Name: Fluorescence Basé Technique dextension damorce pour déterminer transcription Points de départ et des sites de clivage de RNases In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Découvrez une méthode d'extension d'amorce par fluorescence pour identifier les points de départ de la transcription et les sites de clivage de l'ARN chez les bactéries. Cette technique utilise un séquenceur de gel automatisé pour une détection haute résolution.

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Nous remercions Anne Wochele pour son aide en laboratoire et Vera Augsburger pour son aide avec le séquenceur de gel automatisé. Nous remercions la Deutsche Forschungsgemeinschaft pour le financement par les subventions BE4038/2 et BE4038/5 dans le cadre des « programmes prioritaires » SPP1316 et SPP1617.

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<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
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<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer qui pourrait présenter un conflit d’intérêts.

Extension d&#39;amorce fluorescente est une méthode simple et rapide pour déterminer les extrémités 5 &#39;des ARN, soit pour TSP ou l&#39;identification de la transformation secondaire de l&#39;ARN. Grâce à l&#39;utilisation d&#39;amorces fluorescentes, les réactions peuvent être mises en place et fonctionnent sans précautions de sécurité supplémentaires (contrairement au cas des amorces marquées de manière radioactive). Étant donné que les échantillons sont détectés par fluorescence, ils peuvent être visualisés pendan...

