Name: Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Découvrez deux protocoles de cytométrie en flux pour mesurer les réponses immunitaires cellulaires au virus du Nil occidental. Ces méthodes analysent la capacité des cellules dendritiques à présenter des antigènes et activent les lymphocytes T.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH à T.W. (R01AI072060 et R01AI099123). G. Xie a été soutenu par une bourse prédoctorale du Sealy Center for Vaccine Development. Nous remercions le Dr Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) et le Dr Shizuo Akira (Université d’Osaka, Japon) pour avoir fourni les souris MyD88–/– et le Dr Y Cong (UTMB, Galveston) pour avoir fourni les souris transgéniques OTII.

Toutes les expériences animales ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation Comité animale de l&#39;Université du Texas Medical Branch. 1. Isolement des PED de souris non infectées et infectées par le VNO <ol><li> Match de l&#39;âge et le sexe 6-10 semaines-vieux, de type sauvage C57BL / 6 (B6) et MyD88 - / - souris. Inoculer par voie intrapéritonéale (ip) avec 500 unités formant des plaques (PFU) du VNO NS4B- P38G mutant. Au jour 3 après l&#39;infection, euthanasier B6 et MyD88 - / - souris avec du CO 2. Utilisation des souris non infectées de deux groupes comme témoins. Utilisez trois souris de chaque groupe. </li><li> Fourrure mouillée sur le côté gauche de la souris sacrifiées en utilisant 70% d&#39;éthanol et coupé la fourrure le long du côté gauche de la souris, à mi-chemin entre les jambes avant et arrière. Couper ouvrir la cavité du corps. Retirer la rate en utilisant les forceps. Placez la rate dans une boîte de Pétri avec du RPMI. </li><li> Isoler DC spléniques en utilisant des billes magnétiques anti-CD11c selonles instructions du fabricant. </li></ol> 2. Purification et d&#39;étiquetage des cellules T de souris transgéniques OTII <ol><li> Récolte une rate d&#39;une souris OTII naïve comme décrit dans l&#39;étape 1.2 ci-dessus et homogénéiser la rate entre les extrémités de deux diapositives givrées. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml, ajouter du milieu RPMI à 14 ml. Laissez la suspension reposer pendant 5 min et 13 ml de transférer à un nouveau tube de 15 ml conique. </li><li> Isoler les cellules T CD4 + spléniques en utilisant un kit T CD4 + d&#39;isolement des cellules selon les instructions du fabricant. </li><li> des cellules de transfert dans un tube conique de 50 ml, rincer deux fois avec du PBS. Resuspendre les cellules dans du PBS avec 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) à 1 x 10 6 cellules par ml, et ajouter 0,5 pmol / ml de CFSE. Incuber à 37 ° C pendant 10 min, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu complet froid (RPMI-1640 avec 10% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur, 1/100 voldes antibiotiques / antimycosiques, 1/100 en volume de L-glutamine et 1/1000 x 1000 vol de 2-mercaptoéthanol). </li><li> Incuber sur de la glace pendant 5 min. Laver les cellules une fois avec du PBS, fixent 0,2 x 10 6 cellules T CD4 + marquées dans 2% de PFA et d&#39;acquérir sur un cytomètre de flux. Utilisez cet exemple pour déterminer le niveau de base de CFSE. Re-suspendre le reste de cellules marquées dans un milieu complet. </li></ol> 3. Co-culture OTII cellules T avec DC de souris infectées par le VNO <ol><li> Culture 2 x 10 5 cellules T CD4 + purifiées de souris OTII seul ou avec PED purifiées de type sauvage ou MyD88 - / - souris (2 x 10 4) dans une plaque à 24 puits avec ou sans OVA résidus 323-339 (1 g / ml) dans 1 ml de milieu complet par puits. