélectif.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><<td>a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td></tr><tr><td>Ampicilline Trihydrate (Poudre blanc cassé), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&nbsp ;</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>Tous les sels tampons&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Peut acheter auprès de Fisher Scieintifc ; VWR ; Acros ; Sigma-Aldrich ; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathion (GSH) agarose&nbsp ;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Magasin à 4 &deg ; C; http://www.mn-net.com/</td></tr> <tr><td>Chloroamidine&nbsp ;</td><td>Cayman Chemical&nbsp ;</td><td>10599</td><td>Magasin à -20 &deg ; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Plaques Corning/Nunclon MicroWell (96 et 384)</td><td></td><td></td><td>Achat chez Corning ; Logiciel de lecture de microplaques Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control</td><td><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filtre<a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

suivi par fluorescence de pad4 activité via un analogue de substrat pro-fluorescence

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Les modifications post-traductionnelles peuvent conduire à des états fonctionnels protéiques modifiés en augmentant les variations covalentes sur les chaînes latérales de nombreux substrats protéiques. Les queues d’histones représentent l’un des tronçons les plus fortement modifiés de toutes les protéines humaines. Il a été démontré que la peptidyl-arginine déiminase 4 (PAD4) convertit les résidus d’arginine en résidu de citrulline non codé génétiquement. Peu d’essais décrits à ce jour ont été faciles à utiliser avec une sensibilité satisfaisante. Ainsi, l’absence de dosages adéquats a probablement contribué à l’absence d’inhibiteurs non covalents puissants de PAD4. Nous y décrivons un nouveau test basé sur la fluorescence qui permet de surveiller l’activité de PAD4. Un analogue de substrat pro-fluorescent a été conçu pour lier l’activité enzymatique de PAD4 à la libération de fluorescence lors de l’ajout de la protéase trypsine. Il a été démontré que le test est compatible avec des conditions de criblage à haut débit et qu’il présente un fort rapport signal/bruit. De plus, le test peut également être effectué avec des lysats de cellules brutes contenant du PAD4 surexprimé.

Dans un premier temps, il a été démontré que ZRcoum peut rendre compte de l'activité de PAD4 dans un format de plaque à 96 puits. Les puits ont été incubés avec la ZRcoum de substrat et en présence / absence de PAD4. Après une période d'incubation de 45 min à 37 ° C, la fluorescence a été mesurée avec un 340/40-475/15 nm filtre (figure 2A). Comme prévu, les niveaux de fluorescence sont restés faibles comme le fluorophore dans ZRcoum (ou la citrulline <s...

PAD4 est une enzyme responsable de la conversion de la peptidyl-arginine en peptidyl-citrulline. La dérégulation de PAD4 a été impliquée dans un certain nombre de maladies humaines. Un test PAD4 basé sur la fluorescence, facile et compatible avec le haut débit, est décrit.

Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’obtenir des informations quantitatives sur le niveau d’activité de la pastille quatre dans un test facile à reproduire par fluorescence. Ceci est réalisé par l’incubation de la pastille quatre avec le substrat de conception analogique ZR Co.La protéine est incubée soit à température ambiante, soit à 37 degrés Celsius pour permettre la conversion du dérivé de l’arginine en produit Citraline, ce qui entraîne une modification covalente du substrat. Ensuite, la trypsine est ajoutée à la solution afin de générer la différence de signal fluorescent.Les résultats montrent l’ajout de la pastille active quatre à une solution contenant le prof. Le substrat fluorescent entraîne un changement covalent basé sur sa sensibilité réduite à la trypsine et donc aux nœuds de signaux fluorescents inférieurs. Le principal avantage de notre technique par rapport aux techniques existantes, telles que celle qui examine la libération du sous-produit volatil de l’ammoniac, est que nous surveillons la modification du substrat à l’aide de la fluorescence.Mary Saki et Jonathan Fiera feront la démonstration de cette technique pour mon laboratoire : pour travailler avec le pad quatre, transformer d’abord le plasmide pgx contenant la fusion pad 4G ST en cellules E coli chimiquement compétentes pour l’expression de la protéine pad quatre, toutes les cellules sur la glace. Deuxièmement, mélangez les troisièmes cellules avec un microlitre du plasmide PGX contenant le gène pad quatre dans un tube de culture de cinq millilitres. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 minutes et secouez-le doucement toutes les deux minutes.Ensuite, chacun choque les cellules à 42 degrés Celsius pendant 40 secondes. Immédiatement après, remettez le mélange de plasmides cellulaires sur de la glace pendant deux minutes afin que les cellules puissent récupérer. Ajoutez maintenant un millilitre de LB stérile et gardez les cellules au frais pendant une minute supplémentaire.Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant une heure. Réglez-les en les agitant à 250 tr/min après l’incubation, pipetez 75 microlitres des cellules transformées sur une plaque de gélose résistante à l’ampicilline et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 heures. Conservez cette assiette à quatre degrés Celsius.Transférez une colonie de cellules transformantes dans cinq millilitres de LB contenant de l’ampicilline. Placez le tube dans un incubateur et secouez-le toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain.Transférez la culture de démarrage de cinq millilitres dans un litre de STO L LB contenant une x ampicilline tri. Surveillez l’OD 600 des cellules pendant qu’elles se développent à 37 degrés Celsius. Lorsque leur absorbance atteint 0,3.Transférez le ballon dans une pièce à 16 degrés Celsius et continuez à agiter. Continuez à surveiller la surface extérieure de la croissance. Lorsque la DO de la culture atteint 0,6.Induire les cellules avec 0,3 millimolaire d’isopropyle THAG GTO. Laissez les cellules trembler pendant 15 heures à 16 degrés Celsius. Il est crucial de s’assurer que la température de croissance est de 16 degrés Celsius avant de commencer l’induction avec IPTG.Le lendemain, les cellules sont centralisées par centrifugation à 4 000 g pendant 20 minutes à zéro degré Celsius ou à l’arrêt de l’agent SUP et stockent la pastille de cellule à moins 80 degrés Celsius pour recueillir le tampon. Quatre protéines remettent en suspension la pastille de cellule transformée dans un tampon contenant du phénol EOL, du fluorure de méthylsuen et de l’étol dihi trois. Ensuite, les cellules utilisent la sonication pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, après la sonication centrifuge les lysats à 20 000 fois G pendant 20 minutes et à zéro degré Celsius.Récupérez le supinat et incubez-le avec des billes de glutathion aéros pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Égouttez le supinat des billes de GST par gravité après la collecte de l’écoulement. Lavez les perles quatre fois avec 25 millilitres de PBS à quatre degrés Celsius.Ensuite, éluez la protéine du tampon quatre des billes à l’aide de 10 millilitres de tampon tampon elucian et concentrez le tampon quatre dans le tampon elucian à l’aide de tubes centrifuges de coupure de poids moléculaire de 100 K. Enfin, Eloqua, le produit purifié, transforme quatre protéines en volumes de 200 microlitres pour les stocker à moins 80 degrés Celsius. Pour cette procédure, préparez une solution de travail micromolaire 83 de la solution A marquée au ZR co.Préparez également les solutions B, D et la solution de la solution quatre C.In préparant la solution E, assurez-vous de mélanger jusqu’à ce que la TRIPSIN se dissolve.Procurez-vous une plaque à 384 puits et désignez le bloc-notes, les quatre puits de contrôle, les puits d’essai et les puits d’inhibition pour le tampon quatre plus la chloroamadine. Ajoutez ensuite 25 microlitres de solution C dans chaque puits de test et 25 microlitres de D dans chaque contrôle. Bien incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante.Après 20 minutes, ajoutez 10 microlitres de solution B dans les puits d’inhibition et attendez 20 minutes de plus. Ensuite, ajoutez 15 microlitres de solution A dans tous les puits. Attendez ensuite 45 minutes.Après 45 minutes, ajoutez 10 microlitres de solution E dans tous les puits et attendez 10 minutes de plus avant de prendre des mesures de fluorescence. Enfin, utilisez un lecteur multimodal pour collecter les données d’émission. Zar CO a été incubé avec et sans tampon quatre pendant 45 minutes sans tampon quatre, l’ajout de tripsine sans effet, les niveaux de fluor et de fluorescence augmentent et la présence du tampon quatre zar est modifiée et la trypsine ne libère pas le fluor, diminuant ainsi la fluorescence.L’essai a été testé sur des plaques à puits à haute densité à température ambiante pour permettre des procédures de criblage à haut débit à température ambiante. Les signaux sont restés pratiquement inchangés par rapport à ceux obtenus à 37 degrés Celsius. La réaction s’est déroulée plus lentement à température ambiante.Il a été terminé en 45 minutes. La stabilité du PED quatre dans le tampon de réaction a ensuite été testée comme une stabilité élevée aussi importante pour le criblage à haut débit sur une période de 15 heures. Aucune perte d’activité enzymatique n’a été détectée.L’inhibition du PLA quatre par la chloro AMADINE montre les tendances attendues dans ces conditions d’essai à température ambiante. Pour contester la robustesse du test PAD four zku, il a été utilisé pour tester un lysat cellulaire brut de cellules E coli exprimant GST pad quatre. Lorsqu’il a été testé dans les mêmes conditions que le tampon GST purifié, une fluorescence quatre a été observée comme prévu.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer la pastille active quatre et de surveiller son activité à l’aide de ce test facile et fiable basé sur la fluorescence à l’aide d’un substrat de fluorescence prof.