Une extension d'amorce est une méthode moléculaire pour déterminer les extrémités 5 'des molécules d'ARN spécifiques à une résolution d'une base. L'avantage à d'autres méthodes telles que 5'-RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc) est le délai d'exécution rapide et la capacité d'analyser facilement un mélange de différentes longueurs de molécules d'ARN. Cette méthode fonctionne en soumettant des molécules d'ARN à des réactions de transcription inverse en utilisant des amorces fluorescentes spécifiques, générant des fragments d'ADNc de certaines longueurs. Ces molécules d'ADNc sont longent les réactions de séquençage de Sanger traditionnels 2 sur des gels dénaturants de polyacrylamide et peuvent être détectés par leur fluorescence en raison de l'utilisation d'amorces marquées par fluorescence. Les longueurs des fragments d'ADNc sont ensuite évaluées par comparaison de l'échelle de séquençage, ce qui permet la mise en correspondance de l'extrémité 5 'de l'ARN. Traditionnellement, les réactions d'extension d'amorces sont utilisées en conjonctionavec des isotopes radioactifs pour détecter des molécules d'ADNc sur des films radiographiques. En raison de risques pour la santé, les problèmes d'élimination des déchets et la facilité de manipulation, des protocoles plus récents utilisent la fluorescence pour la détection de l'extension d'amorce avec des séquenceurs automatiques, mais leur sensibilité est légèrement inférieure. En utilisant des amorces marquées par fluorescence, la procédure récurrente de radio-étiquetage peut être omis, comme des amorces fluorescentes sont stables pendant une longue période (plus d'un an dans nos mains). La méthode que nous décrivons ici utilise un séquenceur automatisé de gel, mais avec de légères modifications, séquenceurs capillaires peut être également utilisée pour la séparation et la détection de l'ADNc 3. La nature de l'analyse parallèle de gel permet de détecter même une petite quantité de clivage de l'ARN ou de traitement. Un autre avantage est la haute résolution de cette méthode, comme clivage ou le traitement d'une seule base de la borne peut être détecté. En ce qui concerne la détection de clivage d'ARN ou de transformation, tabituellement deux différents types d'extensions d'amorces sont distingués. Dans un cas, le traitement enzymatique est effectué in vitro en utilisant l'ARN purifié et enzyme purifiée, alors que dans l'autre cas, le traitement est réalisé in vivo et l'ARN obtenu est purifié. Dans les deux cas, l'ARN est soumis à une extension d'amorce effectuée in vitro, cependant, en fonction de la source d'ARN, le procédé est appelé soit une extension d'amorce in vitro ou in vivo. Dans le protocole que nous présentons ici, nous nous concentrons uniquement sur ​​l'extension vivo en primaire, en raison de la facilité d'utilisation (pas de protéines purifiées nécessaire) et la possibilité de déterminer les points de départ de la transcription et de traitement dans le même temps. Cependant, in vitro extensions d'amorces sont en principe mis en place de la même manière et ce protocole peuvent servir de point de départ. Le procédé illustré ici peut être appliquée à de nombreuses espèces bactériennes tant qu'ils se prêtent à une grandepureté et à haut rendement de préparation d'acides nucléiques. La recherche dans notre laboratoire se concentre sur la portée réglementaire de la toxine-antitoxine (TA-systèmes) 4,5, un domaine dans lequel la méthode d'extension d'amorce est largement utilisé. AT-systèmes sont de petits éléments génétiques présents dans les génomes procaryotes qui sont constitués d'une protéine toxique et stable et actif de manière endogène une protéine ou un ARN essentiellement instable antitoxine qui neutralise la toxicité 6,7. l'activité de la toxine est parfois exercée par inhibition de la réplication, la synthèse de la paroi cellulaire ou d'autres mécanismes, mais le plus souvent par l'activité RNase 8,9. En général, la spécificité de la RNase est déterminée en effectuant des tests différents, dont l'un est le procédé d'extension d'amorce. Réactions d'extension d'amorce sont bien adaptés pour cette application, comme un mélange de fragments de longueur clivés et complètes peuvent être analysés simultanément pour déterminer leurs extrémités 5 '. Utilisation d'un mélange de in vitro et in vivo des extensions d'amorce, latoxine spécifique clivage RNase, par exemple, une spécificité de séquence peut être déterminée 10 à 13. <img alt="Extension d’amorce, isolement de l’ARN, synthèse d’ADNc, séquençage de Sanger, diagramme d’électrophorèse sur gel." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Vue d'ensemble de la procédure d'extension d'amorce. Les cultures bactériennes sont incubées et traitées selon les besoins expérimentaux. L'ARN total est extrait des cellules, traités à la DNase I pour éliminer les traces d'ADN et soumis à une réaction de transcription inverse en utilisant des amorces fluorescentes spécifiques des cibles d'ADN donnant des ADNc. L'ADN génomique ou de plasmides sont extraites et utilisées par la suite pour des réactions de séquençage de Sanger fluorescentes pour la comparaison de la taille des fragments d'ADNc. Produits d'extension d'amorce sont longent produits de séquençage Sanger sur un gel de polyacrylamide dénaturant urée et analysés avec un laser automatisé et microscope. La base de séquençage qui aligne avec la bande d'ADNc est laer but de l'extrémité 5 'de l'ADNc (flèche bleue). Plus d'informations dans Fekete, et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Une vue d'ensemble de l'ensemble de la procédure d'extension d'amorce se trouve dans la figure 1. En bref, les cellules bactériennes sont cultivées, récoltées, le culot de cellules lysées et l'ARN extrait. L'ARN purifié est ensuite traité avec de la DNase I pour éliminer les traces de molécules d'ADN qui pourraient agir en tant que modèles pour la transcriptase inverse. Des amorces fluorescentes spécifiques sont ajoutés à l'ARN, hybride à la région d'intérêt et inverser ensuite transcrit, résultant en un ADN complémentaire simple brin (ADNc). Une échelle de séquençage est réalisé par séquençage de Sanger traditionnel utilisant des amorces fluorescentes et séparé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à côté de l'extension des fragments d'ADNc d'amorces. La résultantegel est analysé par comparaison des bandes fluorescentes, permettant l'identification des extrémités 5 'd'intérêt. Points de départ de la transcription et des sites de traitement sont ensuite évaluées individuellement par des comparaisons de séquences.