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 jours. cellules de récolte, laver deux fois dans un tampon FACS (PBS avec 1% de FBS) et fixent dans 0,25 ml 2% PFA. Vortexer immédiatement. </li></ol> 4. cytométrie en flux in vitro &lt;/ Em&gt; T Cell Amorçage <ol><li> Pour l&#39;acquisition, double-cliquez sur l&#39;icône de la cytométrie de flux logiciel. Pour une parcelle de densité linéaire FSC-A vs SSC-linéaire A, sélectionnez canaux 0 à 200 000 sur FSC-A et de 0 à 200 000 le SSC-A. Ensuite, créez une porte sur des cellules vivantes (P2; voir la figure 1A). </li><li> Pour analyser l&#39;intensité de fluorescence de CFSE, ouvrez l&#39;histogramme pour le canal FL1 et d&#39;acquérir 20 000 événements sur la population fermée. Mettre en place un marqueur sur des échantillons pour les cellules OTII cultivées seules (figure 1A). </li><li> Acquérir des échantillons de cellules OTII co-cultivées avec des DC de type sauvage (figure 1B) ou MyD88 - / - PED (figure 1C) d&#39;une manière similaire. </li></ol> 5. Isolement et stimulation de splénocytes pour dosages de cytokines <ol><li> Infecter B6 et MyD88 - / - souris avec mutant VNO NS4B-P38G en utilisant la même procédure que celle décrite dans ste1,1 p. Au jour 30 post-infection, nouveau défi souris survivantes avec 2000 UFP de type sauvage VNO souche ip Au jour 8 et 21 infection par le VNO post-primaire ou au jour 4 après l&#39;infection secondaire, euthanasier les souris avec du CO 2 pour la collecte des rates . NOTE: Nous avons utilisé 2-3 souris par groupe pour chaque point de temps. </li><li> Faire une suspension cellulaire unique de splénocytes comme décrit ci-dessus dans l&#39;étape 1.2 et 2.2 étape. Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et remettre en suspension dans 10 ml eux de milieu complet. </li><li> Diluer les cellules avec du milieu complet à 2,5 x 10 6 cellules / ml. Ajouter 1 ml de splénocytes dans 1,5 ml d&#39;un tube de micro-centrifugeuse. </li><li> Pour simuler les cellules T CD8 +, diluer NS4B et E peptides spécifiques de l&#39;infection par le VNO (SSVWNATTA et IALTFLAV) à 1 mg / ml dans du DMSO. Pour la stimulation des cellules T CD4 +, diluer NS3 et E peptides spécifiques de l&#39;infection par le VNO (RRWCFDGPRTNTILE et PVGRLVTVNPFVSVA) à 1 mg / ml dans du DMSO. Ajouter 10 ul de peptides aux cellules followed par une pi d&#39;une solution Bréfeldine. Utiliser des cellules sans traitement des peptides comme témoins. Mélanger les cellules. </li><li> Poinçon deux trous avec une aiguille de 18 G dans le bouchon du tube. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 heures. </li></ol> 6. intracellulaire de cytokines coloration <ol><li> cellules de transfert à un nouveau tube de micro-centrifugeuse. Spin cellules pendant 5 min à 300-400 xg et verser le surnageant. Ajouter 1 ml tampon FACS, rotation 5 min à 300-400 xg et remettre en suspension les cellules par pipetage avec 120 ul tampon FACS. </li><li> Ajouter 2 ul de Fc de blocage et incuber les cellules à température ambiante pendant 10 min. Ajouter 1 ml de tampon FACS à chaque tube. Spin 5 min à 300-400 x g. </li><li> Re-suspendre les cellules dans 300 pi FACS tampon et les diviser en trois tubes (environ 0,8 x 10 6 cellules par tube). Comme le montre le tableau 1, se réserver le premier tube de chaque condition de culture de rat IgG-PE coloration. Pour le second tube, ajouter 3 ul d&#39;anti-CD4 APC pour CD4 peptides cellules traitées, 3 μl d&#39;anti-CD8 FITC à des cellules CD8-peptides traités à la fois des anticorps ou des cellules sans traitement des peptides. Utilisez le troisième tube d&#39;indemnisation coloration. Pour chaque condition de culture, utiliser trois tubes de cellules colorées avec APC conjugué CD4, CD8 conjugué au FITC ou PE- anticorps marqués CD3 seul (3 pi par tube) que les contrôles de compensation pour FL1, FL2 et des canaux de FL4. </li><li> cellules Vortex brièvement. Laisser sur la glace pendant 20 min et protéger de la lumière. Ajouter 1,4 ml de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 xg et verser le surnageant. </li><li> Agiter à perturber culot cellulaire (ou vortex brièvement). Re-suspendre culot cellulaire dans 250 pi de fixation / perméabilisation solutionby pipetage. Incuber à température ambiante pendant 20 min et à protéger de la lumière. </li><li> Ajouter 1,2 ml de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 cellules XG et remettre en suspension dans un tampon FACS 300 pi. NOTE: A ce stade, les cellules peuvent être transférés à un laboratoire BL2 pour un traitement ultérieur ou stocké dans un réfrigérateur et protégé de la lumière pour up à trois jours. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 cellules XG et remettre en suspension dans 500 pi de tampon perméabilisation / lavage 1x. Spin 5 min à 300-400 x g. </li><li> Re-suspendre les cellules dans 100 ul 1x Perm / Wash, ajouter 3,5 pi anti-IFN-PE au tube précédemment ajouté avec des anticorps pour CD4 et ou marqueurs cellulaires / T CD8 à l&#39;étape 6.3 et 3.5 pi rat IgG-PE dans le tube réservé pour le contrôle IgG pendant 25 min sur de la glace et de protéger de la lumière. Laver les cellules en ajoutant 1,4 ml de tampon perméabilisation / lavage 1x. Spin 5 min à 300-400 x g. Répétez l&#39;étape de lavage en ajoutant 1,4 ml 1x tampon perméabilisation / lavage. </li><li> Spin 5 min à 300-400 xg et décanter surnageant. Laver les cellules par addition de 1,4 ml de tampon FACS et remettre en suspension dans 400 ul de tampon pour FACS pour l&#39;acquisition finale. </li></ol> 7. cytométrie en flux de cytokine intracellulaire coloration <ol><li> Utilisez les mêmes paramètres d&#39;acquisition comme dans l&#39;étape 4.1. Create une porte sur des cellules vivantes (P2; voir la figure 2A). Réglez les tensions en utilisant les tubes de rémunération pour chaque groupe. </li><li> Ouvrez deux nouveaux tracés de points, une pour afficher les données recueillies pour FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), et l&#39;autre est d&#39;afficher les données collectées pour FL4 vs. FL2 (vs CD4. IFN-γ). Acquérir 50 000 événements pour la population fermée de chaque échantillon. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

VNO est un agent pathogène BL3. En raison des règlements de sécurité, les dosages immunologiques avec des échantillons de VNO-infectés sont souvent limités par la disponibilité de l&#39;équipement au BL3 installations ou plus longue et fastidieuse à effectuer. Dans une étude récente, nous avons utilisé deux méthodes basées sur la cytométrie de flux pour étudier les réponses immunitaires à médiation cellulaire lors de l&#39;infection par le VNO 5. Dans les deux essais, les cellules infectées par le VNO ont été...

Le virus du Nil occidental (VNO), un neurotrope, plus-détectées flavivirus, est une menace pour la santé publique émergents. Actuellement, aucun vaccin ont été approuvés pour usage humain 1. Une souche atténuée VNO, qui a une substitution P38G dans le non structurale (NS) protéine 4B, est connu pour induire aucune létalité chez les souris, mais supérieur cytokines innées et les réponses des lymphocytes T chez les souris de type sauvage que le VNO NY99 souche 2. Souris immunisées avec le mutant NS4B-P38G ont tous été protégés contre un défi secondaire avec de type sauvage létale VNO. Ceci suggère que le mutant NS4B-P38G a des caractéristiques appropriées pour un candidat vaccin idéal. Les mécanismes par lesquels le mutant NS4B-P38G induit haute immunité adaptative de protection ne sont pas encore clairement compris. Toll-like récepteurs (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires associés à des pathogènes, jouent un rôle essentiel dans le déclenchement de l&#39;immunité innée à l&#39;infection virale. La voie de signalisation de TLR de base utilise réponse différenciation myéloïde primaire geNE 88 (MyD88) comme carte principale 3,4. Dans une étude récente, la signalisation MyD88 a été montré à jouer un rôle important dans le développement de l&#39;immunité à médiation cellulaire au cours VNO NS4B- P38G infection chez la souris mutante 5. Cellules dendritiques (CD) sont une des plus importantes cellules présentatrices d&#39;antigène présentant