Haute résolution microscopie électronique de la Helicobacter pylori Cag sécrétion de type IV Système Pili Produit dans différentes conditions de Fer Disponibilité

La procédure visualise l’hyper production de CAG de type quatre système de sécrétion pii, qui se produit dans des conditions de limitation du fer d’abord culture h pylori dans des conditions de limitation du fer. La deuxième étape consiste à co-cultiver h pylori avec des cellules épithéliales gastriques. Ensuite, traitez les échantillons de co-culture pour la microscopie électronique à balayage.

En fin de compte, la microscopie électronique à balayage à haute résolution est utilisée pour montrer une augmentation de la production oculaire du système de sécrétion CAG de quatre dans des conditions de limitation en fer. La technique de ce manuscrit est importante pour les maladies liées à l’hpylori telles que le cancer gastrique, car le système de sécrétion CAG de type quatre est associé à un risque accru d’issues négatives de la maladie. Ainsi, une meilleure compréhension de la régulation de cette importante surface bactérienne.

Et l’avantage de la microscopie électronique à balayage à haute résolution par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie fluorescente est que la pilule de sécrétion individuelle de type quatre I peut être visualisée. Les personnes novices dans cette méthode de microscopie électronique ont des problèmes avec la procédure, en particulier la chimie humide car elle nécessite un timing minutieux et une main délicate sur le sang. Les plaques d’agar-gélose poussent.

H Pylori PMs, la bactérie S one et son mutant isogénique CAG e, qui n’a pas de système de sécrétion de type quatre fonctionnel. Inoculer des cultures et du bouillon Ella modifié complété par du cholestérol pour qu’il se développe pendant la nuit. Ensuite, ensemencez des cellules épithéliales gastriques humaines GS sur des lamelles de couverture traitées à la polylysine dans des plaques à 12 puits pour différentes conditions de disponibilité du fer.

Diluer le h pylori à une densité optique de 600 de 0,3 dans du bouillon de bru modifié seul. Milieu contenant 100 micromolaires de chlorure de fer, 200 micromolaires de chélateur de fer synthétique ou 200 micromolaires de culture de chlorure de fer. Pendant quatre heures, les échantillons centrifugent maintenant les bactéries à 1000 G et Resus suspend les granulés dans un volume égal de bouillon de bru modifié frais complété par du cholestérol.

Mesurez la densité bactérienne. Ensuite, infectez les cellules épithéliales avec le h pylori à une multiplicité d’infection de 20 à un. Effectuez des dilutions en série et placez les cellules bactériennes sur des plaques de gélose au sang.

Pour évaluer la viabilité des cellules bactériennes, placez les co-cultures dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures. Décantez le surnageant des co-cultures h pylori I et GS. Laver délicatement les cellules adhérentes trois fois avec un tampon de sodium de 0,05 molaire.

Fixez ensuite les échantillons pendant deux à quatre heures à température ambiante. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec un tampon de sodium de sodium de 0,05 molaire. Pour une fixation secondaire, ajoutez 0,1 % de tétroxyde d’osmium dans un tampon de sodium ca coate à 0,05 molaire en deux étapes de fixation séquentielles de 10 minutes.

Ensuite, après trois lavages, déshydratez les échantillons avec des concentrations accrues d’éthanol. Placez les échantillons dans un sécheur à points critiques, puis remplissez la chambre de dioxyde de carbone liquide. L’éthanol est purgé de la chambre et la chambre est à nouveau remplie de dioxyde de carbone liquide.

L’échantillon est ensuite transporté jusqu’au point critique de 31,1 degrés Celsius et 1073 PSI ; montez maintenant les cales de recouvrement sur des talons d’échantillons MEB en aluminium et peignez une fine ligne d’argent colloïdal sur le bord de l’échantillon pour la mise à la terre. Pendant l’imagerie MEB, à l’aide d’une machine à pulvérisation cathodique, enduire les échantillons de cinq nanomètres d’or et de palladium pour augmenter le signal électronique secondaire de l’échantillon et l’effet de bord. Examinez les échantillons à l’aide d’une image de microscope électronique à balayage à canon à émission de champ en mode vide poussé à une distance de travail de cinq à 10 millimètres.

Réglez la tension d’accélération à cinq kilovolts. Réglez ensuite la taille du spot sur deux à 2,5. Inclinez maintenant l’échantillon entre 15 et 25 degrés pour obtenir une meilleure vue de l’interface hôte-pathogène pour une visualisation à fort grossissement.

Privilégier l’imagerie des bactéries adhérentes aux bords des cellules épithéliales pour les bactéries réchauffant les PI enrichies en interactions hôte-pathogène. Ouvrez les fichiers de micrographie dans le logiciel image J. Identifiez les pi li lorsque des structures se forment entre la cellule bactérienne et la cellule hôte avec une largeur uniforme de 10 à 13 nanomètres et une longueur de 60 à 150 nanomètres.

Calibrez l’outil de mesure en traçant une ligne avec l’outil de ligne droite, puis en cliquant sur l’onglet Analyser dans le menu déroulant. Sélectionnez Définir l’échelle et entrez la valeur de la barre de grossissement sous la distance connue et réglez l’unité de longueur sur le nanomètre. Cliquez ensuite sur OK.

Utilisez maintenant un outil de ligne droite pour dessiner sur la longueur ou la largeur des pilotes, puis appuyez sur la commande M pour mesurer chaque pilote et enregistrer les valeurs mesurées dans un tableur. Utilisez les paramètres de longueur et de largeur précédemment établis pour ne pas tenir compte des caractéristiques qui ne correspondent pas au profil du système de sécrétion CAG de type quatre. Ensuite, quantifiez le nombre de PI I sur la base de valeurs qui se situent dans la plage, analysez statistiquement une quantification de la PI LI à l’aide d’un test T d’étudiant bilatéral.

Dans cette expérience, h pylori a été cultivé dans des conditions appauvries en fer à l’aide du chélateur synthétique dip parital à des concentrations qui n’inhibent pas significativement la croissance. Les bactéries ont produit de nombreux PII du système de sécrétion CAG de type quatre lors de la co-culture avec des cellules gastriques humaines. À l’inverse, lorsqu’une source exogène de fer nutritif est présente, la formation du système de sécrétion CAG de type quatre PII est réprimée.

La quantification de l’IIP à l’interface de l’agent pathogène de l’hôte révèle que dans des conditions de restriction en fer, h pylori présente une augmentation de deux fois dans le système de sécrétion de l’œil du système de sécrétion CAG quatre, le pourcentage de cellules empilées augmente de 11 % par rapport aux cellules cultivées dans le milieu seul. Il est intéressant de noter que, bien que l’activité du système de sécrétion CAG de type quatre, mesurée par la sécrétion IL huit de l’hôte, soit renforcée dans des conditions de restriction en fer et réprimée dans des conditions de disponibilité excessive de fer, les dimensions de PI LI restent cohérentes dans toutes les conditions de disponibilité du fer. Conformément à l’implication du système de sécrétion de CAG de type quatre, la disponibilité du fer ne modifie pas la biogenèse de PI LI à la surface d’un mutant CAG e après son développement.

Cette technique MEB a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du système de sécrétion CAG de type quatre pour explorer la localisation des protéines. En ce qui concerne les oreillers à système de sécrétion CAG de type quatre. Récemment, il a été découvert que la protéine effectrice CAG a se localise à l’extrémité de la pilule de sécrétion de type quatre.