<table><tbody><tr><td>AMV Transcriptase inverse (20-25 U/&micro ; l)</td><td>NEB / Roche</td><td>NEB : M0277-T / Roche : 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (sans RNase)</td><td>Ambion (technologies de la vie)</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrument&nbsp ;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Amorces marquées par fluorescence</td><td>Biomères</td><td>n/a</td><td>5' DY-681 modification de " ordinaire" oligonucléotides d’ADN. Des colorants compatibles tels que le LICOR IRDye 700/800 sont également disponibles auprès d’autres fournisseurs tels que IDTdna.</td></tr><tr><td>Séquenceur Li-Cor 4200 avec logiciel de collecte de données ImagIR</td><td>Produit</td><td></td><td>abandonné</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Ambion (technologies de la vie AM9915G</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mini kit de préparation de plasmide</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40 % Concentré</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>TAMPON DE STOCKAGE D’ARN</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternative : " Acide-phénol :Chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)" de Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull ; In RNase</td><td>Inhibitor Ambion (technologies de vie)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Kit de séquençage de cycle d’amorce marqué par fluorescence Thermo Sequenase avec 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reactive</td><td>technologies de vie</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Billes de zircone/silice 0,1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence basé technique d'extension d'amorce pour déterminer transcription points de départ et des sites de clivage de rnases in vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

L&#39;extension d&#39;amorce à base de fluorescence (FPE) est une méthode moléculaire pour déterminer les points de départ de la transcription ou des sites de traitement de molécules d&#39;ARN. Ce résultat est obtenu par transcription inverse de l&#39;ARN d&#39;intérêt en utilisant des amorces marquées par fluorescence spécifiques et l&#39;analyse ultérieure des fragments d&#39;ADNc obtenus par électrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide. En même temps, une réaction classique de séquençage de Sanger est exécuté sur le gel vers la carte les extrémités des fragments d&#39;ADNc à leurs bases correspondantes exactes. Contrairement à 5&#39;-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), où le produit doit être cloné et séquencé plusieurs candidats, la majeure partie des fragments d&#39;ADNc générés par extension d&#39;amorce peut être détecté simultanément en une seule opération de gel. En outre, l&#39;ensemble de la procédure (à partir de la transcription inverse de l&#39;analyse finale des résultats) peut être complété en une journée de travail. En utilisant des amorces marquées par fluorescence, l&#39;utilisation de réactifs dangereux isotope radioactif étiquetépeut être évitée et les délais de traitement sont réduites comme produits peuvent être détectés au cours de la procédure d&#39;électrophorèse. Dans le protocole suivant, nous décrivons une méthode d&#39;extension d&#39;amorce fluorescente in vivo pour détecter de manière fiable et rapide des extrémités 5 &#39;des ARN de déduire la transcription des points de départ et les sites de traitement de l&#39;ARN (par exemple, par les composants du système toxine-antitoxine) en S. aureus, E. coli et d&#39;autres bactéries.

Comme le montre la figure 6, une réaction d'extension d'amorce peut être utilisée pour déterminer les points de départ de la transcription de transcrits d'intérêt et peut aider à déduire régions promotrices (typiquement identifié par -10 et -35 éléments). La plus haute (la plus longue) représente un fragment d'ADNc de l'extrémité 5 de l'ARNm et peut donc être facilement mis en correspondance par rapport à l'échelle de séquençage. <img alt="Début de la transcription ompA, cliv...

Nous décrivons ici une méthode d’extension d’amorce basée sur la fluorescence pour déterminer les points de départ transcriptionnels à partir de transcrits bactériens et le traitement de l’ARN in vivo à l’aide d’un séquenceur de gel automatisé.