la capacité unique d&#39;initier les réponses des cellules T primaires lors de l&#39;infection virale 6,7. Lymphocytes T CD4 + et CD8 + contribuent tous deux à l&#39;immunité protectrice de longue durée et sont importants pour la survie de l&#39;hôte après-type sauvage infection par le VNO 8,9. Deux dosages immunologiques ont été utilisés dans cette étude pour évaluer les fonctions de ces cellules chez les souris mutantes infecté NS4B-P38G. Tout d&#39;abord, un test d&#39;amorçage de cellules T in vitro a été utilisé pour comparer la capacité de présentation antigénique des CD de type sauvage du VNO-infectés et MyD88 - / - souris. Pour augmenter la sensibilité du test, naïfs CD4 &lt;sup&gt; + cellules T ont été isolés à partir de OTII souris transgéniques, qui expriment une spécifique Vα2 / Vβ5 TCR pour l&#39;ovalbumine de poulet (OVA) peptide 323 - ont été purifiés 339. PED de souris infectées par le VNO, et co-cultivées avec carboxyfluorescéine succinimidyl pâques (CFSE ) marqué à des cellules T CD4 + en présence de peptide OVA. Après 5 jours de co-culture, les cellules ont été récoltées et fixées avec du paraformaldehyde (PFA) et analysées par cytométrie en flux. Des dosages de prolifération ont été traditionnellement réalisée par incorporation de 5-bromo-2&#39;-désoxyuridine (BrdU) ou désoxyriboside de thymine tritiée (3 HTdr) 10. Néanmoins, ces tests sont soit radioactifs et / ou dans le besoin d&#39;équipements spéciaux au niveau de biosécurité (BL) 3 des installations, où des études de VNO sont menées. L&#39;analyse par cytométrie de flux de la prolifération des lymphocytes par division par deux en série de l&#39;intensité de fluorescence du colorant vital CFSE est devenue plus couramment utilisé dans des essais immunologiques comme le colorant est plus stableet incorporé uniformément dans les cellules, facilement détectée par cytométrie de flux, et est non-radioactif 11. L&#39;essai a également la possibilité d&#39;évaluer le nombre de divisions cellulaires. Un avantage majeur de l&#39;utilisation de ce test dans les études VNO est que la fixation des cellules infectées avec 1-2% PFA pourrait inactiver VNO 12, ce qui permettra l&#39;acquisition de l&#39;échantillon avec un cytomètre de flux dans un laboratoire de BL2. Ensuite, une procédure coloration de cytokine intracellulaire modifié (ICS) a été utilisé pour étudier le rôle de signalisation MyD88 dans la régulation de réponses des lymphocytes T spécifiques du VNO chez les souris mutantes infectées NS4B-P38G. Dans ce dosage, les splénocytes isolés à partir de souris infectées ont été traitées in vitro avec des peptides spécifiques VNO. Bréfeldine A a été ajouté à retenir les cytokines dans la cellule. Après 5 heures d&#39;incubation, les cellules ont été récoltées, lavées et colorées pour des sous-ensembles de cellules T. Les cellules ont ensuite été fixées dans PFA, perméabilisées et colorées pour l&#39;interféron (IFN) -γ et analysées par cytométrie en flux.Comme avec d&#39;autres dosage à base de cytométrie en flux, une fois que les cellules sont traitées avec un tampon de fixation et perméabilisation contenant PFA, les échantillons infectés peuvent être transférés à un laboratoire de BL2 pour un traitement ultérieur et d&#39;analyse. Dans plusieurs études publiées, nous avons utilisé ICS pour mesurer les fonctions T effectrices de cellules chez des souris infectées par le VNO 13,14. Bien qu&#39;il soit bien établi, un inconvénient majeur de ce test est que la procédure est très longue et pourrait être plus de temps lorsqu&#39;il est effectué à l&#39;intérieur des installations BL3. Ici, un procédé à base d&#39;ICS tube de micro-centrifugeuse de se est révélé être plus facile, plus facile de procéder et moins de temps lorsqu&#39;il est effectué dans un laboratoire BL3.