Évaluer les interactions de leucocytes-endothélial dans des conditions d'écoulement dans un Ex Vivo Autoperfused Microflow Chambre Assay

L’objectif global de cette procédure est de créer un circuit fermé artérioveineux ex vivo pour évaluer les interactions leucocytaires avec les molécules d’adhésion endothéliale dans des conditions de flux physiologique. Pour ce faire, il suffit d’abord d’enduire une chambre de verre mince de la molécule d’adhésion endothéliale d’intérêt. Dans un deuxième temps, des tubes en polyéthylène et en silicone sont reliés à la chambre puis chirurgicalement à la souris.

Ensuite, le sang de l’artère carotide a pu circuler à travers le tube. Et les interactions ultérieures des leucocytes natifs avec la chambre en verre revêtu sont enregistrées en temps réel. En fin de compte, les effets de divers traitements sur le déplacement et la vitesse de roulement des leucocytes lorsqu’ils interagissent avec les molécules d’adhésion immobilisées peuvent être calculés au fil du temps.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes comme l’analyse procytométrique, est qu’avec cette technique, l’interaction des leucocytes avec les molécules endothéliales est évaluée dans des conditions d’écoulement physiologiques. La veille de l’expérience, connectez un centimètre de tube en polyéthylène PE 10 à un morceau de tube en silicone de six centimètres, suivi de cinq centimètres de tube en polyéthylène. Pour préparer la configuration de la tubulure pour la face jugulaire de l’animal pour la face carotide, connectez la tubulure comme cela vient d’être démontré avec l’ajout d’un TTU dans la tubulure en silicone de six centimètres, à environ 1,5 centimètre du tubulure en polyéthylène d’un centimètre.

Ensuite, connectez l’une des extrémités d’un tube en silicone de 10 centimètres au transducteur de pression et insérez l’extrémité T du tube en T du côté carotidien dans l’autre extrémité. Assurez-vous que les sites de connexion sont étanches et qu’ils ne fuient pas. Ensuite, utilisez une seringue d’un millilitre reliée à une aiguille de calibre 25 pour infuser chaque chambre de microflux avec la protéine de revêtement de surface endothéliale d’intérêt fraîchement préparée, et stockez les chambres revêtues dans un tube de 15 millilitres à quatre degrés Celsius pendant la nuit du lendemain.

Pour connecter le tube jugulaire et carotidien à la chambre de microflux, connectez un tube en silicone d’un centimètre de chaque côté de la chambre, puis scellez les connexions avec un petit morceau rectangulaire de paramètre tendu avec le tube et la chambre. À l’aide d’une seringue, remplissez la chambre et la tubulure avec 0,1 % d’albumine sérique bovine. Ensuite, après avoir vérifié l’absence de fuite, incubez dans la chambre pendant 45 minutes.

À température ambiante vers la fin de l’incubation, stabilisez la chambre de microflux sur une encoche jusqu’à la boîte de Pétri avec une petite goutte de silicone à chaque encoche. Connectez ensuite les tubes jugulaire et carotidien de chaque côté de la chambre. Ensuite, pendant que le silicone sèche, connectez une seringue verrouillable de 60 mil remplie d’héparine au transducteur de pression et faites passer 100 d’héparine de qualité USP à travers le tube et la chambre jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles d’air.

Avant de connecter la souris à la chambre à microflux, allumez l’ordinateur, le microscope et l’appareil d’enregistrement de pression approprié. Une fois le logiciel configuré, sécurisez une souris de 10 à 12 semaines. En position ventrale, faites une incision dans la région du cou avec des ciseaux, puis disséquez la glande thyroïde pour exposer la trachée et les vaisseaux.

Nettoyez l’artère carotide jusqu’à ce qu’elle soit complètement exposée. En prenant soin de ne pas endommager le nerf vague. Passez ensuite le pli d’un morceau de suture plié sous l’artère carotide et coupez la suture au niveau du coude.