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Chimie

Nous allons décrire une méthode qui mesure la cinétique de transport des ions des protéines membranaires spécifiques au site aux côtés de l'analyse des changements conformationnels à l'aide de fluorescence sur des cellules individuelles. Cette technique est adaptable aux canaux ioniques, les transporteurs et les pompes ioniques et peut être utilisé pour déterminer les contraintes distance entre sous-unités protéiques.

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie est une technique puissante pour surveiller en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant différents biocapteurs en tant que journalistes. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d'imagerie à partir de composants disponibles dans le commerce et la façon de l'utiliser pour des expériences de FRET.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

Nous démontrons l’utilisation de la microscopie de localisation par photo-activation de fluorescence (FPALM) pour imager simultanément plusieurs types de molécules marquées par fluorescence au sein des cellules. Les techniques décrites permettent de localiser des milliers à des centaines de milliers de protéines individuelles marquées par fluorescence, avec une précision de plusieurs dizaines de nanomètres à l’intérieur de cellules uniques.

Imagerie multicolore simultanée de structures biologiques avec microscopie de localisation par photoactivation de fluorescence

Cet article propose une méthode pour étudier la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome, à l’aide d’une construction synaptobrevin2-pHluorin et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. La stratégie développée pour le traitement d’images et l’analyse des données est également rapportée.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

Nous décrivons une technique permettant de mesurer simultanément la cinétique de liaison du récepteur unique et du ligand régulée par la force et l’imagerie en temps réel de la signalisation calcique dans un seul lymphocyte T.

Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

Dans le cœur, les événements moléculaires coordonnent la fonction électrique et contractile de l'organe. Un ensemble de techniques de microscopie de fluorescence de champ locales présentées ici permet l'enregistrement des variables cellulaires dans les cœurs intacts. mécanismes définissant la fonction cardiaque Identifier est essentiel dans la compréhension comment le cœur fonctionne dans des situations pathologiques.

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Etiquetage du domaine extracellulaire d'une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l'expression et le trafic à déterminer. les protéines d'imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Nous décrivons ici un test haut débit fluorescence qui mesure la membrane plasmique rescellage d’efficacité grâce à des analyses fluorimétrique et imageries de cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des drogues ou des gènes de cible qui régulent la membrane plasmique réapposition de sceau sur des cellules mammaliennes.

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

L’activation de la kinase ser/Thr multifonctionnelle AURKA est caractérisée par son autophosphorylation sur Thr288. Les sondes fluorescentes s’appuyant sur FRET peuvent faire la distinction entre ses états inactif et activé. Ici, nous illustrons quelques stratégies pour l’ingénierie des sondes, ainsi qu’un protocole FRET rapide pour suivre l’activation des kinases tout au long de la mitose.

Surveillance en temps réel de l’activation de l’aurora kinase A à l’aide de biocapteurs FRET conformationnels dans des cellules vivantes

Le présent protocole décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données pour quantifier la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test amélioré d’extraction à molécule unique (SiMPull).

Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines

Le protocole présenté dans cette étude illustre l’efficacité du détecteur de différence AMPc in situ  dans la mesure de l’AMPc à l’aide de deux méthodes. L’une des méthodes utilise un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits avec des cellules HEK-293. L’autre méthode permet de visualiser des cellules HASM individuelles au microscope fluorescent.

Dynamique de l’AMPc en temps réel dans les cellules vivantes à l’aide du détecteur de différence AMPc fluorescent in situ

Découvrez un test de fluorescence pour mesurer l'activité de PAD4, une enzyme impliquée dans la conversion de l'arginine en citrulline. Cette méthode permet un criblage à haut débit des inhibiteurs de PAD4.

Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence

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