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>échauffement à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>billes magnétiques anti-CD11c</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>suivre le fabricant s instructions</td></tr><tr><td>anti-CD4 billes magnétiques</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>suivre le fabricant' s instructions</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Résidu OVA 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>Proimmune</td><td>PC0AD-D</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A solution</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc Blocker</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td> <td>conjugué APCe-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>CD8 conjugué à la FITC</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Solution de fixation/perméabilisation</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de perméabilisation/lavage</td><td>BD-Bioscience 554723</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-IFN&gamma ;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux Accuri</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire myd88 médiation au virus du nil occidental souche mutante infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Un virus atténué du Nil occidental (VNO), un non structurale (NS) 4B-P38G mutant, induite par les cytokines supérieur innée et réponses des lymphocytes T de type sauvage VNO chez les souris. Récemment, facteur de différenciation myéloïde 88 (MyD88) la signalisation se est avérée importante pour l&#39;amorçage de cellules T initiale et le développement des cellules T mémoire pendant VNO NS4B-P38G infection mutant. Dans cette étude, deux méthodes de flux basés cytométrie-- in vitro des cellules T dosage dans l&#39;amorçage et une cytokine coloration intracellulaire (ICS) - ont été utilisées pour évaluer les cellules dendritiques (CD) et les fonctions des cellules T. Dans la cellule T amorçage dosage, la prolifération cellulaire a été analysée par cytométrie de flux après co-culture de DC par les deux groupes de souris avec de l&#39;ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) - marqué les cellules de souris transgéniques OTII T CD4 +. Cette approche a fourni une détermination précise du pourcentage de la prolifération des cellules T CD4 + est nettement améliorée avec sensibilité globale de la traditional dosages avec des réactifs radioactifs. Système de tube de microcentrifugation a été utilisé dans les deux procédés de culture de cellules et une coloration de la cytokine protocole ICS. Par rapport au système traditionnel à base de plaque de culture de tissu, cette procédure modifiée était plus facile à réaliser au niveau de la prévention des risques biotechnologiques (BL) 3 des installations. En outre, les cellules infectées WNV- ont été traités avec du paraformaldéhyde dans les deux essais, ce qui a permis une analyse plus poussée en dehors des installations BL3. Dans l&#39;ensemble, ces tests in vitro immunologiques peuvent être utilisés pour évaluer efficacement des réponses immunitaires à médiation cellulaire au cours de l&#39;infection par le VNO.

Dans l'essai d'amorçage des cellules T, les cellules T CD4 + marquées CFSE ont été cultivées avec des DC purifié à partir du type sauvage NS4B-P38G mutant infecté et MyD88 - / - souris en présence ou en l'absence de peptides OVA. Les cellules T cultivées seules marqués avec ou sans OVA pendant 5 jours ont été utilisés comme témoins négatifs. Comme le montre la figure 1A, les cellules T totaux ont été bloqués pour l'analyse de l'intensité de fluorescence sur le canal FL1. Le marqueu...

<Deux méthodes basées sur la cytométrie en flux – un test d’amorçage >in vitro des lymphocytes T et une coloration intracellulaire des cytokines – ont été utilisées pour mesurer la capacité de présentation de l jove_content’antigène des cellules dendritiques et les réponses des lymphocytes T spécifiques de l>'antigène à une infection mutante par le virus du Nil occidental chez la souris.

Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

L’objectif global de cette étude est d’introduire deux tests immunologiques basés sur la cytométrie en flux pour mesurer la réponse immunitaire à médiation cellulaire à l’infection par le virus du Nil occidental dans l’essai d’amorçage in vitro des cellules T, ou dcs purifiés à partir de souris infectées par le virus West Nll. Une co-culture avec des lymphocytes T naïfs marqués au CFSE a purifié à partir de deux souris transgéniques OT en présence de peptide d’ovule. La réponse de prolifération des lymphocytes T est ensuite analysée par cytométrie en flux dans un laboratoire de niveau de biosécurité deux dans le test de coloration des cytokines intracellulaires modifiés cytes PLE de souris infectées par le virus du Nil occidental, A stimulé ex vivo avec des peptides spécifiques du Nil occidental dans un tube de micro-centrifugeuse, puis le sustain cellulaire pour la production de cytokines intracellulaires et analysé dans le tube par cytométrie en flux dans le laboratoire de niveau de biosécurité deux.En fin de compte, ces méthodes peuvent être utilisées pour examiner le rôle de voies de signalisation spécifiques dans l’activation des lymphocytes T chez les animaux infectés par le virus du Nil occidental, et elles réduisent considérablement le temps de performance à l’intérieur des installations de niveau de biosécurité trois. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’immunité cellulaire du virus N occidental, elle peut également être appliquée à d’autres agents pathogènes de niveau de biosécurité trois pour l’essai d’amorçage in vitro des cellules T. Commencez par isoler les cellules dendritiques spléniques de type sauvage C 57 black six A, mes souris D eight eight knock-out inoculées avec le virus du Nil occidental et contrôlez les animaux non infectés avec des billes magnétiques anti CD 11 C selon les instructions du fabricant.Ensuite, pour isoler les lymphocytes T, homogénéisez la rate disséquée à partir d’une souris OT deux avec les extrémités givrées de deux lames, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres, puis ajoutez du milieu RPMI à un volume final de 40 millilitres. Laissez les cellules se déposer pendant cinq minutes, puis transférez 30 millilitres du sup naissant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ensuite, utilisez un kit d’isolement de cellules T CD quatre positifs selon les instructions du fabricant pour trier les cellules T CD quatre positives, puis transférez les cellules collectées dans un tube conique de 50 millilitres suivi de deux lavages dans PBS Après le deuxième lavage, incubez les cellules dans PBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine à un moment donné cent des six cellules par millilitre et 0,5 micromolaire par millilitre de CFSE à 37 degrés Celsius protégés Après 10 minutes, incubez les cellules dans cinq millilitres de milieu froid et complet sur de la glace pendant cinq minutes.Ensuite, après un autre lavage PBS, fixez 0,2 fois 10 aux six cellules T CD quatre positives marquées CFSE dans 2 % de PFA et déterminez le niveau basal d’expression CFSE de la cellule T par cytométrie en flux. Suspendez à nouveau le reste des cellules marquées CFSE, incomplètes, moyennes, puis cultivez deux fois 10 à la fois 10 aux cinq cellules purifiées ou deux cellules T quatre CD positives seules ou avec deux fois 10 à la quatre cellules sauvages purifiées ou à mes huit dc knockout dans une plaque de 24 puits avec ou sans un microgramme par millilitre sur le résidu 3 23 3 39 dans un millilitre de milieu complet par puits à 37 degrés Celsius après cinq jours, récoltez les cellules et lavez-les deux fois en faits tamponnez et fixez les granulés dans 0,25 millilitres de 2 % PFA et vortex immédiatement les échantillons pour l’acquisition de données de cytométrie en flux. Double-cliquez sur le logiciel de cytométrie en flux et sélectionnez les canaux de zéro à 200 000 pour la diffusion vers l’avant et de zéro à 200 000 pour la diffusion latérale afin de générer un graphique de densité.Créez ensuite une porte sur les viviers pour analyser l’intensité fluorescente du CFSE. Ouvrez l’histogramme du canal FL one et acquérez 20 000 événements sur la population contrôlée. Ensuite, mettez en place un marqueur sur les échantillons pour l’OT : deux cellules cultivées seules.Acquérir des données pour la co-culture de cellules OT deux avec le type sauvage ou mes DC knock-out D huit de manière similaire pour le test de coloration des cytokines intracellulaires. Après avoir généré une suspension unicellulaire à partir de rates prélevées sur le virus du Nil occidental, les souris