Il y a donc deux morceaux de suture sous l’artère. Enroulez chaque suture en nœuds sans serrer, puis placez les sutures de la veine jugulaire gauche de la même manière. Lorsque les sutures jugulaires sont en place, injectez un millilitre d’héparine dans l’IP de la souris.

Après l’injection, resserrez la suture supérieure sur l’artère carotide et placez une pince de vaisseau aussi bas que possible sur la section exposée de l’artère. Utilisez une pince pour tenir l’artère par la suture supérieure, puis utilisez des micro-ciseaux fins pour faire une petite incision d’environ un huitième de la circonférence de l’artère près de la suture supérieure. Insérez maintenant le tube de l’artère carotide à l’aide d’un porte-tube à travers l’incision pratiquée dans l’artère et passez-le par la suture inférieure.

Attachez ensuite la suture inférieure puis la supérieure. Ainsi, l’artère est scellée autour du tube, faisant plusieurs nœuds pour assurer une étanchéité parfaite. Après avoir répété la même procédure pour le tube jugulaire, sans la pince de vaisseau, ouvrez temporairement la pince de vaisseau sur le tube de l’artère carotide pour tester l’écoulement.

S’il n’y a pas de fuites, déplacez la souris vers le microscope et connectez le tube de la veine carotide et de la veine jugulaire au tube de la chambre de microflux pour enregistrer la vitesse de roulement des leucocytes à travers la chambre de microflux. Relâchez complètement la pince carotidienne pour remplir la chambre. Laissez le sang circuler pendant trois à cinq minutes afin que les conditions d’écoulement se stabilisent.

Pendant ce temps, ajustez la platine du microscope de manière à ce que la chambre soit au niveau de l’objectif du microscope et que son bord soit parallèle à la fenêtre d’enregistrement vidéo à l’écran. Ensuite, construisez une boîte de Pétri avec de l’eau à température ambiante, puis abaissez l’objectif d’immersion dans l’eau 10 fois dans la boîte de manière à ce que les cellules qui circulent dans la chambre soient visibles, en ajustant l’intensité lumineuse comme il convient pour simuler une pression d’écoulement physiologique moyenne, ajustez la pince sur le tube pour que le transducteur lise une quantité constante de 30 millimètres de mercure. Appuyez ensuite sur start pour lancer l’enregistrement à la fois du trafic leucocytaire et de la pression avec le premier laps de temps près de l’extrémité jugulaire de la chambre et se déplaçant à contre-courant vers l’extrémité carotide jusqu’à ce qu’il soit terminé.

Lorsque l’enregistrement est terminé, fermez la valve au niveau du site d’entrée pour arrêter le flux sanguin et remplacez la chambre par une nouvelle chambre recouverte d’une molécule d’adhésion différente si vous le souhaitez. Lors de chaque enregistrement, seuls les leucocytes en interaction sont visibles à l’intérieur de la chambre. Par exemple, dans chacune de ces images, les pointes de flèches blanches indiquent des leucocytes individuels qui ont été capturés par la molécule d’adhésion d’intérêt et qui roulent le long de la chambre parmi les autres cellules à écoulement libre.

Dans le flux sanguin, un artefact commun à l’extérieur de la chambre peut être vu avec les grandes sphères sombres dans toutes les images, ce qui peut aider le spectateur à apprécier le mouvement des leucocytes par rapport à un point fixe. Le graphique illustre un graphique final des données. On a observé que le premier traitement expérimental diminuait la vitesse de roulement évidente sous la forme d’un décalage vers la gauche, et que le second traitement expérimental augmentait la vitesse apparaissant sous la forme d’un décalage vers la droite, tous deux par rapport à la vitesse de roulement de contrôle en combinaison avec cette procédure.

D’autres méthodes telles que le marquage du leucocyte et vivo x Viva peuvent être utilisées pour répondre à d’autres questions telles que la contribution de la progression de certains sous-types de leucocytes.