Fluorescence Basé Technique d'extension d'amorce pour déterminer transcription Points de départ et des sites de clivage de RNases In Vivo

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les points de départ transcriptionnels et les sites de clivage des ARN in vivo à partir de bactéries à l’aide d’une réaction d’extension d’amorce fluorescente. Ceci est accompli en cultivant d’abord des bactéries telles que e coli ou S aria, et en isolant les molécules d’ARN. Ensuite, l’ARN est transcrit inversement à l’aide d’amorces fluorescentes spécifiques et d’une transcriptase inverse, ce qui donne des fragments de CD NA.

Ensuite, l’ADN ou les plasmides sont isolés des cellules bactériennes, et une échelle de séquençage Sanger fluorescente est créée à partir de la matrice d’ADN à l’aide d’un kit de séquençage. Enfin, les fragments d’ADNC et les échelles de séquençage sont séparés et détectés simultanément sur un gel de poly acrylamide à l’aide d’un séquenceur de gel automatisé et comparés les uns aux autres. En fin de compte, l’extension d’amorce fluorescente est utilisée pour cartographier les cinq extrémités premières des molécules d’ARN jusqu’à une résolution de base.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que l’extension primaire basée sur la race ou la radioactivité est l’identification rapide des cinq extrémités des molécules d’ARN, car la détection se produit simultanément pendant l’électrophorèse. La sensibilité est similaire à celle des extensions primaires basées sur l’activité rouge, mais permet au personnel de laboratoire d’utiliser cette méthode sans avoir besoin d’une formation en radioprotection à l’activité nominale. Nous avons utilisé avec succès cette technique d’extension primaire fluorescente pour étudier les ARN composants des systèmes antitoxines des toxines.

Christopher Schuster, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir préparé un rendement élevé d’ARN et conçu des amorces selon le protocole de texte, effectuez la réaction d’extension de l’amorce en préchauffant d’abord le thermocycleur à 95 degrés Celsius. Pour chaque échantillon d’ARN, mélangez les composés suivants dans un tube PCR, dénaturez les échantillons pendant une minute à 95 degrés Celsius.

Placez ensuite les tubes sur de la glace pendant cinq minutes pour hybrider les amorces et l’ARN. Ensuite, réglez la machine PCR à 47 degrés Celsius. Préparez ensuite le master mix de transcription inverse comme décrit ici.

Ajoutez quatre microlitres, un mélange maître de transcription inverse à chaque échantillon d’ARN hybride et incubez les tubes pendant une heure à 47 degrés Celsius. Pour arrêter la réaction, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Ajoutez ensuite six microlitres de colorant de chargement d’amide de forme et stockez-le toute la nuit ou jusqu’à deux semaines dans l’obscurité à moins 20 degrés Celsius.

Après avoir préparé l’ADN génomique ou les plasmides, selon le protocole de texte, assemblez la réaction de séquençage de Sanger en mélangeant 12 microlitres d’environ 10 à 15 microgrammes d’ADN génomique ou 100 à 500 nanogrammes d’ADN plasmidique avec un microlitre d’amorce marquée par fluorescence et un microlitre de pipette DMSO. Un microlitre de chaque séquençage est mélangé dans des tubes PCR pré-étiquetés séparés. Ajoutez ensuite trois microlitres du mélange d’amorce D-N-A-D-M-S-O dans chaque tube.

Réglez la machine PCR sur le programme suivant et exécutez-la après avoir placé les échantillons dans la machine. Après le cycle, ajoutez six microlitres de colorant de chargement aux échantillons, puis sur de la glace. Si vous l’utilisez immédiatement ou à moins 20 degrés Celsius à long terme à l’aide de plaques de 25 centimètres propres et sans poussière, placez des entretoises de 0,25 millimètre sur la plaque de verre arrière et abaissez la plaque de verre crantée sur le dessus avec l’extrémité crantée des plaques de verre et les pilotes d’entrée de rail tous deux vers le haut.

Fixez les rails de gel des deux côtés des plaques de verre et serrez légèrement les boutons pour couler le gel. Combinez les composés énumérés ici dans un bécher avec une barre d’agitation et placez-les sur une plaque d’agitation magnétique. Immédiatement après avoir ajouté un PS et associé à l’aide d’une seringue de 50 millilitres pour prélever la solution d’acrylamide et placez un filtre de 0,45 nanomètre sur l’embout.