infectées comptent, aux moments appropriés, comptent les cellules, puis les diluent avec un milieu complet à une concentration de 2,5 fois celle de six cellules par millilitre. Ensuite, Eloqua un millilitre des cytes dans un tube micro centri de 1,5 millilitre.Et puis pour stimuler les huit lymphocytes T positifs, ajoutez 10 microlitres de peptides spécifiques occidentaux fraîchement dilués suivis d’un microlitre de feld. Dans une solution, mélangez soigneusement les suspensions de cellules, puis percez deux trous dans le capuchon du tube avec une aiguille de calibre 18 et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq heures. Après avoir transféré les cellules dans un nouveau micro tube de centrifugation et les avoir essorées après un lavage d’un millilitre de tampon de fax, remettre en suspension le deuxième granulé dans 120 microlitres de tampon de fax.Bloquez ensuite les sites de liaison non spécifiques avec le bloc FC et marquez les tubes avec les anticorps expérimentaux et de contrôle appropriés, comme indiqué dans le tableau. Ensuite, incubez les cellules dans un tampon de fixation et de perméation, puis transférez les cellules à un niveau de biosécurité en laboratoire pour un marquage avec des anticorps de contrôle ou des anticorps anti-interféron gamma selon le tableau. Pour mesurer la production de cytokines intracellulaires, mettez en place un diagramme de dispersion côte à côte comme nous venons de le démontrer, puis dirigez les cellules vivantes à l’aide des tubes de compensation pour ajuster les tensions si nécessaire.Créez un graphique à points pour afficher les données recueillies pour les cellules CD huit positives par rapport aux cellules positives à l’interféron gamma, puis un autre pour les cellules CD quatre positives par rapport aux cellules positives à l’interféron gamma positif et acquérez 50 000 événements pour la population contrôlée de chaque échantillon. Dans cette expérience, le nombre total de cellules C a été contrôlé pour déterminer le taux de prolifération des cellules T basales. En l’absence de co-culture avec les centres de développement.Lorsque les lymphocytes T ont été co-cultivés avec des DC isolés d’animaux infectés par le virus du Nil occidental, les lymphocytes T positifs au CFSE ont présenté une prolifération de 87 % de cellules T marquées par le CFSE La co-culture avec le DCS de mes souris knock-out D eight en présence de plus a montré un taux de prolifération de 74,5 %, suggérant que la déficience dans la voie de signalisation de mon D huit conduit à une capacité de présentation d’antigène altérée par le dcs pendant un West nul mutant infection virale. Les pourcentages de lymphocytes T spléniques, de CD, d’interféron gamma positif et de lymphocytes T positifs pour l’interféron gamma positif de CD, de 8 % et de 8 splen, isolés de souris de type sauvage infectées par le virus du Nil occidental, étaient respectivement de 0,4 % et de 1,7 %. Alors que les pourcentages de lymphocytes T spléniques doublement positifs isolés du virus du Nil occidental infectés par mes souris D huit knock-out n’étaient que de 0,2 % et 0,6 %, des analyses similaires ont été effectuées avec des cytes isolés de souris non infectées, sans qu’aucune différence n’ait été observée dans le pourcentage de lymphocytes T des populations doublement positives entre les deux groupes.De plus, les populations positives uniques des lymphocytes T DC quatre positifs et CD huit positifs des souris sauvages infectées représentaient 21 % et 13,3 % du total des cytes SP contrôlés, alors qu’il a été déterminé qu’elles ne représentaient que 15,9 % et 11,2 % des cytes SP knock-out par rapport aux groupes infectés, les réponses des lymphocytes T DC quatre positifs et CD huit positifs étaient réduites chez mes souris D huit knockout comparées au groupe de type sauvage au huitième jour après l’infection par le virus mutant de l’escargot de l’Ouest. En résumé, ma signalisation D eight est impliquée dans l’activation initiale des lymphocytes T des deux populations et contribue aux réponses positives des lymphocytes T CD quatre à un stade ultérieur de l’infection. La cytométrie de la grippe basée sur la primase des cellules T in vitro utilisant deux cellules T OT marquées au CFSE fournit une détermination plus précise du pourcentage de cellules T CD4 positives proliférantes avec une sensibilité globale considérablement améliorée par rapport aux protocoles standard actuels.Le tube de micro champ, ICS Math third, ne nécessite pas d’instruments spéciaux, ce qui offre à la fois un choix plus économique et plus flexible pour les chercheurs.

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