Fluorescence Basé Technique d'extension d'amorce pour déterminer transcription Points de départ et des sites de clivage de RNases In Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les points de départ transcriptionnels et les sites de clivage des ARN in vivo à partir de bactéries à l’aide d’une réaction d’extension d’amorce fluorescente. Ceci est accompli en cultivant d’abord des bactéries telles que e coli ou S aria, et en isolant les molécules d’ARN. Ensuite, l’ARN est transcrit inversement à l’aide d’amorces fluorescentes spécifiques et d’une transcriptase inverse, ce qui donne des fragments de CD NA.Ensuite, l’ADN ou les plasmides sont isolés des cellules bactériennes, et une échelle de séquençage Sanger fluorescente est créée à partir de la matrice d’ADN à l’aide d’un kit de séquençage. Enfin, les fragments d’ADNC et les échelles de séquençage sont séparés et détectés simultanément sur un gel de poly acrylamide à l’aide d’un séquenceur de gel automatisé et comparés les uns aux autres. En fin de compte, l’extension d’amorce fluorescente est utilisée pour cartographier les cinq extrémités premières des molécules d’ARN jusqu’à une résolution de base.Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que l’extension primaire basée sur la race ou la radioactivité est l’identification rapide des cinq extrémités des molécules d’ARN, car la détection se produit simultanément pendant l’électrophorèse. La sensibilité est similaire à celle des extensions primaires basées sur l’activité rouge, mais permet au personnel de laboratoire d’utiliser cette méthode sans avoir besoin d’une formation en radioprotection à l’activité nominale. Nous avons utilisé avec succès cette technique d’extension primaire fluorescente pour étudier les ARN composants des systèmes antitoxines des toxines.Christopher Schuster, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir préparé un rendement élevé d’ARN et conçu des amorces selon le protocole de texte, effectuez la réaction d’extension de l’amorce en préchauffant d’abord le thermocycleur à 95 degrés Celsius. Pour chaque échantillon d’ARN, mélangez les composés suivants dans un tube PCR, dénaturez les échantillons pendant une minute à 95 degrés Celsius.Placez ensuite les tubes sur de la glace pendant cinq minutes pour hybrider les amorces et l’ARN. Ensuite, réglez la machine PCR à 47 degrés Celsius. Préparez ensuite le master mix de transcription inverse comme décrit ici.Ajoutez quatre microlitres, un mélange maître de transcription inverse à chaque échantillon d’ARN hybride et incubez les tubes pendant une heure à 47 degrés Celsius. Pour arrêter la réaction, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Ajoutez ensuite six microlitres de colorant de chargement d’amide de forme et stockez-le toute la nuit ou jusqu’à deux semaines dans l’obscurité à moins 20 degrés Celsius.Après avoir préparé l’ADN génomique ou les plasmides, selon le protocole de texte, assemblez la réaction de séquençage de Sanger en mélangeant 12 microlitres d’environ 10 à 15 microgrammes d’ADN génomique ou 100 à 500 nanogrammes d’ADN plasmidique avec un microlitre d’amorce marquée par fluorescence et un microlitre de pipette DMSO. Un microlitre de chaque séquençage est mélangé dans des tubes PCR pré-étiquetés séparés. Ajoutez ensuite trois microlitres du mélange d’amorce D-N-A-D-M-S-O dans chaque tube.Réglez la machine PCR sur le programme suivant et exécutez-la après avoir placé les échantillons dans la machine. Après le cycle, ajoutez six microlitres de colorant de chargement aux échantillons, puis sur de la glace. Si vous l’utilisez immédiatement ou à moins 20 degrés Celsius à long terme à l’aide de plaques de 25 centimètres propres et sans poussière, placez des entretoises de 0,25 millimètre sur la plaque de verre arrière et abaissez la plaque de verre crantée sur le dessus avec l’extrémité crantée des plaques de verre et les pilotes d’entrée de rail tous deux vers le haut.Fixez les rails de gel des deux côtés des plaques de verre et serrez légèrement les boutons pour couler le gel. Combinez les composés énumérés ici dans un bécher avec une barre d’agitation et placez-les sur une plaque d’agitation magnétique. Immédiatement après avoir ajouté un PS et associé à l’aide d’une seringue de 50 millilitres pour prélever la solution d’acrylamide et placez un filtre de 0,45 nanomètre sur l’embout.Placez les plaques sandwich à un angle de 10 à 20 degrés et distribuez lentement la