Placez les plaques sandwich à un angle de 10 à 20 degrés et distribuez lentement la solution de gel entre les plaques de verre tout en déplaçant continuellement l’embout de la seringue d’un côté à l’autre. Arrêtez de distribuer la solution de gel une fois qu’elle rencontre l’extrémité inférieure des plaques de verre. À l’aide d’un crochet à bulles, retirez les bulles qui auraient pu se former.

Ensuite, glissez l’entretoise de poche de gel entre les plaques de verre à l’extrémité crantée, en l’immergeant dans la solution de gel, et fixez-la en fixant légèrement la plaque de coulée, fixez les vis du rail supérieur et laissez le gel prendre pendant une à deux heures. Avant de retirer la plaque de coulée et l’entretoise de poche, utilisez de l’eau déminéralisée distillée pour nettoyer la poche des résidus de sel et de gel pour faire fonctionner le gel. Faites glisser le support du réservoir tampon dans les rails en gel sur les plaques de verre avant et serrez les boutons.

Placez le gel dans le réservoir de gel inférieur de l’imageur de gel automatisé contre la plaque chauffante et fixez-le en glissant le pilote d’entrée de rail dans les supports de l’appareil. Utilisez un tampon XTBE pour remplir les chambres de tampon de gel supérieure et inférieure. Fermez ensuite la chambre tampon inférieure et utilisez le cordon d’alimentation pour connecter la chambre tampon supérieure à l’alimentation.

S’il y a du sel dans la poche de gel, utilisez un tampon pour pipeter à plusieurs reprises dans la poche pour la nettoyer. Utilisez ensuite le couvercle du tampon supérieur pour fermer la chambre du réservoir tampon supérieur. Après avoir allumé l’imageur et l’ordinateur et démarré le logiciel de collecte de données IR de l’image de base conformément au protocole texte, utilisez les paramètres répertoriés ici pour configurer le contrôle du scanner.

Ensuite, pré-exécutez le gel vide pendant 20 minutes en sélectionnant voltage on et en appuyant sur Entrée. Pendant ce temps, à l’aide d’une machine PCR, chauffez l’échelle de séquençage et les produits d’extension d’amorce à 90 degrés Celsius pendant deux minutes Avant de refroidir sur de la glace, arrêtez l’électrophorèse, ouvrez le séquenceur de gel automatisé et retirez le couvercle supérieur du réservoir tampon. Insérez ensuite le peigne à dents de requin entre les plaques de verre et avec les dents de requin.

Percez légèrement la pipette à gel d’un à deux microlitres des produits d’extension d’amorce ou des réactions en échelle de séquençage dans chaque poche de gel. Pour toutes les poches vides. Utilisez un colorant de chargement pour les remplir afin d’éviter un comportement de fonctionnement incohérent, fermez le réservoir tampon et la porte du séquenceur de gel.

Démarrez ensuite l’électrophorèse en sélectionnant la tension activée pour le laser, sélectionnez l’état du balayage activé et appuyez sur Entrée. Une fois que la région d’intérêt a passé le laser, arrêtez l’électrophorèse comme indiqué ici. Une réaction d’extension d’amorce peut être utilisée pour déterminer les points de départ transcriptionnels ou TSP des transcrits d’intérêt et peut aider à déduire les régions promotrices.

Dans cet exemple, la TSP de l’ARNm MPE a été identifiée comme G, ce qui correspond aux données publiées précédemment. Les éléments promoteurs moins 35 et moins 10 ont été déduits comme étant T-T-G-T-A-A et T-A-G-A-C-T, et ces motifs ne diffèrent que par les bases de chacune de leurs séquences consensus en utilisant l’extension d’amorce pour identifier les produits de clivage de l’ARNm. La cartographie de l’ARN du clivage à proximité du START co on par l’ARN Ybi SEC deux est montrée ici lorsque les ARN ne sont pas présents ou inactifs, aucun produit d’extension d’amorce ne se forme à proximité du start co on à la suite de l’activité des ARN.

Cependant, deux bandes fortes apparaissent juste en aval de la couche de départ sur cette figure montre l’échec d’une expérience d’extension d’amorce en raison d’un excès d’ARN dans la réaction de transcription inverse qui empêche l’identification des bandes individuelles. Cela démontre que la quantité totale d’ARN matrice doit être ajustée à l’abondance de l’ARN d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élucider les points de départ transcriptionnels et les sites de clivage des ARN in vivo à l’aide d’amorces fluorescentes et d’un séquenceur de gel automatisé avec un peu de pratique.

Cette méthode est rapide et facile à réaliser. Bonne chance dans vos expériences.