solution de gel entre les plaques de verre tout en déplaçant continuellement l’embout de la seringue d’un côté à l’autre. Arrêtez de distribuer la solution de gel une fois qu’elle rencontre l’extrémité inférieure des plaques de verre. À l’aide d’un crochet à bulles, retirez les bulles qui auraient pu se former.Ensuite, glissez l’entretoise de poche de gel entre les plaques de verre à l’extrémité crantée, en l’immergeant dans la solution de gel, et fixez-la en fixant légèrement la plaque de coulée, fixez les vis du rail supérieur et laissez le gel prendre pendant une à deux heures. Avant de retirer la plaque de coulée et l’entretoise de poche, utilisez de l’eau déminéralisée distillée pour nettoyer la poche des résidus de sel et de gel pour faire fonctionner le gel. Faites glisser le support du réservoir tampon dans les rails en gel sur les plaques de verre avant et serrez les boutons.Placez le gel dans le réservoir de gel inférieur de l’imageur de gel automatisé contre la plaque chauffante et fixez-le en glissant le pilote d’entrée de rail dans les supports de l’appareil. Utilisez un tampon XTBE pour remplir les chambres de tampon de gel supérieure et inférieure. Fermez ensuite la chambre tampon inférieure et utilisez le cordon d’alimentation pour connecter la chambre tampon supérieure à l’alimentation.S’il y a du sel dans la poche de gel, utilisez un tampon pour pipeter à plusieurs reprises dans la poche pour la nettoyer. Utilisez ensuite le couvercle du tampon supérieur pour fermer la chambre du réservoir tampon supérieur. Après avoir allumé l’imageur et l’ordinateur et démarré le logiciel de collecte de données IR de l’image de base conformément au protocole texte, utilisez les paramètres répertoriés ici pour configurer le contrôle du scanner.Ensuite, pré-exécutez le gel vide pendant 20 minutes en sélectionnant voltage on et en appuyant sur Entrée. Pendant ce temps, à l’aide d’une machine PCR, chauffez l’échelle de séquençage et les produits d’extension d’amorce à 90 degrés Celsius pendant deux minutes Avant de refroidir sur de la glace, arrêtez l’électrophorèse, ouvrez le séquenceur de gel automatisé et retirez le couvercle supérieur du réservoir tampon. Insérez ensuite le peigne à dents de requin entre les plaques de verre et avec les dents de requin.Percez légèrement la pipette à gel d’un à deux microlitres des produits d’extension d’amorce ou des réactions en échelle de séquençage dans chaque poche de gel. Pour toutes les poches vides. Utilisez un colorant de chargement pour les remplir afin d’éviter un comportement de fonctionnement incohérent, fermez le réservoir tampon et la porte du séquenceur de gel.Démarrez ensuite l’électrophorèse en sélectionnant la tension activée pour le laser, sélectionnez l’état du balayage activé et appuyez sur Entrée. Une fois que la région d’intérêt a passé le laser, arrêtez l’électrophorèse comme indiqué ici. Une réaction d’extension d’amorce peut être utilisée pour déterminer les points de départ transcriptionnels ou TSP des transcrits d’intérêt et peut aider à déduire les régions promotrices.Dans cet exemple, la TSP de l’ARNm MPE a été identifiée comme G, ce qui correspond aux données publiées précédemment. Les éléments promoteurs moins 35 et moins 10 ont été déduits comme étant T-T-G-T-A-A et T-A-G-A-C-T, et ces motifs ne diffèrent que par les bases de chacune de leurs séquences consensus en utilisant l’extension d’amorce pour identifier les produits de clivage de l’ARNm. La cartographie de l’ARN du clivage à proximité du START co on par l’ARN Ybi SEC deux est montrée ici lorsque les ARN ne sont pas présents ou inactifs, aucun produit d’extension d’amorce ne se forme à proximité du start co on à la suite de l’activité des ARN.Cependant, deux bandes fortes apparaissent juste en aval de la couche de départ sur cette figure montre l’échec d’une expérience d’extension d’amorce en raison d’un excès d’ARN dans la réaction de transcription inverse qui empêche l’identification des bandes individuelles. Cela démontre que la quantité totale d’ARN matrice doit être ajustée à l’abondance de l’ARN d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élucider les points de départ transcriptionnels et les sites de clivage des ARN in vivo à l’aide d’amorces fluorescentes et d’un séquenceur de gel automatisé avec un peu de pratique.Cette méthode est rapide et facile à réaliser. Bonne chance dans vos expériences.

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